盛敏佳，薛麗娟，王立巖*，郝筱詩(shī)，劉玉萍

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130033；2.吉林大學(xué)第一臨床醫(yī)院)

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*通訊作者

卵巢癌抗原沖擊DC在體外對(duì)SKOV3細(xì)胞作用的研究

盛敏佳1，薛麗娟2，王立巖1*，郝筱詩(shī)1，劉玉萍1

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130033；2.吉林大學(xué)第一臨床醫(yī)院)

目的 探討卵巢癌患者外周血和腹水中培養(yǎng)的樹(shù)突細(xì)胞(DC)在體外激活淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)作用，及其對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的殺傷作用。方法 分別培養(yǎng)卵巢癌患者外周血及腹水來(lái)源DC，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞表面分子表達(dá)檢測(cè)；以卵巢癌凍融抗原致敏DC，檢測(cè)兩種來(lái)源DC刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力及對(duì)IL-2水平的影響；檢測(cè)抗原負(fù)載DC與T細(xì)胞誘導(dǎo)CTL對(duì)卵巢癌細(xì)胞的殺傷作用。結(jié)果 鏡下顯示卵巢癌患者外周血及腹水來(lái)源的DC形態(tài)學(xué)無(wú)明顯差異，腹水來(lái)源DC成熟時(shí)間較外周血來(lái)源DC晚，二者表面分子表達(dá)的陽(yáng)性率除CD83外無(wú)明顯差異；卵巢癌凍融抗原負(fù)載DC上調(diào)其表面相關(guān)分化抗原表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異具有顯著性(P<0.05)；經(jīng)卵巢癌凍融抗原負(fù)載后的DC刺激T淋巴細(xì)胞的增殖，差異有顯著性(P<0.05)，但兩種來(lái)源DC間刺激指數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；抗原負(fù)載DC與無(wú)抗原負(fù)載DC相比，其上清中IL-12濃度增高，差異具有顯著性(P<0.05)；負(fù)載與不負(fù)載抗原的DC對(duì)卵巢癌細(xì)胞殺傷作用增強(qiáng)，與對(duì)照組相比具有顯著性差異(P<0.05)，隨著效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量的增高，殺傷作用增強(qiáng)，加入IL-2增強(qiáng)其殺傷作用，但外周血及腹水來(lái)源DC間相應(yīng)情況下對(duì)卵巢癌細(xì)胞的殺傷作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論 卵巢癌患者外周血及腹水來(lái)源的DC均具有誘導(dǎo)CTL作用，DC作為載體負(fù)載腫瘤抗原后可以激發(fā)T淋巴細(xì)胞形成CTL，在體外有效的殺傷卵巢癌SKOV3細(xì)胞。

卵巢癌；樹(shù)突細(xì)胞；細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞；白細(xì)胞介素-2；殺傷作用

(ChinJLabDiagn,2016,20:1811)

卵巢癌是婦科惡性腫瘤患者死亡的首要原因之一，5年生存率較低，近年來(lái)生物治療成為卵巢癌患者治療的重要手段。樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)在抗原提呈及激活淋巴細(xì)胞使其成為腫瘤特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)方面起著重要作用。目前研究證實(shí)，DC可由外周血單核細(xì)胞及腹水中的單核細(xì)胞等多種細(xì)胞誘導(dǎo)而來(lái)[1-3]。本研究分別從卵巢癌患者外周血和腹水中培養(yǎng)DC，觀察體外激活淋巴細(xì)胞產(chǎn)生CTL及CTL在體外對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的殺傷作用，同時(shí)對(duì)比加入IL-2后對(duì)卵巢癌細(xì)胞殺傷作用，為卵巢癌的生物治療研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 人白細(xì)胞成分血 健康人抗凝靜脈血制備的濃縮白細(xì)胞成分血標(biāo)本來(lái)自長(zhǎng)春市中心血站健康獻(xiàn)血者共10份，每份50 ml，年齡20-45歲，均在獻(xiàn)血后2 h行外周血單核細(xì)胞分離。

