梁群燾，魏 崢

(福州大學(xué)糖生物化學(xué)研究所，福建 福州 350002)

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含N-非取代葡糖胺殘基肝素四糖的制備與表征

梁群燾，魏 崢

(福州大學(xué)糖生物化學(xué)研究所，福建 福州 350002)

生物體內(nèi)含有N-非取代葡糖胺殘基(GlcNH3+)結(jié)構(gòu)的硫酸類肝素(HS)具有重要的生物和病理生理學(xué)功能。但這種HS在生物體內(nèi)的含量較少、獲得困難，而采用化學(xué)方法制備與生物體內(nèi)結(jié)構(gòu)相似的這種寡糖，有助于研究HS在生物體內(nèi)的功能作用。本實(shí)驗(yàn)以高硫的肝素四糖為原料，用部分脫N位硫酸根的方法，制備了含1個(gè)和2個(gè)GlcNH3+的肝素四糖，并采用液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜(LC/MS-IT-TOF)法對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)檢測(cè)。通過(guò)分析(EIC)-MS和MS2提取離子流圖發(fā)現(xiàn)，含不同GlcNH3+數(shù)目的肝素四糖具有不同的裂解規(guī)律，含GlcNH3+數(shù)目越多，生成的碎片離子越多，這為MS方法進(jìn)一步鑒定和定量測(cè)定含GlcNH3+結(jié)構(gòu)的寡糖奠定了基礎(chǔ)。

肝素；四糖；N-非取代葡糖胺二糖；液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜(LC/MS-IT-TOF)；裂解規(guī)律

肝素(heparin)和硫酸類肝素(HS)在生物個(gè)體發(fā)育，血管生成，血液凝固，細(xì)胞粘附和腫瘤轉(zhuǎn)移等過(guò)程中具有重要的生物學(xué)活性作用[1-4]。其生物學(xué)功能與它們的結(jié)構(gòu)多樣性，以及與細(xì)胞表面和細(xì)胞外蛋白相互的作用密切相關(guān)，且糖胺聚糖(GAG)的結(jié)構(gòu)決定了它們相互作用的能力[5-6]。

在高爾基體中，肝素和硫酸類肝素的生物合成是通過(guò)多種酶間復(fù)雜的相互協(xié)同作用完成的，其原理示于圖1[7]。首先，形成1個(gè)葡萄糖醛酸-半乳糖-半乳糖-木糖(glucuronic acid-galactose-galactose-xylose，GlcUAβ1→3Galβ1→3Galβ1→4Xylβ1-)的“連接四糖”結(jié)構(gòu)，把HS鏈連接到蛋白聚糖核心蛋白的絲氨酸上；接著，通過(guò)復(fù)雜的EXT1和EXT2聚合酶催化交替轉(zhuǎn)移葡萄糖醛酸(GlcUA)和N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，合成非硫酸化的HS初生鏈。HS初生鏈由重復(fù)的二糖組成，這些二糖由β1→4連接GlcUA和α1→4連接GlcNAc相互交替組成。在N-脫乙酰/N-磺基轉(zhuǎn)移酶(N-deacetylase/N-sulfotransferase，NDST)的作用下，非硫酸化的初生鏈GlcNAc基團(tuán)在N位上脫乙?；纬?個(gè)N-非取代葡萄糖胺(GlcNH3+)中間體結(jié)構(gòu)，隨后進(jìn)一步的修飾[8-11]。如，GlcUA殘基C-5差向異構(gòu)化(C5-epimerase)為α1→4艾杜糖醛酸殘基(IdoA)；在HS 3-O-磺基轉(zhuǎn)移酶(3-O-sulfotransferases，3-OST)的作用下，GlcNS的C-3位氧硫酸化，形成一種比較罕見(jiàn)但功能重要的殘基；己糖醛酸(主要是IdoA)C-2位氧硫酸化；GlcNS或GlcNAc殘基上的C-6位氧硫酸化；N位硫酸化，游離氨基基團(tuán)被硫酸化取代形成帶負(fù)電荷的氨基硫酸衍生物，即β-D-N-硫葡糖胺硫酰胺(GlcNS)。在肝素和硫酸類肝素生物合成過(guò)程中，由于NDST酶活性受到限制，N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)殘基上產(chǎn)生隨機(jī)的N-脫乙?；?，但不發(fā)生隨后的N-磺酸化過(guò)程，從而產(chǎn)生了GlcNH3+。這種現(xiàn)象在缺少3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸酯(PAPS)的情況下更為明顯。這是因?yàn)镻APS是硫酸鹽供體，缺乏PAPS可導(dǎo)致NDST酶的催化活性受到限制[12]。

