王恩鵬，齋藤哲男，孫 巖，陳長寶，劉淑瑩

(1.長春中醫(yī)藥大學，吉林省人參科學研究院，吉林 長春 130117；2.新瀉藥科大學應用生命科學研究院，日本 新瀉市 956-8603)

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高分離快速液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法檢測人參皂苷Re在大鼠體內(nèi)的分布

王恩鵬1，齋藤哲男2，孫 巖1，陳長寶1，劉淑瑩1

(1.長春中醫(yī)藥大學，吉林省人參科學研究院，吉林 長春 130117；2.新瀉藥科大學應用生命科學研究院，日本 新瀉市 956-8603)

建立了高分離快速液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜(RRLC-Q-TOF MS)法檢測大鼠尾靜脈注射人參皂苷Re(G-Re)后，不同組織(心、肝、脾、肺、腎、腦)中G-Re的分布情況。樣本經(jīng)蛋白沉淀處理，Supelco Ascentis?Express C18色譜柱(50 mm×3.0 mm×2.7 μm)分離，采用含0.1%甲酸的水溶液(A)-乙腈(B)為流動相，梯度洗脫，以人參皂苷Rc(G-Rc)作為內(nèi)標，在電噴霧負離子模式下檢測。結果表明：組織勻漿標準曲線的線性范圍為10～20 000 μg/L，線性關系良好(r>0.99)，最低檢出限(S/N=3)為3 μg/L，最小定量限為10 μg/L；準確度、日內(nèi)和日間精密度、提取回收率均符合生物樣品的分析要求。大鼠尾靜脈注射20 mg/kg G-Re溶液后，在大鼠體內(nèi)不同組織中均能檢測到G-Re，主要分布在肺、脾、腎、心、腦、肝等器官，其中在肺中分布最多，在肝中分布最少。該方法簡單、靈敏、快速、檢出限低，適用于檢測人參皂苷Re在生物體內(nèi)的分布。

高分離快速液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜(RRLC-Q-TOF MS)；人參皂苷Re；靜脈注射；組織分布

人參系五加科植物，被稱為“百草之王”，在傳統(tǒng)中醫(yī)藥中占據(jù)重要地位。目前，人參在中國、韓國、日本、俄羅斯、美國和加拿大[1]等國家被廣泛種植，它作為一種補充食品深受人們歡迎[2-3]。人參皂苷Re是人參皂苷中的主要成分，具有良好的抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂等功效，對于缺血性心律失常、體液免疫和細胞免疫均有較好的作用[4-6]，其結構示于圖1。近年來，有許多關于人參皂苷Re的體內(nèi)代謝及藥代動力學研究的報道。如，Bae等[7]利用高效液相色譜法對人參皂苷Re的腸內(nèi)菌群代謝產(chǎn)物進行檢測，結果表明，G-Re在體內(nèi)代謝的主要初級產(chǎn)物為人參皂苷Rg1，其繼續(xù)水解可生成人參皂苷Rh1和Rf1。陳廣通等[8]利用HPLC-ESI-MS/MS法從口服G-Re大鼠的糞便中檢測出6個代謝產(chǎn)物，分別是20(S)-人參皂苷Rg2、20(S)-人參皂苷Rh1、20(R)-人參皂苷Rh1、人參皂苷F1、3-羰基人參皂苷Rh1和原人參三醇。彭纓等[9]采用HPLC法測定大鼠靜脈注射3種不同劑量(20、30、40 mg/kg)G-Re后的血藥濃度，結果表明，3組大鼠的藥代動力學參數(shù)成雙隔室型，在該劑量范圍內(nèi) G-Re的消除為線性動力學。近年來，人們在研究人參皂苷血漿藥物濃度的同時，其組織分布也受到重視，兩者結合能更好地闡明人參皂苷Re的體內(nèi)代謝過程，有效地評價生物利用度[10]。

圖1 人參皂苷Re的化學結構式

目前，人參皂苷的分析多采用高效液相色譜-紫外檢測(HPLC-UV)法，但該方法的分析時間長[11-12]，特別是分析生物樣本時需要30 min以上[13]。且由于生物樣品中內(nèi)源性干擾較多，影響了測定的準確度和靈敏度，液相色譜在沒有標準品的情況下，不利于目標成分的準確測定和確認。高分離快速液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜(RRLC-Q-TOF MS)法作為中藥生物樣品多成分復雜體系的分析工具，將快速液相色譜儀與高分辨質(zhì)譜儀連接，液相色譜部分采用高壓雙元泵，提高了流動相的壓力與流速，同時使用2.7 μm粒徑填料的色譜柱，可明顯加快分析速度。與常規(guī)的HPCL-UV相比，該方法具有準確度好、專屬性強、靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點[14-18]，能夠提高生物樣品的分析效率，現(xiàn)已被廣泛用于藥物鑒定、代謝組學、藥代動力學等領域的研究[11-12,19-21]。