1.1.2 卵巢癌患者腹水及血液標(biāo)本 6份晚期卵巢癌腹水2 000 ml取自吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院的確診的住院患者，在術(shù)前診斷性腹穿或術(shù)中無(wú)菌收集，采集前均未進(jìn)行放化療，離心后分離單核細(xì)胞。同時(shí)采50 ml外周抗凝靜脈血，用于分離淋巴細(xì)胞。

1.1.3 其他試劑 IMDM，RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco提供)；rhIL-1，rhIL-4， rhIL-2(北京軍科院四所)；rhGM-CSF(長(zhǎng)春金賽藥業(yè))；TNF-a(美國(guó)Coring)；無(wú)關(guān)系細(xì)胞(COS，蘇州醫(yī)學(xué)院免疫室提供)；人卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞株SKOV3(上海細(xì)胞研究所)；淋巴細(xì)胞分離液(上海生化二廠生產(chǎn))；FITC標(biāo)記的鼠抗人CD1a，DC83，IgG1單克隆抗體，PE標(biāo)記的鼠抗人CD86，CD80單克隆抗體及APC標(biāo)記的HLA-DR單克隆抗體(深圳晶美公司提供)；MTT及DMSO (Sigma 公司)；IL-12ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自R&D公司。

1.1.4 儀器設(shè)備 低溫冰箱(日本日立公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本平澤公司)；高速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；流式細(xì)胞儀(美國(guó) Coulter 公司ELITE-Ⅱ型號(hào))；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)索林公司ELX800型號(hào))；電子天平(日本島津公司)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DC 的體外誘導(dǎo)

①人外周血單核細(xì)胞(PBMC)的分離 取健康人抗凝靜脈血制備濃縮白細(xì)胞，離心1 000 r·min-1，5 min后去除血漿，用pH7.2的D-Hank’s液稀釋1倍后混勻；按1∶2加入淋巴細(xì)胞分層液(Ficoll)2 000 r·min-1離心20 min；吸取單個(gè)核細(xì)胞層至離心管中，加入約5倍體積的pH7.2的含1%FCS的D-Hank’s液，混勻，1 500 r·min-1離心1 000 r·min-1，8 min，棄上清；重復(fù)后加入1%FCS-D-Hank’s 液混勻。臺(tái)酚藍(lán)記數(shù)細(xì)胞，用無(wú)血清-IMDM 重懸細(xì)胞。

②外周血DC[DC(P)]的體外培養(yǎng) 調(diào)整上述重懸細(xì)胞濃度為2×106/ml，加入24孔板，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h；收集懸浮細(xì)胞備用；以無(wú)血清IMDM 清洗培養(yǎng)板兩次；加入10%FCS-IMDM完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中過(guò)夜；去掉無(wú)血清IMDM，加入10%FCS-IMDM,GM-CSF 200 ng/ml,IL-450 ng/ml,3天后進(jìn)行半量換液,加入帶有細(xì)胞因子的培養(yǎng)基，培養(yǎng)5天后收集未成熟DC，3天半量換液一次；自第7天開(kāi)始換成帶有 rhTNF-α10 ng/ml、rhGM-CSF 200 ng·ml-1的培養(yǎng)基,3天半量換液，第11-14天收獲成熟的DC(mDC)。

③卵巢癌患者腹水來(lái)源的DC(A)的培養(yǎng) 取卵巢癌患者腹水2 000 ml以2 000 r/min離心10 min后棄上清，Hanks液重懸細(xì)胞，置于Ficoll溶液上，2 000 r/min，離心15分鐘，吸取單核細(xì)胞層，培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，置于24孔培養(yǎng)板中，37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，收集貼壁細(xì)胞，獲得了腹水中的單核細(xì)胞。腹水中DC的培養(yǎng)同血中DC的培養(yǎng)過(guò)程。