圖1 硫酸類肝素的生物合成原理示意圖[7]

生物體內(nèi)HS的GlcNH3+含量較低，且因物種、組織和細(xì)胞的來(lái)源不同而異，一般含GlcNH3+的二糖含量為0.2%～4%[13-17]，但在牛腎HS中，GlcNH3+的含量高達(dá)12%[16]。但低含量的GlcNH3+殘基卻與許多重要的細(xì)胞生物活動(dòng)和病理生理現(xiàn)象有關(guān)[18-20]。硫酸化的二糖結(jié)構(gòu)IdoA(2S)-GlcNH3+(±6S)是HS 3-O磺基轉(zhuǎn)移酶-3(3-OST-3)的作用靶點(diǎn)，這種HS酶能夠生成一個(gè)位點(diǎn)，這個(gè)位點(diǎn)可以與單純皰疹病毒HSV[19]以及人嗜環(huán)蛋白/親環(huán)素B(CyPB)的gD糖蛋白[21]產(chǎn)生粘附結(jié)合作用，并且這種硫酸化的二糖結(jié)構(gòu)主要位于HS的高硫區(qū)域?；瘜W(xué)合成的含GlcNH3+殘基的HS四糖GlcAβ1-4 GlcNH3+(6-O-sulfate)α1-4 GlcAβ1-4 GlcNH3+(6-O-sulfate)，在體外能夠抑制肝素酶的活性，并抵抗乳腺癌細(xì)胞的侵襲[22]。鑒于含GlcNH3+的HS/heparin寡糖具有重要的生物學(xué)功能，但其含量較少，難于獲得，因此制備含GlcNH3+且與生物體內(nèi)結(jié)構(gòu)類似的高度硫酸化HS/heparin寡糖，對(duì)于研究含GlcNH3+的HS/heparin有關(guān)生物學(xué)功能具有重要意義。目前，HS/heparin寡糖的制備多集中在常用的肝素類藥物上，而含少量GlcNH3+殘基的HS/heparin寡糖制備的報(bào)道較少。如，Satomi等[22]在體外合成了一種含GlcNH3+的HS四糖，并研究其功能；Wei等[23]用肝素酶Ⅰ裂解的方法制備了系列含GlcNH3+殘基的HS/heparin寡糖，但酶解產(chǎn)率較低。

質(zhì)譜具有檢測(cè)靈敏度高，能夠準(zhǔn)確測(cè)定物質(zhì)的分子質(zhì)量等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為分析HS/heparin寡糖結(jié)構(gòu)的有力工具[24-26]。采用MSn分析heparin和HS，能獲得豐富的糖苷鍵斷裂以及環(huán)內(nèi)裂解的碎片信息，這些信息可用來(lái)確定硫酸化和乙酰化的作用位點(diǎn)，并依此判斷物質(zhì)的結(jié)構(gòu)[27]。有報(bào)道采用ESI-MSn方法在負(fù)離子模式下探析12種硫酸類肝素二糖[28]和8種CS/DS二糖[29]的裂解規(guī)律，特別是利用計(jì)算框架處理MS生成的復(fù)雜數(shù)據(jù)，使得LC/MS方法具有檢測(cè)大多數(shù)寡糖序列的潛力[30]。文獻(xiàn)[31]報(bào)道了一種新的含GlcNH3+寡糖的測(cè)序方法，它結(jié)合了HNO2裂解、尺寸排阻高效液相色譜(SE-HPLC)和液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜(LC/MS-IT-TOF)方法，為確定化學(xué)修飾生成的寡糖結(jié)構(gòu)系列提供了可能。