本研究擬采用RRLC-Q-TOF MS法考察大鼠靜脈注射人參皂苷Re后的組織分布特征，并對其進行專屬性、線性范圍及檢測限、精密度與準確度、提取回收率、檢測限和穩(wěn)定性的考察，旨為進一步開發(fā)利用人參皂苷Re奠定基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200系列RRLC系統(tǒng)、Agilent 6520 Q-TOF質(zhì)譜儀：美國Agilent公司產(chǎn)品，配有ESI離子源和Mass Hunter數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；WS2-261-79型電熱恒溫水浴箱：北京長安科學儀器廠產(chǎn)品；高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司產(chǎn)品；DY89-Ⅱ型電動玻璃勻漿機：寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；超低溫冰箱：美國Thermo公司產(chǎn)品；MTN-2800D型氮吹儀：天津奧特塞恩斯儀器有限公司產(chǎn)品。

人參皂苷Re、Rc標準品(色譜級，純度>98%)：購自吉林大學藥學院；乙腈(色譜級)：美國Tedia公司產(chǎn)品；甲酸(色譜級)：美國Sigma公司產(chǎn)品；超純水：由美國Millipore公司的Milli-Q系統(tǒng)制得。

1.2 實驗條件

1.2.1 色譜條件 Supelco Ascentis?Express C18 HPLC色譜柱(50 mm×3.0 mm×2.7 μm)；流動相：A為含0.1%甲酸的超純水，B為乙腈；梯度洗脫：0～15 min、20%～40%B，15～20 min、40%～50%B，20～22 min、50%～100%B，22～25 min、100%B；柱溫35 ℃；流速0.3 mL/min；進樣量5 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧負離子電離模式，氣體溫度350 ℃，干燥氣流速9 L/min，噴霧氣壓276 kPa，毛細管電壓3.5 kV，裂解電壓175 V，錐孔電壓65 V，質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 000。樣品測試前，使用調(diào)諧液校正質(zhì)量軸。

1.3 溶液配制和樣品處理

1.3.1 標準溶液和內(nèi)標溶液的配制 精密稱取1.00 mg人參皂苷Re標準品，用甲醇稀釋至1 mL，配制成濃度為1 g/L的母液；然后用甲醇稀釋成濃度為1、10、100 mg/L的工作液。精密稱取1.00 mg人參皂苷Rc標準品，用甲醇定容至2 mL，配制成濃度為0.5 g/L的內(nèi)標溶液。

1.3.2 標準曲線的繪制 分別取100 μL空白大鼠的組織(心、肺、脾、腎、腦、肺)勻漿清液于1.5 mL Eppendorf管中。向每個樣品中加入不同質(zhì)量的人參皂苷Re，配制成濃度分別為10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000、20 000 μg/L的系列標準溶液；加入10 μL 1 g/L人參皂苷Rc作為內(nèi)標，用移液槍混勻，再加入300 μL甲醇，渦旋5 min，以13 000 r/min離心10 min，取上清液；經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，進樣檢測。以人參皂苷Re濃度為橫坐標x，G-Re與G-Rc的峰面積比值(A/Ai)為縱坐標y，進行線性回歸，繪制標準曲線。

1.3.3 動物實驗 25只雄性Wistar大鼠，體重(200±30) g，動物合格證號：SCXK-(吉)2011-0007，由長春生物制品有限公司動物中心提供。在標準環(huán)境下(濕度(50±10)%，溫度(25±2) ℃，12 h 晝夜循環(huán))進食進水，實驗前禁食12 h。

1.3.4 樣品的采集與制備 將25只大鼠隨機分為5組，其中1組為空白對照組，其余4組分別在尾靜脈注射20 mg/kg人參皂苷Re，在0.5、1、2、4、8 h后處死，取心、肝、脾、肺、腎、腦等臟器，以蒸餾水洗凈，稱其質(zhì)量；按質(zhì)量-體積比1∶5向各組織中加入生理鹽水，冰上勻漿后，置于預置好的4 ℃高速冷凍離心機內(nèi)，以3 000 r/min離心10 min，取上清液于凍干機內(nèi)凍干；加入1 mL甲醇，渦旋5 min，超聲溶解15 min，轉(zhuǎn)移至1.5 mL Eppendorf管內(nèi)，置于預置好的4 ℃高速冷凍離心機內(nèi)，以13 000 r/min離心10 min，取上清液；45 ℃下氮氣吹干，向每個樣品中加入10 μL 1 g/L人參皂苷Rc內(nèi)標溶液，用流動相定容至1 mL，制成濃度為10 mg/L的溶液；經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，置于4 ℃冰箱中，待測。

