趙 昱,宋 揚,洪廣輝,李軼聰*

(1.解放軍第二一一醫(yī)院 麻醉科,黑龍江 哈爾濱150080；2.佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯154000)

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芍藥苷通過抑制脊髓CC趨化因子配體2拮抗嗎啡鎮(zhèn)痛耐受

趙 昱1,宋 揚2,洪廣輝1,李軼聰1*

(1.解放軍第二一一醫(yī)院 麻醉科,黑龍江 哈爾濱150080；2.佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯154000)

目的 探討脊髓CC趨化因子配體2(CCL2)在芍藥苷拮抗大鼠慢性嗎啡鎮(zhèn)痛耐受中的作用。方法 成功鞘內(nèi)置管清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，隨機分為4組(n=15)：生理鹽水組(NS組)，嗎啡組(MOR組)，芍藥苷組(PF組)和嗎啡+芍藥苷組(MOR+PF組)。連續(xù)7 d鞘內(nèi)注射15μg嗎啡建立慢性嗎啡耐受的動物模型。應(yīng)用甩尾潛伏期法(tail flick latency,TFL)及機械反射閾值法(mechanical withdrawal threshold,MWT)觀察鞘內(nèi)注射芍藥苷對嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的影響；應(yīng)用免疫組織熒光染色法檢測芍藥苷對腰段脊髓小膠質(zhì)細胞活化的影響；應(yīng)用免疫印跡法(Western blot)檢測芍藥苷對腰段脊髓CCL2表達的影響。結(jié)果 連續(xù)7 d鞘內(nèi)注射嗎啡后，與NS組比較，MOR組大鼠腰段脊髓背角小膠質(zhì)細胞顯著增多，腰段脊髓CCL2表達顯著增加(P<0.05)；而與MOR組比較，MOR+PF組大鼠腰段脊髓背角小膠質(zhì)細胞顯著減少，腰段脊髓CCL2表達顯著減少(P<0.05)。與MOR組大鼠最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)百分率(percent of maximal possible potential effect,MPE)比較，MOR+PF組大鼠%MPE顯著增加(TFL：19%±4% vs 41%±3%；MWT：18%±6% vs 42%±4%，P<0.05)。結(jié)論 芍藥苷可能通過抑制脊髓內(nèi)CCL2表達增加拮抗大鼠慢性嗎啡鎮(zhèn)痛耐受。

嗎啡鎮(zhèn)痛耐受；芍藥苷；CCL2；脊髓

(ChinJLabDiagn,2016,20:1822)

嗎啡是臨床上緩解重度疼痛及治療癌性疼痛最常用的鎮(zhèn)痛藥物，但長期給予嗎啡會出現(xiàn)鎮(zhèn)痛效能降低，需要不斷加大嗎啡使用劑量的現(xiàn)象被稱為嗎啡的鎮(zhèn)痛耐受。鎮(zhèn)痛耐受的出現(xiàn)會導(dǎo)致惡心、嘔吐、便秘、呼吸抑制等不良反應(yīng)發(fā)生率增加，因此對其機制的研究就更具臨床意義。已經(jīng)證實嗎啡導(dǎo)致的膠質(zhì)細胞激活在嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的產(chǎn)生過程中發(fā)揮重要作用[1]。脊髓CC趨化因子配體2[chemokine (C-C motif) ligand 2,CCL2]作為分泌型的小分子量蛋白質(zhì)可以誘導(dǎo)免疫細胞向炎癥發(fā)生部位遷移。體外研究發(fā)現(xiàn)[2]，嗎啡可以刺激原代培養(yǎng)神經(jīng)元分泌CCL2；在體研究發(fā)現(xiàn)[3]，大鼠鞘內(nèi)注射嗎啡可以增加脊髓神經(jīng)元分泌CCL2，并導(dǎo)致脊髓小膠質(zhì)細胞激活，而同時注射CCL2中和抗體能抑制小膠質(zhì)細胞激活并拮抗嗎啡鎮(zhèn)痛耐受。另有研究發(fā)現(xiàn)[4]，小鼠鞘內(nèi)注射CCL2能激活脊髓小膠質(zhì)細胞，并劑量依賴性地誘發(fā)機械性痛敏，而同時注射CCL2中和抗體能抑制小膠質(zhì)細胞激活并減少機械性痛敏的發(fā)生。因此我們推測脊髓CCL2可能介導(dǎo)了嗎啡耐受過程，但其具體作用仍有待證實。