④分離卵巢癌患者外周血T淋巴細(xì)胞 取卵巢癌患者抗凝靜脈血50 ml(20 U/ml 肝素抗凝)，Hanks適量稀釋，按1∶2加入淋巴細(xì)胞分層液(Ficoll)稀釋血液2 000 rpm，離心20 min，吸取界面灰白單核細(xì)胞層T細(xì)胞，以2%胎牛血清的PBS液懸浮細(xì)胞，離心1 000 rpm，5 min，洗滌2次，獲得富集純化的自體T淋巴細(xì)胞備用。

1.2.2 DC 形態(tài)學(xué)觀察

用倒置顯微鏡每日觀察細(xì)胞的大小、形態(tài)及生長(zhǎng)狀況；用PE-CD83、FITC-HLA-DR、CD80、CD86、CD1a處理DCs,，觀察成熟DCs表面表達(dá)的熒光強(qiáng)度。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)樹(shù)突細(xì)胞表型 取培養(yǎng)5-7 d未成熟DC(iDC)和11-14dmDC，0.02%EDTA，37℃消化30 min，收集細(xì)胞并制備成濃度4×105/ml的細(xì)胞懸液；用PBS洗滌細(xì)胞2次；稀釋為200 μl，加入熒光標(biāo)記的5 μl FITC標(biāo)記的鼠抗人CD1a，DC83，IgG1單克隆抗體，PE標(biāo)記的鼠抗人CD86，CD80單克隆抗體及APC標(biāo)記的HLA-DR單克隆抗體，4℃孵育30 min； PBS洗滌細(xì)胞，1 200 r·min-1離心5 min，棄上清液；加入0.5 ml pH7.4 PBS后重懸細(xì)胞。

1.2.4 SKOV3卵巢癌凍融抗原的制備 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SKOV3細(xì)胞，調(diào)整密度為2×107/ml,置于液氮中10 min,迅速放入100℃水浴,反復(fù)凍融3次。600 g離心20 min,收集上清,13 000 g離心1 h。經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾后作為可溶性卵巢癌凍融抗原,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 致敏DC 分別取培養(yǎng)6天的DC(P)及DC(A)(1×105/ml)， 每孔加入腫瘤細(xì)胞抗原凍融液0.1 ml，DC與抗原比例為1∶5，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 d。

1.2.6 同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR) MLR反應(yīng)分為4組,第1組按上述常規(guī)方法培養(yǎng)6 d的DC,第2組為DC+T淋巴細(xì)胞,第3組為在培養(yǎng)至第6天時(shí)加入經(jīng)SKOV3卵巢癌凍融抗原致敏的DC+T淋巴細(xì)胞,第4組為在培養(yǎng)至第6天時(shí)加入經(jīng)SKOV3卵巢癌凍融抗原致敏的DC+IL-2+T淋巴細(xì)胞。在經(jīng)紫外線處理后的96孔板中,分別加入1×104,2×103,1×103/L的樹(shù)突狀細(xì)胞懸液,以自身T淋巴細(xì)胞作為對(duì)照,每孔設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔,分別加入T淋巴細(xì)胞1×105/孔,配成樹(shù)突狀細(xì)胞∶T細(xì)胞分別為1∶10,1∶50,1∶100 的比例,終體積為 200 μl,CO2培養(yǎng)箱中孵育90 h后,MTT法在酶標(biāo)儀上測(cè)570 nm波長(zhǎng)的OD值。計(jì)算刺激指數(shù)(SI)=實(shí)驗(yàn)孔OD平均值/對(duì)照孔OD平均值。

1.2.7 IL-12檢測(cè) 收集DC上清,ELISA法定量檢測(cè)IL-12含量,具體步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.8 抗原負(fù)載DC激活CTL的細(xì)胞毒作用