本實(shí)驗(yàn)將制備含不同GlcNH3+數(shù)目的肝素四糖(dp4)，采用LC/MS-IT-TOF法對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，并探討其在MS分析中的裂解規(guī)律，希望為含GlcNH3+寡糖的結(jié)構(gòu)分析提供方法參考，同時(shí)也為檢測(cè)含GlcNH3+寡糖的生物樣品提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器

高效液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(LC/MS-IT-TOF MS)：日本島津公司產(chǎn)品，配有二元泵(LC-20AD)、脫氣裝置(DGU-20A3R)、自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)(SIL-20AC)、光敏二極管陣列(PDA)、檢測(cè)器(SPD-M20A)、基本通信模塊(CBM-20A)和柱溫箱(CTO-20A)；1200型高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；Milli-Q超純水機(jī)：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；Alpha 1-4 LDplus型真空冷凍干燥機(jī)、CT02-50SR型恒溫真空冷凍濃縮儀：均為德國(guó)Christ公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

低分子質(zhì)量肝素(LMWH, Innohep)：英國(guó)Leo制藥有限公司產(chǎn)品；12種硫酸類肝素二糖標(biāo)樣：英國(guó)Iduron公司產(chǎn)品；Bio-Gel P-10聚丙烯酰胺凝膠：英國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；MWCO 500透析膜：上海索萊寶生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；肝素酶Ⅰ(50 UN)、肝素酶Ⅱ(10 UN)、離子交換樹(shù)脂IR-120(H+型)、吡啶(純度>99.9%)、二甲亞砜(分析純)、碳酸氫銨(分析純)、氯化鈉(純度≥98%)、鹽酸(分析純)、甲酸(純度98%)、戊胺(純度99%)：均為美國(guó)Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；乙腈(色譜純)：德國(guó)Merck公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 高度硫酸化肝素四糖的制備 高度硫

酸化肝素四糖(dp4)的制備參考文獻(xiàn)[23]，主要由兩個(gè)步驟組成。步驟一：用Bio-Gel P-10凝膠分析分離LMWH，以0.2 mol/L NH4HCO3為流動(dòng)相，UV 232 nm檢測(cè)洗脫液吸光度，收集肝素dp4混合物的洗脫峰；然后在50～60 ℃水浴中恒定72 h，去除NH4HCO3，于-80 ℃冷凍5 h，真空干燥，得到肝素dp4混合物樣品。步驟二：用強(qiáng)陰離子交換高效液相色譜(SAX-HPLC)分析分離肝素dp4混合物，收集高硫dp4部分；然后用透析膜在超純水中透析3天，去除NaCl，于-80 ℃冷凍5 h，真空干燥，得高度硫酸化的肝素dp4樣品。1.3.2 含GlcNH3+肝素四糖的制備 含GlcNH3+肝素四糖是通過(guò)高度硫酸化dp4部分脫N位硫酸根獲得的，其方法參考文獻(xiàn)[23]，過(guò)程示于圖2，主要由三個(gè)步驟組成。步驟一：用超純水溶解高硫dp4，在4 ℃下緩慢經(jīng)過(guò)H+型離子交換樹(shù)脂，去除高硫dp4上的Na+；然后用3倍樹(shù)脂體積的4 ℃超純水洗脫。步驟二：用吡啶滴定洗脫液至pH 6～6.5，獲得以吡啶鹽形式存在的dp4。步驟三：在95%二甲亞砜-5%水溶液(V/V)、18～20 ℃條件下，吡啶鹽dp4脫N位硫酸根15 min；然后用透析膜在超純水中透析純化3天，于-80 ℃冷凍5 h，真空干燥，得含N-非取代葡糖胺殘基的dp4。