芍藥苷(Paeoniflorin,PF)是一種從芍藥根部提取的單萜糖苷，具有抗炎、抗氧化等多種功能，并對小膠質(zhì)細胞具有免疫調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)[5]，芍藥苷可以減輕脂多糖激活的原代小膠質(zhì)細胞釋放促炎癥細胞因子。另有研究發(fā)現(xiàn)[6]，芍藥苷還可以通過抑制嗎啡誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞激活，從而減輕嗎啡鎮(zhèn)痛耐受，但其具體機制仍有待闡明。為此，本文通過鞘內(nèi)連續(xù)注射嗎啡建立嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的在體模型，觀察芍藥苷對嗎啡鎮(zhèn)痛耐受及對大鼠脊髓CCL2表達的影響，探討芍藥苷是否通過抑制脊髓CCL2表達拮抗大鼠慢性嗎啡鎮(zhèn)痛耐受，旨在為芍藥苷治療嗎啡鎮(zhèn)痛耐受提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 體重(200±10)g清潔級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。飼養(yǎng)環(huán)境：維持光照周期為12 h、溫度為(23±1)℃，自由進食水。所有操作和動物處理均遵循國家衛(wèi)生機構(gòu)制定的實驗室動物指南。

1.1.2 藥品與試劑 鹽酸嗎啡(沈陽第一制藥廠)；芍藥苷(Sigma公司，美國)；IBA-1兔多克隆抗體(1∶400,Wako，日本)；熒光素標記羊抗兔二抗(1∶1 000，Millipore，美國)；CCL2小鼠單克隆抗體(1∶1 000，Millipore，美國)；β-Tubulin兔多克隆抗體(1∶1 000，Abcam，英國)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 成功鞘內(nèi)置管SD大鼠60只，隨機分為4組(每組15只)： ①生理鹽水組(NS組)；②嗎啡組(MOR組)；③芍藥苷組(PF組)；④嗎啡+芍藥苷組(MOR+PF組)。NS組連續(xù)7 d鞘內(nèi)注射生理鹽水(20 μl)；MOR組連續(xù)7 d鞘內(nèi)注射15 μg嗎啡(20 μl)；PF組連續(xù)7 d鞘內(nèi)給予40 μg芍藥苷(20 μl)；MOR+PF組連續(xù)7 d鞘內(nèi)注射嗎啡及芍藥苷(15 μg嗎啡+40 μg芍藥苷)。于鞘內(nèi)注射1、3、5、7 d測量行為學(xué)，行為學(xué)測量完畢斷頭處死大鼠行Western Blot測定腰段脊髓CCL2表達，行免疫組織熒光染色法檢測腰段脊髓小膠質(zhì)細胞活化情況。

1.2.2 大鼠鞘內(nèi)置管術(shù) 戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉。髂嵴連線定位L5椎體，正中切開L4-L6背部皮膚，鈍性分離椎旁肌，鉗去L6椎體部分脊突以充分暴露L5-6椎間隙，將帶管芯的Microspinal導(dǎo)管傾斜60°角插入第5腰椎間隙，大鼠尾部或后肢突然出現(xiàn)抽動表明管芯進入蛛網(wǎng)膜下腔。將導(dǎo)管向頭端方向插入2.5 cm后固定，封閉導(dǎo)管外口后逐層縫合肌肉與皮膚。鞘內(nèi)置管恢復(fù)3 d后，通過鞘內(nèi)注射2%利多卡因10 μl驗證置管是否成功，雙后肢出現(xiàn)短暫癱瘓判定為鞘內(nèi)置管成功，否則為失敗。鞘內(nèi)置管失敗及置管后出現(xiàn)后肢或尾部癱瘓、運動功能障礙的動物從實驗中排除并立即注射過量戊巴比妥鈉處死。斷頭取材時觀察導(dǎo)管位置，導(dǎo)管末端位置不正確的大鼠行為學(xué)數(shù)據(jù)從該組中排除。

