劉圣金，吳露婷，吳德康，王 瑞，喻 斌，王宇華，劉 培，楊文國

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)信息技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

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礦物藥青礞石對PTZ點燃癲癇大鼠腦組織中氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響

劉圣金1，吳露婷1，吳德康1，王 瑞1，喻 斌1，王宇華1，劉 培1，楊文國2

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)信息技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

建立了超高效液相色譜-三重四極桿-線性離子阱質(zhì)譜(Qtrap-UPLC-MS/MS)法同時測定大鼠腦組織中4種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)，研究了礦物藥青礞石原藥材粉末、水煎液、藥渣對戊四氮(Pentylenetetrazol，PTZ)點燃癲癇模型大鼠腦組織中氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響。在ESI+電離模式下，采用多反應(yīng)監(jiān)測掃描方式測定腦組織(皮層，海馬)中谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、天冬氨酸(Asp)及γ-氨基丁酸(GABA)的含量。結(jié)果表明：4種氨基酸的線性關(guān)系良好，精密度、準確度均符合生物樣品的分析要求。大鼠給予青礞石不同樣品后，腦組織皮層和海馬中興奮性神經(jīng)遞質(zhì)Glu、Asp水平顯著降低。與模型組相比，皮層中Gly占氨基酸總含量的百分比均增加，Asp/Gly值、Glu/Gly值均降低；海馬中，各組Glu、Asp、Gly、GABA的濃度均降低。這說明，礦物藥青礞石能有效降低PTZ點燃大鼠腦內(nèi)興奮性氨基酸遞質(zhì)含量，調(diào)節(jié)皮層和海馬區(qū)Gly含量。

超高效液相色譜-三重四極桿-線性離子阱質(zhì)譜(Qtrap-UPLC-MS/MS)；礦物藥；青礞石；癲癇；氨基酸遞質(zhì)；海馬；皮層

青礞石(Chloriti Lapis)為變質(zhì)巖類黑云母片巖(Biotite Schist)或綠泥石化云母碳酸鹽片巖(Mica Carbonate Schist by Chloritization)，是一種主要含K、Mg、Fe、Al等元素的硅酸鹽[K(Mg·Fe)2(A1Si3O10)(OH, F)2]，其中Si、Fe、Mg、Al、Ca、K、Na等7種元素為主要成分，累積貢獻率達到90.700%，此外尚含Ti、Mn、Zn、V、Co、Sn、Ni、P等多種元素[1-2]。青礞石是常用礦物藥之一，性甘、咸、平，歸肺、心、肝經(jīng)，具有墜痰下氣、平肝鎮(zhèn)驚之功效[3]，臨床上常用于治療癲癇疾病。近年來，已有文獻對青礞石的成分、質(zhì)量控制、炮制工藝及藥理作用等方面的研究進行了系列報道[2,4-6]。

癲癇是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，癲癇的發(fā)生是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮與抑制間的不平衡導(dǎo)致的[7]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的氨基酸遞質(zhì)分為興奮性與抑制性兩類。其中，谷氨酸(glutamic acid, Glu)和天冬氨酸(aspartic acid, Asp)是腦部重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)；γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)，甘氨酸(glycine, Gly)是腦部重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[8]。因氨基酸無紫外吸收，故多采用鄰苯二醛(OPA)柱前衍生HPLC法結(jié)合熒光檢測器或其改良法進行測定[9-10]，但該方法耗時長，且氨基酸熒光衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定。超高效液相色譜-三重四極桿-線性離子阱質(zhì)譜法(Qtrap-UPLC-MS/MS)測定氨基酸具有對待測物分離要求低、用量少、操作簡單、且無需衍生化處理等優(yōu)點。

本研究擬采用Qtrap-UPLC-MS/MS法測定大鼠腦組織中4種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)，并對神經(jīng)遞質(zhì)含量或比例變化進行檢測，以期為探討青礞石治療癲癇的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與設(shè)備