2 結果與討論

2.1 專屬性考察

以大鼠的肺臟組織為例，在電噴霧負離子模式下，其總離子流圖示于圖2。通過比較供試空白組織色譜圖、向空白組織中加入待測物和內(nèi)標物后得到的總離子流圖(TIC)、提取離子流圖(EIC)和給藥后不同時間測得的色譜圖，發(fā)現(xiàn)組織中所含內(nèi)源性物質(zhì)不干擾被測物和內(nèi)標物的測定，被測物峰形良好；在1.2.1和1.2.2節(jié)條件下，G-Re和內(nèi)標G-Rc的保留時間分別為 6.956 min和13.410 min。

2.2 線性范圍及檢測限

大鼠組織樣本的線性范圍和標準曲線列于表1?？梢钥闯觯涸摲椒ǖ木€性關系良好(r>0.99)，以S/N≥3計算方法的最低檢出限(LLOD)為3 μg/L。

注：a.空白大鼠肺臟總離子流圖；b.向空白組織中加入G-Re與內(nèi)標物的總離子流圖；

表1 大鼠組織樣本的標準曲線，相關系數(shù)和線性范圍

Table 1 Standard calibration curves,correlation coefficients and liner ranges of G-Re in rats tissue samples

組織樣本線性回歸方程相關系數(shù)(r)線性范圍/(μg/L)心y=0.0283x—0.02730.999310～20000肝y=0.0322x—0.01650.997110～20000脾y=0.0449x—0.05040.996910～20000肺y=0.0249x+0.03870.997610～20000腎y=0.0219x+0.01580.998610～20000腦y=0.0284x—0.02860.999410～20000

2.3 精密度與準確度

按1.3.2節(jié)方法分別配制G-Re各組織勻漿液高、中、低3個濃度(3、30、300 μg/L)的質(zhì)量控制(QC)樣品，每個濃度進行5樣本分析，連續(xù)測定3 d，為保持實驗條件一致，標準曲線的測定與上述樣品測定同時進行。根據(jù)當日標準曲線計算QC樣品濃度(C1～C3)，與配制濃度(C1′～C3′)對照，將QC樣品的結果進行計算，通過每一濃度的2種處理方法的濃度比值(C/C′)計算回收率，得出方法準確度，通過計算二者的濃度相對標準偏差得出方法的精密度。方法的準確度和精密度列于表2。結果表明：G-Re在各組織勻漿液中的日內(nèi)和日間精密度RSD均小于20%，準確度在90.0%～110.0%范圍內(nèi)。

表2 質(zhì)量控制樣品的日內(nèi)、日間精密度和準確度(n=5)

2.4 提取回收率

按1.3.2節(jié)方法分別配制G-Re各組織勻漿液高、中、低3個濃度的QC樣品，每個濃度進行5樣本分析，連續(xù)測定3 d，為保持實驗條件一致，標準曲線的測定與上述樣品測定同時進行。根據(jù)當日標準曲線計算QC樣品濃度，與配制濃度對照，將QC樣品的相應峰面積記為A1；另取各空白組織勻漿液，離心后得上清液，分別加入上述低、中、高濃度的標準溶液(每個濃度進行3樣本分析)進樣分析，獲得相應的峰面積值A2；以每一濃度的2種處理方法的峰面積比值(A1/A2)計算提取回收率。以肺勻漿液為例，提取回收率分別為(91.6±1.0)%、(90.9±3.9)%、(93.2±2.3)%，內(nèi)標(IS)回收率為(98.2±1.1)%。

2.5 穩(wěn)定性考察

按1.3.2節(jié)方法分別配制G-Re各組織勻漿液高、中、低3個濃度的QC樣品，每個濃度進行3樣本分析。分別將樣品在室溫(約20 ℃) 下放置 6 h、4 ℃下冷藏8 h、-20 ℃凍融循環(huán)3次，經(jīng)處理后進樣測定，考察大鼠的各個組織勻漿液中G-Re在室溫、冷藏、反復凍融條件下的穩(wěn)定性。以每一濃度3樣本分析，3種情況下得到的G-Re峰面積與時間點的偏差均在15%以內(nèi)，說明各組織勻漿液中的待測物穩(wěn)定性良好。