1.2.3 行為學(xué)測試 甩尾潛伏期法(tail flick latency,TFL)：鞘內(nèi)注射30 min后，秒表記錄大鼠熱水甩尾潛伏期(s)，即從大鼠尾部進入(50±0.2)℃熱水到開始甩尾的時間。注射前為基礎(chǔ)甩尾潛伏期(basal tail flick latency，BL)，注射后為實驗甩尾潛伏期(test tail flick latency，TL)。設(shè)定動物尾部在熱水中停留最長時間為15 s(cut-off time)，以防對尾部造成損傷。間隔2 min，連續(xù)測定3次。將3次潛伏期的平均值確定為痛閾值。將基礎(chǔ)閾值超過5 s的動物從實驗中排除。MPE=(TL-BL)/(cut off-time-BL)×100%。

機械縮足反射閾值法(mechanical withdrawal threshold,MWT)：有機玻璃箱(22 cm×12 cm×22 cm)置于金屬篩網(wǎng)上，待大鼠適應(yīng)15 min后，用von Frey纖維絲垂直刺激大鼠后肢足底中部，持續(xù)時間≤4 s，大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為定義為陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。從2 g開始測定，當該力度的刺激不足以引起陽性反應(yīng)，則給予相鄰大一級力度的刺激;如出現(xiàn)陽性反應(yīng)則給予相鄰小一級力度的刺激，直至出現(xiàn)第一次陽性和陰性反應(yīng)的騎跨，每次刺激間隔30 s，連續(xù)測定4次。最大力度為15 g，大于此值時記為15 g，以防造成組織損傷。

以MPE TFL和MPE MWT做為行為學(xué)結(jié)果比較的統(tǒng)計值。

1.2.4 Western Blot 戊巴比妥鈉腹腔注射深麻醉后斷頭處死大鼠(n=4)，迅速分離腰段脊髓(L4-L6 節(jié)段)組織，液氮速凍后-80℃深低溫冰箱保存。提取蛋白時，將組織放入2 ml勻漿器中，按1 ml/100 mg比例加入預(yù)冷的蛋白提取液(KeyGEN全蛋白提取試劑盒)，充分勻漿后冰上裂解15 min，轉(zhuǎn)移至潔凈EP管后4℃12 000rpm離心15 min取上清液即為蛋白提取液。用BCA(bicinchoninic acid)蛋白質(zhì)測定試劑盒(美國Peirece公司)進行蛋白定量。配制12% SDS-PAGE凝膠，每個泳道上樣量均為100 μg，120 V恒壓電泳70 min，待溴酚藍染料到達凝膠底部時停止電泳。80 V恒壓濕法轉(zhuǎn)膜80 min，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至0.45 μm孔徑PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜后使用封閉液室溫封閉1h，一抗(CCL2 1∶1 000，β-Tubulin 1∶1 000)4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記種屬特異性二抗(1∶5 000)室溫搖床孵育1 h，使用ECL化學(xué)發(fā)光液于熒光和可見光凝膠成像系統(tǒng)(Alpha Innotech)顯影并進行條帶灰度分析，通過計算目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參照蛋白條帶灰度值的比值，半定量分析目的蛋白表達情況。

1.2.5 免疫組織熒光染色 行為學(xué)測定結(jié)束后，戊巴比妥鈉腹腔注射深麻醉后斷頭處死大鼠(n=3)。用預(yù)冷的生理鹽水 100 ml 和 4%多聚甲醛 400 ml 經(jīng)左心室灌注固定。將腰段脊髓 ( L4-L6 ) 即腰膨大取出，4%多聚甲醛后固定 2 h 后置入蔗糖溶液梯度脫水。 冰凍切片機(LEICA)切片(片厚 12 μm)。IBA-1兔多克隆抗體( 1∶400,Wako，日本) 4℃孵育過夜，熒光素標記羊抗兔二抗( 1∶1 000，Millipore，美國) 37℃避光孵育1 h，各步驟間用 PBS 沖洗3次，5 min/次，50%甘油封片后熒光顯微鏡拍片，并用 Image pro-Plus 6.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS13.0軟件對本實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，使用SNK(Student-Newman-Keuls)檢驗進行組間兩兩比較，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芍藥苷對嗎啡鎮(zhèn)痛耐受形成的影響