圖2 肝素四糖部分脫N位硫酸根步驟示意圖

1.3.3 肝素寡糖二糖組分分析 在100 μL 0.1 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH 7.0)，含0.1 mmol/L醋酸鈣和100 mg/L牛血清蛋白反應(yīng)體系下，用肝素酶Ⅰ(50 UN)和肝素酶Ⅱ(0.5 UN)裂解肝素寡糖，于37 ℃反應(yīng)24 h，100 ℃滅活2 min，以15 000 r/min離心15 min，取上清液。酶解產(chǎn)物用SAX-HPLC分析，通過(guò)比對(duì)檢測(cè)圖譜和標(biāo)樣二糖圖譜來(lái)確定二糖組分。

1.3.4 SAX-HPLC分析 ProPac PA-1色譜柱(4.0 mm×250 mm)；洗脫程序：用pH 3.5的H2O沖洗2 min后，在0～0.6 mol/L NaCl(2.1～7.1 min)和0.6～1.3 mol/L NaCl(7.1～47.1 min)條件下，兩相線性梯度洗脫；流動(dòng)相：pH 3.5的H2O(A相)，pH 3.5的2 mol/L NaCl(B相)；流速1 mL/min；柱溫：室溫；在線檢測(cè)器：UV232nm。

1.3.5 LC/MS-IT-TOF分析 色譜條件：Eclipse Plus C18色譜柱(3.5 μm×2.1 mm×150 mm)；流速0.2 mL/min；柱溫35 ℃；流動(dòng)相為H2O(A相)和75%乙腈(B相)，含有15 mmol/L戊胺(PTA)離子對(duì)試劑，用甲酸調(diào)至pH 8.8；洗脫程序?yàn)?%～100%乙腈(2～20 min)線性梯度洗脫；光敏二極管陣列檢測(cè)范圍為190～800 nm。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z200～1 800；噴霧氣體為液氮，流速1.5 L/min；曲形脫溶劑管和加熱模塊溫度設(shè)置為100 ℃；錐孔電壓-3.5 kV；檢測(cè)電壓1.6 kV；IT和TOF真空分別保持在1.8×10-2Pa 和1.6×10-4Pa；質(zhì)量軸校準(zhǔn)采用直接注入標(biāo)準(zhǔn)樣品(0.25 mL/L三氟乙酸和0.1 g/L NaOH的混合物)的方法，檢測(cè)范圍m/z150～2 100，流速0.2 mL/min，經(jīng)過(guò)質(zhì)量校準(zhǔn)的所有質(zhì)量數(shù)參考標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過(guò)5×10-6。

1.3.6 MS/MS條件 樣品溶解于10%乙腈，以0.2 mL/min流速直接注入LC/MS-IT-TOF中；設(shè)置質(zhì)譜系統(tǒng)為自動(dòng)模式，自動(dòng)選擇強(qiáng)度高于105的產(chǎn)物離子作為MS2分析的母離子；碰撞氣體為氬氣；離子累積時(shí)間設(shè)為100 ms；其他質(zhì)譜條件同1.3.5節(jié)。

2 結(jié)果與討論

2.1 高度硫酸化肝素四糖的分析

LMWH是肝素酶Ⅰ的酶解產(chǎn)物，在己糖醛酸非還原端 C4和C5位置具有1個(gè)不飽和雙鍵。以0.2 mol/L NH3HCO3為流動(dòng)相，Bio-Gel P-10可以把不同聚合度的肝素寡糖分開(kāi)，得到的dp4用ProPac柱和SAX-HPLC方法進(jìn)一步分離純化，結(jié)果示于圖3。結(jié)果表明，dp4有3個(gè)主要的峰，根據(jù)出峰時(shí)間分別命名為dp4A、dp4B 和dp4C。按電荷密度不同進(jìn)行分離，dp4C具有最長(zhǎng)的保留時(shí)間，說(shuō)明它含有最多的硫酸基團(tuán)。二糖組分分析表明，dp4C只含有ΔHexA(2S)-GlcNS(6S)，說(shuō)明dp4C含有2個(gè)高硫的二糖，即ΔHexA(2S)-GlcNS(6S)-HexA(2S)-GlcNS(6S)；結(jié)合RPIP-LC/MS分析，可推測(cè)dp4C主要成分為含有6個(gè)硫酸基團(tuán)高度硫酸化的dp4。