①靶細(xì)胞制備 復(fù)蘇SKOV3卵巢癌細(xì)胞株，用 IMDM 培養(yǎng)基清洗細(xì)胞，1 000 r·min-1，離心5 min；將腫瘤細(xì)胞以1×106/ml 濃度接種于含10%FCS-IMDM 培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，每2-3 d 換液一次；收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用 PBS 洗滌細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min，計(jì)數(shù)細(xì)胞，用10%FCS-IMDM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；調(diào)整細(xì)胞密度為104/ml，接種于 96 孔板，每孔200 μl 培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜。

②DC致敏抗原特異性CTL的活性檢測(cè) 將致敏DCs與T細(xì)胞按1∶10的比例,加入/不加入IL-2(40 U·ml-1)共孵育為效應(yīng)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/ml，加入SKOV3靶細(xì)胞密度為104/ml，使效靶比為20∶1，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2天；分組：實(shí)驗(yàn)組1：SKOV3細(xì)胞凍融抗原負(fù)載 DC(P) 誘導(dǎo) CTL 殺傷SKOV3細(xì)胞組;實(shí)驗(yàn)組2:SKOV3細(xì)胞凍融抗原負(fù)載 DC(P) 誘導(dǎo) CTL +IL-2殺傷SKOV3細(xì)胞組;實(shí)驗(yàn)組3:SKOV3細(xì)胞凍融抗原負(fù)載 DC(A) 誘導(dǎo) CTL殺傷SKOV3細(xì)胞組;實(shí)驗(yàn)組4:SKOV3細(xì)胞凍融抗原負(fù)載 DC(A) 誘導(dǎo) CTL +IL-2殺傷SKOV3細(xì)胞組;實(shí)驗(yàn)組5:SKOV3細(xì)胞凍融抗原負(fù)載 DC(P) 誘導(dǎo) CTL殺傷COS細(xì)胞組;實(shí)驗(yàn)組6:SKOV3細(xì)胞凍融抗原負(fù)載 DC(A) 誘導(dǎo) CTL殺傷COS細(xì)胞組;陰性對(duì)照組：未負(fù)載凍融抗原DC誘導(dǎo)CTL殺傷SKOV3細(xì)胞組；空白對(duì)照組：SKOV3腫瘤細(xì)胞組。

③檢測(cè)前4 h，每孔加入MTT 20 μl，培養(yǎng)4 h后，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，每孔加入DMSO 100 μl，室溫振蕩10 min,酶標(biāo)儀 490 nm 處測(cè)各孔光密度(OD)值，計(jì)算殺傷率。殺傷率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)孔 OD-陰性對(duì)照孔 OD)/對(duì)照 OD]×100%。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用 SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，應(yīng)用t檢驗(yàn)、方差分析，P<0.05 為有顯著差異性，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DC形態(tài)學(xué)觀察

2.1.1 體外誘導(dǎo)DC形態(tài)觀察 外周血單個(gè)核細(xì)胞粘附培養(yǎng)2 h后，分離出圓形貼壁細(xì)胞，主要為單核細(xì)胞。過(guò)夜培養(yǎng)后有部分細(xì)胞懸浮，多為殘留的B細(xì)胞、T細(xì)胞及外周血樹(shù)突狀細(xì)胞，將懸浮細(xì)胞去除，獲得較純的單核細(xì)胞；加入GM-CSF、IL-4 培養(yǎng)72 h，呈半懸浮狀態(tài)的細(xì)胞開(kāi)始增多，但細(xì)胞表面未見(jiàn)明顯突起；培養(yǎng)3天后細(xì)胞表面伸出毛刺樣突起，細(xì)胞數(shù)目增多，體積增大；培養(yǎng)7天后，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，分布較均勻，大小為成熟單核細(xì)胞的1-1.5倍，可見(jiàn)典型的樹(shù)突狀突起(圖1)。外周血來(lái)源的DC(P)，體外培養(yǎng)5-6天表現(xiàn)為懸浮叢狀生長(zhǎng)，體積增大，表現(xiàn)為樹(shù)突狀外形，腹水來(lái)源的DC(A)較外周血來(lái)源的DC晚1-2天，但顯微鏡下未見(jiàn)明顯差別。如圖1、2。