MOR組和MOR+PF組在嗎啡注射1 d時均產(chǎn)生了最大鎮(zhèn)痛作用，兩組的鎮(zhèn)痛作用比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(Fig.1，P>0.05)。注射嗎啡3 d時MOR組大鼠開始出現(xiàn)鎮(zhèn)痛耐受，至7 d時形成明顯耐受。與之比較，MOR+PF組大鼠接受嗎啡注射后5 d和7 d仍可以產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛作用，兩組嗎啡鎮(zhèn)痛作用差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。PF組與NS組比較MPE差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

Fig.1 Effects of Paeoniflorin on the tolerance to morphine analgesia(n=8)

2.2 芍藥苷抑制大鼠腰段脊髓背角小膠質(zhì)細胞活化

圖2顯示，與NS組比較，注射嗎啡7 d后，MOR組小膠質(zhì)細胞標記物IBA-1在大鼠腰段脊髓背角表達顯著增加(P<0.05)。與MOR組比較，MOR+PF組大鼠在鞘內(nèi)注射7 d后腰段脊髓背角IBA-1表達顯著減少(P<0.05)。NS組與PF組大鼠腰段脊髓背角IBA-1表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 芍藥苷下調(diào)腰段脊髓CCL2表達

圖3顯示，與NS組比較，注射嗎啡7 d后，MOR組大鼠腰段脊髓CCL2表達顯著增加(P<0.05)。與MOR組比較，MOR+PF組大鼠在鞘內(nèi)注射7 d后腰段脊髓CCL2表達顯著減少(P<0.05)。NS組與PF組大鼠腰段脊髓CCL2表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

Fig.2 Paeoniflorin suppressed morphine-induced microglia activation in the spinal cord(n=3)

A:Microglia in spinal cord immunostained with an IBA-1 antibody; B:Integrated density of microglia immunofluorescence in spinal cord.aP<0.05 vs NS group;bP<0.05 vs MOR group.Bar=200 μm

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，嗎啡可以通過神經(jīng)元表面的嗎啡受體和小膠質(zhì)細胞表面的TLR4(toll-like receptor 4)受體等間接或直接引起脊髓背角小膠質(zhì)細胞的顯著活化，導(dǎo)致嗎啡鎮(zhèn)痛效果降低[7]。CCL2與它的特異性受體CCR2廣泛表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在多發(fā)性硬化癥及腦損傷等疾病過程中表達會顯著增加[8,9]。體外研究發(fā)現(xiàn)[2]，嗎啡可以刺激原代培養(yǎng)神經(jīng)元分泌CCL2。本研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)鞘內(nèi)注射嗎啡7天后，腰段脊髓CCL2表達顯著上調(diào)，大鼠腰段脊髓背角小膠質(zhì)細胞顯著增多，這與Zhao等[3]研究結(jié)果相一致，且他們還證實CCL2中和抗體可以拮抗嗎啡鎮(zhèn)痛耐受，這些結(jié)果證實CCL2介導(dǎo)了嗎啡耐受過程。膠質(zhì)細胞激活在嗎啡鎮(zhèn)痛耐受形成中的作用越來越受到人們的關(guān)注。研究證實[10]，小膠質(zhì)細胞激活后可以進入經(jīng)典的M1狀態(tài)及選擇性激活的M2狀態(tài)，M1狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞可以產(chǎn)生大量促炎癥細胞因子，發(fā)揮有害作用；而M2狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞可以分泌抗炎因子及神經(jīng)營養(yǎng)素，發(fā)揮有益作用。鞘內(nèi)注射嗎啡導(dǎo)致的脊髓背角神經(jīng)元分泌CCL2增多，可能通過誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞激活進入M1狀態(tài)，從而誘發(fā)嗎啡鎮(zhèn)痛耐受。本研究發(fā)現(xiàn)，PF組與NS組比較MPE差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，提示芍藥苷抑制嗎啡耐受形成并非通過增強鎮(zhèn)痛作用來達到的。腰段脊髓CCL2表達上調(diào)與小膠質(zhì)細胞的激活存在時間上的一致性，而鞘內(nèi)注射芍藥苷可以拮抗這一現(xiàn)象。這些結(jié)果提示，芍藥苷可能正是通過抑制大鼠慢性嗎啡鎮(zhèn)痛耐受形成中CCL2表達上調(diào)從而拮抗嗎啡鎮(zhèn)痛耐受形成。

Fig.3 Paeoniflorin down-regulated the expression of CCL2 in the spinal cord in rats(n=4)