圖3 經(jīng)Bio Gel P-10分離后的肝素四糖的SAX-HPLC分離色譜圖

2.2 含N-非取代葡糖胺(GlcNH3+)殘基肝素四糖的分析

高度硫酸化的dp4用部分脫N位硫酸根法制得GlcNH3+后，產(chǎn)物經(jīng)SAX-HPLC分析，出現(xiàn)2個(gè)主要的峰，分別命名為dp4-1和dp4-2，示于圖4。二糖組分分析表明，dp4-2只含有ΔHexA(2S)-GlcNH3+(6S)，說(shuō)明dp4-2含有2個(gè)GlcNH3+殘基，即ΔHexA(2S)-GlcNH3+(6S)-HexA(2S)-GlcNH3+(6S)；而dp4-1含有ΔHexA(2S)-GlcNH3+(6S)和ΔHexA(2S)-GlcNS(6S) 兩種二糖，根據(jù)文獻(xiàn)[23]，確定dp4-1的結(jié)構(gòu)為ΔHexA(2S)-GlcNH3+(6S)-IdoA(2S)-GlcNS(6S)。研究heparins鏈上的GlcNH3+基團(tuán)是制藥領(lǐng)域的熱點(diǎn)。Heparin在高溫或高壓蒸氣滅菌處理時(shí)產(chǎn)生GlcNH3+殘基，這會(huì)改變高度特異的內(nèi)源性抗凝血酶Ⅲ結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致heparin抗凝能力下降[32-33]，而化學(xué)合成的含GlcNH3+殘基的HS四糖在體外能抑制肝素酶的活性、抵抗乳腺癌細(xì)胞的侵襲[22]。因此，本實(shí)驗(yàn)制備了含GlcNH3+的HS/heparin寡糖，并分別單獨(dú)收集含不同GlcNH3+數(shù)目的dp4-1和dp4-2，透析純化后進(jìn)行LC/MS-IT-TOF分析。

圖4 含GlcNH3+肝素四糖的SAX-HPLC色譜圖

2.3 RPIP-LC/MS-IT-TOF分析

RPIP-LC/MS法可以有效地分析分離肝素寡糖，且能減少糖鏈上硫酸根的丟失[34]，準(zhǔn)確地測(cè)量寡糖的分子質(zhì)量，從而確認(rèn)寡糖含有的GlcNH3+數(shù)目。由于硫酸根比較脆弱，在MS分析過(guò)程中容易丟失，因此，本實(shí)驗(yàn)采用高硫的dp4C對(duì)使用的緩沖體系和MS儀器參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。采用MS質(zhì)量數(shù)和提取離子流(EIC)對(duì)樣品進(jìn)行表征，且用它們各自對(duì)應(yīng)的EIC峰面積計(jì)算各離子峰的相對(duì)百分含量。dp4的MS譜圖示于圖5，圖中離子峰對(duì)應(yīng)的分子離子表達(dá)式列于表1。

dp4C的MS圖示于圖5a。圖中，m/z575.916 7為dp4C帶2個(gè)負(fù)電荷的分子離子峰[M—2H]2-。m/z619.466 8、663.014 6、706.563 5、750.112 7分別為dp4C加合了系列PTA(從1個(gè)到4個(gè)PTA)，且?guī)?個(gè)負(fù)電荷的分子離子峰，它們大約占總離子峰含量的76%，說(shuō)明在MS分析過(guò)程中，絕大部分的dp4C沒(méi)有發(fā)生硫酸根的丟失。另外，檢測(cè)到4個(gè)dp4C丟失硫酸根的分子離子峰，即[M—4SO3—2H]2-、[M—3SO3—2H]2-、[M—2SO3—2H]2-和[M—SO3—2H]2-，這些丟失硫酸根的分子離子峰與加合PTA的峰具有相同的洗脫位置，說(shuō)明硫酸根的丟失發(fā)生在MS離子源中。