2.1.2 抗原負(fù)載DC形態(tài)觀察 與未負(fù)載抗原組DC相比，細(xì)胞多為懸浮生長(zhǎng)，呈圓形、細(xì)胞突起變少。(圖2)

2.1.3 與T細(xì)胞共培養(yǎng)DC形態(tài)觀察 加入淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)2-3天，細(xì)胞增大，細(xì)胞突起增多，淋巴細(xì)胞成簇狀分布在DC周圍生長(zhǎng)。

圖1 外周血來(lái)源的DC細(xì)胞 圖2 腹水來(lái)源的DC細(xì)胞

2.1.4 熒光顯微鏡下所見(jiàn)成熟DCs表面表達(dá) HLA-DR的熒光強(qiáng)度高，其次為CD80及CD86，其他均較弱，僅見(jiàn)到細(xì)胞輪廓。

2.2 FCM 檢測(cè)DC細(xì)胞表型特點(diǎn)外周血來(lái)源DC[DC(P)]及腹腔水來(lái)源DC[DC(A)]經(jīng)流式細(xì)胞計(jì)進(jìn)行表型鑒定，7天和14天時(shí)兩種來(lái)源DC表面分子表達(dá)的陽(yáng)性率無(wú)明顯差異(見(jiàn)圖3)，但CD83在第14天時(shí)的表達(dá)明顯高于第7天，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果顯示抗原負(fù)載能增強(qiáng)表面分子的表達(dá)。培養(yǎng)7天時(shí)，與無(wú)抗原負(fù)載的DC相比,經(jīng)卵巢癌凍融抗原負(fù)載后能上調(diào)各種DC相關(guān)分化抗原表達(dá)(見(jiàn)表1)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異具有顯著性(P<0.05)。

圖3 DC細(xì)胞表面分子的表達(dá)

DC(P)DC(P)+AgDC(A)(%)DC(A)+Ag培養(yǎng)第7天CD1a61.32±5.4171.89±3.0163.31±4.3174.32±4.15CD8039.12±4.7983.45±2.9843.24±3.6485.46±3.12CD8318.37±0.9874.00±7.8620.56±1.2576.25±6.95HLA-DR86.67±6.8995.65±3.7583.28±7.6594.74±3.28

2.3 同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR) 在效靶比分別為1∶10、1∶50、1∶100的條件下，與無(wú)抗原負(fù)載的DC相比,經(jīng)卵巢癌凍融抗原負(fù)載后的DC可強(qiáng)烈激發(fā)自身淋巴細(xì)胞的增殖，刺激指數(shù)SI分別是外周血來(lái)源DC(P):42.12±6.56 vs 17.98±4.72、22.87±5.67 vs 12.16±3.57、13.67±3.84 vs 6.27±3.52；腹水來(lái)源DC(A)：39.72±5.16 vs 15.23±3.24、20.65±4.33 vs 10.76±2.98、11.87±2.58 vs 5.64±2.59,差異均有顯著性(n=4,P<0.05)。不同來(lái)源DC間相應(yīng)各比例的刺激指數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 IL-12檢測(cè) 如圖4所示，第7天加入卵巢抗原致敏DC與無(wú)抗原致敏DC相比，其上清中IL-12濃度明顯增高，分別為77.125.89 pg/ml vs 20.553.44，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異具有顯著性(n=3,P=0.0001)。