2.6 組織分布考察

大鼠尾靜脈注射20 mg/kg G-Re溶液后，在大鼠體內(nèi)不同時間點(0.5、1、2、4、8 h)各組織中G-Re的分布情況示于圖3。結果表明：在心、肝、脾、肺、腎、腦等6種組織器官中均能檢測到G-Re，G-Re在各組織中的分布迅速且具有不均衡性，其含量排序為：肺>脾>腎>心>腦>肝。

圖3 大鼠尾靜脈注射20 mg/kg G-Re后，G-Re在各組織中的濃度變化

3 結論

本研究建立了RRLC-Q-TOF MS法測定人參皂苷Re在大鼠體內(nèi)的分布，該方法簡便快速、專屬性強、靈敏度高、分析效率好，可彌補人參皂苷類物質(zhì)在紫外吸收差、檢測限值高的缺陷。RRLC液相色譜儀結合2.7 μm粒徑填料色譜柱的使用，提高了色譜的分離效率，加快了分析速度。質(zhì)譜檢測采用電噴霧負離子電離模式，在尾靜脈注射G-Re大鼠的6種主要組織器官中均能檢出G-Re，不同組織樣本中的G-Re定量范圍在10～20 000 μg/L之間。該方法適用于生物樣品中人參皂苷類成分的高通量分析。

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Tissue Distribution of Ginsenoside Re in Rats by Rapid Resolution Liquid Chromatography Coupled With Quadrupole-Time-of Flight Mass Spectrometry

WANG En-peng1, SAITO Tetsuo2, SUN Yan1, CHEN Chang-bao1, LIU Shu-ying1

(1.JilinGinsengAcademy,ChangchunUniversityofChineseMedicine,Changchun130117,China;2.DepartmentofAppliedLifeSciences,NiigataUniversityofPharmacy&AppliedLifeSciences,Higashijima265-1,Niigata956-8603,Japan)

A method of rapid resolution liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of flight mass spectrometry (RRLC-Q-TOF MS) was established to investigate the distribution of ginsenoside Re (G-Re) in rat various tissues (heart, liver, spleen, lung, kidney and brarin) after a single administration by intravenous injection. The biological samples were prepared by protein precipitation. Chromatographic separations was achieved on a Supelco Ascentis?Express C18 column (50 mm×3.0 mm×2.7 μm) with a mobile phase consisting of solvent A (0.1% formic acid in water) and solvent B (acetonitrile) at a flow rate of 0.3 mL/min. Gradient elution was as follows: 0-15 min, 20%-40%B; 15-20 min, 40%-50%B; 20-22 min, 50%-100%B. Ginsenoside Rc (G-Rc) was used as internal standard (IS). All mass spectrometric experiments were performed on RRLC-Q-TOF MS equipped with an electrospray ionization (ESI) source operated in negative mode. The result shows that the calibration curve is linear in the range of 10-20 000 μg/L for tissue homogenates (r>0.99), the lower limit of detection (LLOD) is 3 μg/L, and the lower limit of quantification (LLOQ) is 10 μg/L. The accuracy, intra-day, inter-day precision and recovery ratio can meet the requirements of the biological samples analysis. As a result, G-Re could be widely distributed in organizations with 20 mg/kg solution by caudal vein injection, which could be detected in different organs and distributed mainly in the lung, spleen, kidney and heart. Lung had a highest affinity to G-Re, which was not easy to pass through the blood-brain barrier and hard to accumulate. This method is simple, sensitive and rapid, which is suitable for analyzing ginsenosides Re in vivo.

rapid resolution liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of flight mass spectrometry (RRLC-Q-TOF-MS); ginsenoside Re; intravenous injection; tissue distribution

2015-12-30;

2016-04-08

吉林省教育廳“十二五”科學技術研究項目(20150344)；長春市科技局重大科技攻關項目(14KG057)資助

王恩鵬(1983—)，男(漢族)，吉林人，助理研究員，從事中藥化學研究。E-mail: robbinwang913@163.com

劉淑瑩(1943—)，女(漢族)，黑龍江人，教授，從事中藥化學和有機質(zhì)譜學研究。E-mail: syliu19@yahoo.com.cn

時間：2016-09-01；

http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20160901.1500.002.html

O657.63

A

1004-2997(2016)06-0526-07

10.7538/zpxb.youxian.2016.0038