采用dp4C的MS條件分析含有1個(gè)GlcNH3+的dp4-1，結(jié)果示于圖5b。強(qiáng)度最大的離子峰m/z535.942 2為dp4-1帶2個(gè)負(fù)電荷的分子離子峰[M—2H]2-，另外也檢測(cè)到了dp4-1分別加合1個(gè)和2個(gè)PTA的分子離子峰，這3種峰大約占總離子峰含量的80%。與dp4C檢測(cè)結(jié)果相似，dp4-1也檢測(cè)到了3個(gè)在MS離子源分別丟失1～3個(gè)硫酸根的分子離子峰。

采用同樣的MS條件分析含有2個(gè)GlcNH3+的dp4-2，結(jié)果表明，強(qiáng)度最大的離子峰m/z495.966 7為dp4-2帶2個(gè)負(fù)電荷的分子離子峰[M—2H]2-，且dp4-2大約有相對(duì)百分含量為88%的分子離子沒(méi)有丟失硫酸根，示于圖5c。以上數(shù)據(jù)表明，雖然樣品在RPIP-LC/MS-IT-TOF分析過(guò)程中有硫酸根丟失的現(xiàn)象，但絕大多數(shù)樣品保持了最初的結(jié)構(gòu)形態(tài)，這為準(zhǔn)確測(cè)定肝素寡糖的分子質(zhì)量，確認(rèn)寡糖含有的GlcNH3+數(shù)目提供了幫助。

2.4 肝素dp4s的裂解規(guī)律

串聯(lián)質(zhì)譜法(MSn)常被用來(lái)分析GAGs結(jié)構(gòu)，它能提供豐富的糖苷鍵斷裂以及環(huán)內(nèi)裂解的碎片信息，這些信息可以確定硫酸化和乙?；淖饔梦稽c(diǎn)[27]。本實(shí)驗(yàn)采用MS/MS法探討dp4C、dp4-1和dp4-2的裂解規(guī)律，并分析它們的結(jié)構(gòu)，結(jié)果示于圖6～8。MS/MS產(chǎn)物離子的表述采用Domon和Costello命名規(guī)則[35]。

注：a.高硫dp4C；b.含1個(gè)殘基的dp4-1；c.含2個(gè)殘基的dp4-2

表1 高度硫酸化的dp4C、含1個(gè)GlcNH3+的dp4-1、含2個(gè)GlcNH3+的dp4-2在ESI-MS圖譜中出現(xiàn)的主要分子離子峰

Table 1 Major molecular ions that appeared in the ESI mass spectra of the fully sulfated dp4C,dp4-1 with one GlcNH3+residue and dp4-2 with two GlcNH3+residues

分子式檢測(cè)到的離子理論值(m/z)產(chǎn)物離子的相對(duì)百分含量*/%分子式檢測(cè)到的離子理論值(m/z)產(chǎn)物離子的相對(duì)百分含量*/%C24H38O38N2S6[M-4SO3-2H]2-416.01689.77[M-3SO3-2H]2-456.00213.66[M-2SO3-2H]2-496.00075.21[M-SO3-2H]2-535.50015.43[M-2H]2-575.52167.38[M+PTA-2H]2-619.400317.75[M+2PTA-2H]2-662.904636.54[M+3PTA-2H]2-706.34719.99[M+4PTA-2H]2-749.73114.26C24H38O35N2S5C24H38O32N2S4[M-3SO3-2H]2-416.01689.35[M-2SO3-2H]2456.00214.18[M-SO3-2H]2-496.00076.85[M-2H]2-535.500140.28[M+PTA-2H]2-579.002123.22[M+2PTA-2H]2622.910416.12[M-2SO3-2H]2416.01688.60[M-SO3-2H]2-456.00213.99[M-2H]2496.000768.54[M+PTA-2H]2-539.500418.87