圖4 DC細(xì)胞分泌IL-12水平

2.5 DC負(fù)載卵巢癌抗原激發(fā)T淋巴細(xì)胞特異性免疫殺傷作用如圖5所示，經(jīng)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3凍融抗原負(fù)載DC激活的CTL在體外對(duì)SKOV3的殺傷能力增強(qiáng)，當(dāng)CTL與SKOV3共培養(yǎng)24 h后SKOV3的死亡率與未經(jīng)抗原負(fù)載DC誘導(dǎo)的CTL對(duì)SKOV3的殺傷率相比較，負(fù)載與不負(fù)載抗原的殺傷能力與對(duì)照組相比具有顯著性差異(n=4,P=0.0001)，但不同DC間相應(yīng)情況下的殺傷能力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖5 DC負(fù)載卵巢癌細(xì)胞激發(fā)T淋巴細(xì)胞特異性細(xì)胞毒作用

兩組來(lái)源的DC經(jīng)卵巢細(xì)胞凍融癌抗原負(fù)載后誘導(dǎo)CTL細(xì)胞對(duì)卵巢癌細(xì)胞系SKOV3具有特異性殺傷作用，隨著效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量的增高(50∶1，100∶1)，負(fù)載卵巢癌抗原的DC能誘導(dǎo)出CTL細(xì)胞對(duì)卵巢癌細(xì)胞系SKOV3呈最強(qiáng)的細(xì)胞毒殺傷率(分別為DC(P)：89.23±5.45%，81.51 ±4.67%與DC(A)：86.47±6.12%,78.49±3.89%，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且兩種來(lái)源的DC負(fù)載卵巢癌抗原后加入IL-2誘導(dǎo)出CTL細(xì)胞對(duì)卵巢癌細(xì)胞的殺傷作用更強(qiáng)(分別為DC(P)：92.23±5.2%，89.21±6.1%與DC(A)：90.14±6.25%，85.43±7.46%)。且與各自對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01)，而兩種DC間各組的殺傷作用無(wú)顯著性性差別(P>0.05)。

3 討論

卵巢上皮癌大部分患者發(fā)現(xiàn)即為晚期，5年生存率低。近年來(lái)隨著大量腫瘤抗原的發(fā)現(xiàn)，以腫瘤疫苗為基礎(chǔ)的主動(dòng)免疫治療和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答已成為抗腫瘤治療新的熱點(diǎn)。樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)是功能最強(qiáng)的專職性抗原遞呈細(xì)胞APC。大量的研究表明，通過(guò)不同形式的腫瘤抗原致敏的DC體內(nèi)注射后可誘導(dǎo)出特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答，證明DC免疫療法具有的抗腫瘤治療效果。本研究從卵巢癌腹水中提取單核細(xì)胞作為DC的來(lái)源，并與外周血單核細(xì)胞來(lái)源的DC比較，結(jié)果顯示：兩種來(lái)源的DC在外形特征上未見(jiàn)差別，且兩種來(lái)源DC表面免疫分子表型(DC1a,DC80,DC86)表達(dá)的陽(yáng)性率無(wú)明顯差異。但腹水來(lái)源的DC比外周血來(lái)源的DC晚成熟1-2天，推測(cè)腹水中的單核細(xì)胞所處的環(huán)境中免疫抑制因子多于外周血中的因子種類及含量，導(dǎo)致腹水中的單核細(xì)胞對(duì)GM-CSF及IL-4反應(yīng)遲緩，但在比較DC刺激淋巴細(xì)胞功能時(shí)，兩組不同來(lái)源的DC沒(méi)有差別。故認(rèn)為腹水來(lái)源的DC雖然發(fā)育較慢，但在體外培養(yǎng)12天后仍具有成熟DC遞呈抗原及刺激淋巴細(xì)胞的功能。