A:Representative Western blot bands;B:The bar graph shows quantification of the Western blot analysis for CCL2 protein.aP<0.05 vs NS group;bP<0.05 vs MOR group

至今尚未能完全闡明注射嗎啡導(dǎo)致脊髓背角小膠質(zhì)細胞激活的具體機制。Zhao等[3]研究發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)注射嗎啡可以導(dǎo)致脊髓背角神經(jīng)元CCL2表達增加，但雙重免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，CCL2與神經(jīng)元標記物NEUN共表達，而與小膠質(zhì)細胞標志物OX-42無共表達，提示CCL2可能并非直接作用于脊髓背角小膠質(zhì)細胞導(dǎo)致其活化。有研究發(fā)現(xiàn)[11,12]，在嗎啡鎮(zhèn)痛耐受過程中絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,MAPK)可能介導(dǎo)了脊髓小膠質(zhì)細胞激活。已有研究證實[13]，在小膠質(zhì)細胞激活過程中CCL2與MAPK通路存在直接聯(lián)系。p38 MAPK 抑制劑 SB203580可以顯著抑制嗎啡導(dǎo)致的小膠質(zhì)細胞活化及炎癥因子釋放[14]。Yang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，CCL2還可以通過細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK )和p38 MAPK通路刺激人主動脈平滑肌細胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶- 9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)。因此可以推測，鞘內(nèi)注射嗎啡可能是通過刺激脊髓背角神經(jīng)元分泌CCL2，從而激活MAPK通路導(dǎo)致脊髓背角小膠質(zhì)細胞活化。本實驗未檢測背根神經(jīng)節(jié)中CCL2表達情況，不能排除CCL2表達增加來源于背根神經(jīng)節(jié)的可能，這將有待進一步探討。

綜上所述，CCL2介導(dǎo)了嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的發(fā)生，其活化小膠質(zhì)細胞的作用可能是通過激活下游靶分子實現(xiàn)的，芍藥苷通過抑制脊髓CCL2表達從而拮抗嗎啡鎮(zhèn)痛耐受形成。本文為進一步闡明嗎啡鎮(zhèn)痛耐受機制提供了新穎的實驗資料，為防治嗎啡鎮(zhèn)痛耐受提供了新的藥物選擇。

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Paeoniflorin attenuates morphine antinociceptive tolerance through suppressing spinal CCL2 up-regulation

ZHAOYu1,SONGYang2,HONGGuang-hui1,etal.

(1.DepartmentofAnesthesioloy,the211HospitalofPLA,Harbin150080,China;2.JiamusiUniversityClinicalMedicineCollege,Jiamusi154000,China)

Objective To investigate the role of spinal CCL2 in attenuation of chronic morphine antinociceptive tolerance by Paeoniflorin(PF).Methods Sixty male Sprague-Dawley rats with successful intrathecal catheter were randomly divided into four groups(n=15):Saline group(NS); Morphine group(MOR); Paeoniflorin group(PF); Morphine plus Paeoniflorin group(MOR+PF).A morphine tolerance model of rats was induced by intrathecal injection of morphine 15 μg once daily for 7 consecutive days.The effect of Paeoniflorin on morphine antinociceptive tolerance was explored by MPE TFL and MPE MWT.Immunohistochemistry assay was applied to detect the expression of IBA-1.Western blot was used to evaluate the change of spinal CCL2 expression.Results After 7 d of repeated intrathecal injection of morphine,the expressions of IBA-1 and CCL2 in MOR group were significantly up-regulated as compared with NS group(P<0.05),While the expressions of IBA-1 and CCL2 in MOR+PF group were significantly down-regulated as compared with MOR group(P<0.05).On day 7 after intrathecal injection of morphine,%MPE TFL was significantly increased in MOR+PF group as compared with MOR group (TFL:19%±4% vs 41%±3%; MWT:18%±6% vs 42%±4%,P<0.05).Conclusion Paeoniflorin may attenuate chronic morphine antinociceptive tolerance through Inhibition of spinal CCL2 up-regulation.

Morphine antinociceptive tolerance;Paeoniflorin; chemokine (C-C motif) ligand 2;Spinal cord

全軍醫(yī)學(xué)科技“十二五”科研課題(CWS11J006)

1007-4287(2016)11-1822-06

R614

A

2016-04-17)

*通訊作者