注：*根據(jù)它們對(duì)應(yīng)的EIC面積計(jì)算

dp4C的ESI-MS結(jié)果示于圖6a，從圖中可以觀察到帶2個(gè)負(fù)電荷和帶3個(gè)負(fù)電荷的離子，且?guī)?個(gè)負(fù)電荷的離子峰強(qiáng)度最大。產(chǎn)物離子大多是帶電的分子離子和小分子中性丟失(如SO3、H2O、CH2O 和 CO2H)產(chǎn)生的碎片離子。同時(shí)，檢測(cè)到了糖苷鍵裂解和環(huán)內(nèi)裂解生成的碎片離子峰，但峰強(qiáng)度較低，如2個(gè)帶負(fù)電荷的離子(m/z284.002 2、m/z407.039 4)分別與碎片離子[Z3—COOH—2H]3-(計(jì)算值m/z283.988 4)和[Y3—SO3—H2O—H]2-(計(jì)算值m/z407.077 6)對(duì)應(yīng)，說(shuō)明在MS分析過(guò)程中dp4C產(chǎn)生了Z3和Y3糖苷鍵的裂解；另外，還檢測(cè)到了2個(gè)帶負(fù)電荷的離子(m/z287.476 9、m/z324.330 0)分別與碎片離子[2,4A3—COOH—H]2-(計(jì)算值m/z287.499 0)和[0,2X3—H2O—COOH—H]3-(計(jì)算值m/z324.318 33)對(duì)應(yīng)，說(shuō)明在MS分析過(guò)程中dp4C發(fā)生了2,4A3和0,2X3環(huán)內(nèi)裂解。

dp4C代表性的母離子[M—2SO3—2H]2-(m/z496.005 6，計(jì)算值m/z495.971 0)的ESI-MS2分析結(jié)果示于圖6b。為了進(jìn)一步探討dp4C在MS分析中的裂解規(guī)律，ESI-MS產(chǎn)物離子峰強(qiáng)度大于105的離子自動(dòng)被選為母離子做ESI-MS2分析。結(jié)果表明，不同母離子產(chǎn)生的碎片離子數(shù)目不同，但檢測(cè)到的離子m/z數(shù)值和帶電情況都相似。檢測(cè)到的m/z307.520 1與碎片離子[2,4X2—3SO3—2H]2-(計(jì)算值m/z307.482 65)對(duì)應(yīng)，m/z386.529 1與碎片離子[0,2A4—3SO3—2H]2-(計(jì)算值m/z386.475 55)對(duì)應(yīng)，這說(shuō)明在ESI-MS2中dp4C發(fā)生了環(huán)內(nèi)2,4X2和0,2A4裂解。

ESI-MS和MS2檢測(cè)到的dp4C可能的裂解方式示于圖6c。其中，ESI-MS檢測(cè)到2種糖苷鍵裂解(Z3、Y3)和2種環(huán)內(nèi)裂解(2,4A3和0,2X3)；MS2也檢測(cè)到Z3、Y3裂解，以及2,4X2和0,2A4環(huán)內(nèi)裂解。

注：a.ESI-MS圖譜；b.圖a中m/z 496.005 6作為母離子的MS2圖譜；

dp4-1的ESI-MS結(jié)果示于圖7a，同樣也檢測(cè)到帶2個(gè)和3個(gè)負(fù)電荷的離子，但帶2個(gè)負(fù)電荷的離子峰強(qiáng)度最大。產(chǎn)物離子大多也是帶電的分子離子和小分子中性丟失(如SO3、H2O、CH2O 和 CO2H)產(chǎn)生的碎片離子，糖苷鍵裂解和環(huán)內(nèi)裂解生成的碎片離子峰強(qiáng)度也較低。

dp4-1代表性的母離子[M—2SO3—2H]2-(m/z456.032 3，計(jì)算值m/z456.066 9)的ESI-MS2分析結(jié)果示于圖7b。同樣，為了進(jìn)一步探討dp4-1在MS分析中的裂解規(guī)律，ESI-MS產(chǎn)

物離子峰強(qiáng)度大于105的離子自動(dòng)被選為母離子做ESI-MS2分析。dp4-1檢測(cè)到了特有的裂解方式0,2X2(檢測(cè)值m/z240.023 1，碎片離子[0,2X2—CH2OSO3—COOH—H]2-，計(jì)算值m/z239.982 65)。