DC依賴于獨(dú)特的抗原遞呈功能及免疫佐劑功能誘導(dǎo)高效而特異的抗腫瘤免疫，而DC前體及成熟DC各具特點(diǎn)。DC前體即未成熟DC識(shí)別、攝取、加工處理抗原的能力強(qiáng)，刺激幼稚T細(xì)胞的能力弱，而成熟DC的功能則與其相反。本研究在DC未成熟階段與腫瘤抗原共同培養(yǎng)，保證腫瘤抗原的有效攝取、加工。而DC成熟后吞噬腫瘤抗原， DC高表達(dá)共刺激分子及其他黏附分子，可提呈抗原并誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖為抗原特異性的CTL，誘導(dǎo)出高效而特異的抗腫瘤免疫[4,5]。

DC作為載體負(fù)載腫瘤抗原后可以激發(fā)機(jī)體有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)，同時(shí)亦可在體外激發(fā)T淋巴細(xì)胞形成CTL細(xì)胞，有效的殺傷腫瘤細(xì)胞。腫瘤相關(guān)抗原不易得到，目前多用腫瘤細(xì)胞裂解產(chǎn)物、腫瘤抗原多肽、合成的MHC-1限制性多肽等負(fù)載DC及通過(guò)遺傳工程傳導(dǎo)腫瘤相關(guān)抗原或細(xì)胞因子的DC[6-8]。但上述方法存在著抗原提呈效果不佳及技術(shù)上的困難等缺點(diǎn)。應(yīng)用卵巢癌細(xì)胞反復(fù)凍融后的溶解物沖擊DC，即可誘導(dǎo)出已知和未確定的腫瘤相關(guān)抗原，引起特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)[9]。Li[10]等研究顯示，卵巢癌患者外周血起源的DC在其自身熱休克蛋白反復(fù)刺激下，能明顯的誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的增殖和毒性。腫瘤細(xì)胞提取物負(fù)載的DC疫苗可以明顯誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的免疫反應(yīng)，并具有操作簡(jiǎn)便、遞呈抗原效率高等優(yōu)點(diǎn)。本研究使用凍融細(xì)胞的方法使兩種來(lái)源的DC負(fù)載卵巢癌抗原，成功誘導(dǎo)出具有抗腫瘤特性的CTL，且腹水來(lái)源的DC和外周血來(lái)源的DC兩組比較差異無(wú)顯著性。本研究證實(shí)從卵巢癌腹水中分離單核細(xì)胞培養(yǎng)大量DC，為卵巢癌DC基礎(chǔ)免疫治療提供了新的細(xì)胞來(lái)源，為其臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，避免了體外對(duì)同一病人DC進(jìn)行反復(fù)操作[11,12]。

國(guó)外最新研究證實(shí)來(lái)源于腹水中單核細(xì)胞的不成熟DC可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡，且該來(lái)源的DC與自身的卵巢癌細(xì)胞共同培養(yǎng)能夠誘導(dǎo)CTLs的增殖反應(yīng)[13]。Chu[3]等人研究證實(shí)，從卵巢癌腹水中的巨噬細(xì)胞來(lái)源的DC(TAMS，可獲得成熟的和不成熟DC)與外周血單核細(xì)胞來(lái)的DC的表型及功能進(jìn)行比較，兩種DCs在同種異體雜交的淋巴細(xì)胞反映中，有同樣的激活T淋巴細(xì)胞增殖的作用，而且呈遞腫瘤抗原的TAM來(lái)源的DCs通過(guò)腫瘤特異性T細(xì)胞系能激活γ-IFN，殺傷腫瘤細(xì)胞。卵巢癌患者TAMs可生成大量的DCs。因此，TAMs可用于外源性或內(nèi)源性DC免疫治療，特別是常規(guī)外周血單核細(xì)胞DCs來(lái)源耗竭的患者，與本研究結(jié)果及觀點(diǎn)一致。