ESI-MS和MS2分析中dp4-1的裂解方式示于圖7c。檢測(cè)到5種糖苷鍵裂解(Y3、Z3、Z2、B3和C3)和6種環(huán)內(nèi)裂解(1,5X3、2,4X2、0,2X2、0,2A3、3,5A4和0,2A4)，其中，Y3、3,5A4和0,2A4為ESI-MS檢測(cè)到的裂解，其余的裂解均發(fā)生在ESI-MS2過(guò)程中。與dp4C相比，均出現(xiàn)了相同的糖苷鍵裂解(Y3和Z3)和相同的環(huán)內(nèi)裂解(2,4X2和0,2A4)，但0,2X2為dp4-1特有的裂解方式，位于靠近非還原端的含有GlcNH3+基團(tuán)的葡萄糖胺上。

注：a.ESI-MS圖譜; b.圖a中m/z 456.032 3離子作為母離子的MS2圖譜；

在ESI-MS和MS2分析過(guò)程中，含2個(gè)GlcNH3+基團(tuán)的dp4-2檢測(cè)到了4種糖苷鍵裂解和包括X3、X2、A3和A4在內(nèi)的8種環(huán)內(nèi)裂解，MS、MS2譜圖分別示于圖8a和8b。與dp4-1相比，都檢測(cè)到了相同的糖苷鍵裂解(Y3、Z3、B3和C3)和環(huán)內(nèi)裂解(1,5X3、2,4X2和3,5A4)。但在ESI-MS2分析過(guò)程中檢測(cè)到了dp4-2獨(dú)有的3種裂解方式(1,5X2、2,4A4和1,5A4)，都位于含有GlcNH3+基團(tuán)的葡萄糖胺上，示于圖8c。

注：a.ESI-MS圖譜;b.圖a中m/z 496.005 0離子作為母離子的MS2圖譜；

綜上所述，3種dp4有相同且固定的裂解方式，但含有不同GlcNH3+殘基數(shù)目的dp4能夠生成不同的碎片離子，且含GlcNH3+殘基數(shù)目越多，生成的碎片離子越多，這可能是GlcNH3+所帶正電荷改變了環(huán)的結(jié)構(gòu)，使環(huán)變得比較脆弱，在MS分析中更易裂解。

3 結(jié)論

用部分脫N位硫酸根方法制備的含不同GlcNH3+數(shù)目的肝素寡糖與生物體中存在的含GlcNH3+結(jié)構(gòu)的HS具有相似的結(jié)構(gòu)，這在生物體外檢測(cè)功能蛋白的相互作用以及酶活實(shí)驗(yàn)中具有重要的價(jià)值。ESI-MS和MS2分析結(jié)果表明，含GlcNH3+數(shù)目越多，dp4能夠檢測(cè)到的碎片離子越多，說(shuō)明該方法可用于鑒定和定量具有重要生物學(xué)功能的含GlcNH3+的HS寡糖，以及化學(xué)修飾產(chǎn)生的含GlcNH3+結(jié)構(gòu)的寡糖，甚至它們的同分異構(gòu)體。

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Preparation and Characterization of Heparin Tetrasaccharide withN-unsubstituted Glucosamine Residues

LIANG Qun-tao, WEI Zheng

(InstituteofGlycobiochemistry,FuzhouUniversity,Fuzhou350002,China)

heparin; tetrasaccharide;N-unsubstituted disaccharide; liquid chromatography-ion trap/time-of-flight mass spectrometry (LC/MS-IT-TOF); fragmentation pattern

2015-12-21;

2016-03-02

國(guó)家自然科學(xué)基金(21343013)資助

梁群燾(1981—)，男(漢族)，福建龍巖人，博士研究生，分析化學(xué)專業(yè)。E-mail: 43415162@qq.com

魏 崢(1969—)，女(漢族)，福建福州人，教授，從事糖生物化學(xué)研究。E-mail: zheng0wei@hotmail.com

時(shí)間：2016-07-05；

http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20160705.1353.022.html

O657.63

A

1004-2997(2016)06-0492-12

10.7538/zpxb.youxian.2016.0027