IL-2具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)、提高抗原對(duì)免疫系統(tǒng)的激活作用，具有正負(fù)反饋現(xiàn)象，即使少量的IL-2可引發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。本研究將IL-2加入到兩種來(lái)源的DC培養(yǎng)液中，可在腫瘤細(xì)胞局部產(chǎn)生較高濃度的細(xì)胞因子，并可維持較長(zhǎng)時(shí)間，結(jié)果顯示IL-2具有顯著的激活特異性CTLs活性，兩組比較差異無(wú)顯著性。IL-12是各種抗原提呈細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，他們?cè)诳拱┟庖呦到y(tǒng)中起著非常重要的作用[14]。Kim[15]等用葉酸蛋白的191-199肽段E39刺激DC，在細(xì)胞因子IL-2和IL-15的作用下將致敏的DC兩種細(xì)胞與卵巢癌患者的淋巴細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)，能引起腫瘤特異性的CTL介導(dǎo)的抗瘤反應(yīng)。兩種來(lái)源DC經(jīng)卵巢癌抗原負(fù)載后培養(yǎng)液上清中IL-12的含量均增加，且與各自對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05)。說(shuō)明腫瘤抗原能增強(qiáng)白細(xì)胞介素12的分泌從而刺激DC的免疫力。國(guó)內(nèi)藍(lán)春燕[16]等的研究表明，卵巢癌外周血來(lái)源的DC刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖能力較健康婦女組低，提示卵巢癌患者來(lái)源的DC存在某種程度的免疫功能異常，影響抗原的遞呈作用，從而影響其抗腫瘤免疫應(yīng)答。

綜上，DC疫苗在常規(guī)療法消除絕大部分腫瘤負(fù)荷后，作為一種輔助治療手段，能夠消滅殘余腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，抑制腫瘤生長(zhǎng)，防止腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)能夠殺滅殘余的腫瘤細(xì)胞等方面，有望成為難治性和常規(guī)治療后有殘留病灶的一種有效治療方法。DC在卵巢癌免疫治療的實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用研究中顯示了美好的前景。

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The effect of ovarian cancer antigen impacted DC on SKOV3 in vitro

SHENGMin-jia1,XUELi-juan2,WANGLi-yan1*,etal.

(1.ChinaJapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033，China;2.TheFirstHospitalofJilinUniversity)

Objective To study the effect of tumor specific cytotoxic T lymphocyte (CTL) produced by the activation of lymphocytes from the peripheral blood and ascites of dendritic cells (DC) in ovarian cancer patients in vitro,and its killing role on ovarian cancer cell SKOV3.Methods Cultured DC from blood and ovarian cancer ascites,observed the cell morphology and detected the cell surface molecules expression;DC was pulsed by freeze-thaw ovarian cancer antigen,to detect T lymphocyte proliferation and IL-2 levels stimulated by two sources of DC;To detect killing roll of antigen load DC and T cells induce CTL for ovarian cancer cells.Results Microscopic display of peripheral blood and ascites derived DC morphology has no significant difference,maturation time of ascites source DC is later than peripheral blood DC;The positive rate of surface molecules expression has no significant difference except CD83;ovarian cancer lysates DC raised its surface associated antigen expression,the difference was statistically significant (P<0.05);The proliferation of T lymphocytes stimulated by ovarian cancer cell lysates DC was high,the difference was significant (P<0.05),but two sources of DC stimulation index has no significant difference;compared DC with antigen loaded,the DC without antigen loaded has supernatant IL-12 concentration increased,the difference was significant (P<0.05);Without loaded DC and with loaded DC antigen ovarian cancer killing effect enhanced as compared with the control group with significant difference (P<0.05);with the increasing number of cells,the killing effect after added IL-2 was enhanced,but the peripheral blood DC sources and ascites has no significant difference (P<0.05).Conclusion The DC from peripheral blood and ascites of ovarian cancer patients have the effect of inducing CTL.DC loaded tumor antigen as a carrier can stimulate T lymphocytes formed CTL,that has anti-ovarian cancer cell SKOV3 effect in vitro.

ovarian cancer;dendritic cells;cytotoxic T lymphocytes;interleukin-2;killing effect

1007-4287(2016)11-1811-06

R737.31

A

2016-02-15)