Qtrap 5500 串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀：美國AB Sciex公司產(chǎn)品；LC-20AD XR型液相色譜儀：日本Shimadzu公司產(chǎn)品；Bioprep-24生物樣品均質(zhì)儀：杭州奧盛儀器公司產(chǎn)品；AllegraTMX-22R型冷凍離心機：德國BeckMan公司產(chǎn)品；MDF-U32V(N)型超低溫保存箱：日本SANYO公司產(chǎn)品；KQ-500型超聲儀：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；JE2002型電子天平：上海浦春計量儀器有限公司產(chǎn)品；MS105DU型十萬分之一電子天平：梅特勒托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品。

1.2 樣品與試劑

青礞石藥材(批號：20140412)：由亳州礦石專營店提供，經(jīng)南京大學(xué)地球科學(xué)與工程學(xué)院孔慶友教授鑒定為黑云母片巖Biotite Schist；卡馬西平片(國藥準字H11022279)：北京諾華制藥有限公司產(chǎn)品；戊四氮(批號1001603974)，γ-氨基丁酸(GABA)：美國Sigma 公司產(chǎn)品；谷氨酸(Glu)：Camycal公司產(chǎn)品；甘氨酸(Gly)、天冬氨酸(Asp)：美國Amresco公司產(chǎn)品；乙腈(質(zhì)譜純)：德國Merck公司產(chǎn)品；對照品含量均不小于99%；水為超純水；其他試藥均為市售分析純。

1.3 實驗動物

清潔級雄性SD大鼠：由上海杰思捷實驗動物有限公司提供，合格證編號：2010002600592，共90只，體重150～170 g。購回大鼠后，在適宜條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，自由飲食。

1.4 動物模型的建立

PTZ點燃癲癇大鼠模型的制備[11-13]：用生理鹽水將PTZ配制成1 g/100 mL溶液[14]，每日固定時間給大鼠腹腔注射PTZ溶液，劑量按亞致痙量35.0 mg/kg[15]標準進行造模，持續(xù)4周；停藥1周后，再用相同劑量PTZ測試，凡顯示連續(xù)5次Ⅱ級或Ⅱ級以上驚厥的大鼠被認為達到了點燃標準[16]。采用Racine[17]標準對大鼠癲癇性發(fā)作進行分級：0級為無抽搐發(fā)作；Ⅰ級為面部抽搐和孤立性肌痙攣；Ⅱ級為全身性痙攣抽搐；Ⅲ級為全身性痙攣呈無明顯間歇的癲癇持續(xù)狀態(tài)或抽搐致死；Ⅳ級為全身性強直痙攣抽搐，伴站立和跌倒；Ⅴ級為同Ⅳ級反復(fù)發(fā)作呈無明顯間歇的癲癇持續(xù)狀態(tài)或抽搐致死。其中，大鼠若出現(xiàn)持續(xù) V 級發(fā)作，需給予1 mL 7%水合氯醛緩解發(fā)作。

1.5 給藥樣品的制備

青礞石原藥材樣品的制備：將青礞石藥材在瑪瑙研缽中磨成細粉后過藥典6號篩，用PEG400[18]調(diào)勻，使每10 mL PEG400中含5 g青礞石粉。

青礞石水提液樣品的制備：取青礞石藥材置于煎煮容器內(nèi)，第一次加入10倍量水，煮沸1.5 h后用紗布過濾，所得藥液為頭煎藥液；向過濾后的藥渣中加入8倍量水繼續(xù)加熱，煮沸1 h后用紗布過濾，所得藥液為二煎藥液；將兩次煎藥液合并，濃縮至每10 mL藥液相當(dāng)于5 g生藥，即為低劑量水煎液，濃縮至每5 mL藥液相當(dāng)于5 g生藥，即為高劑量水煎液。

青礞藥渣樣品的制備：將水煎后的青礞石藥渣烘干，采用與青礞石原藥材相同的制備方法制得藥渣樣品。

陽性藥卡馬西平樣品的制備：用生理鹽水配制每100 mL 含2 g卡馬西平的溶液。

1.6 分組及給藥

將生理鹽水處理過的大鼠作為空白對照組(CG)；造模成功的大鼠隨機平均分為8組，即卡馬西平組(PG)、原藥材高劑量組(PH)、原藥材低劑量組(PL)、藥渣高劑量組(RH)、藥渣低劑量組(RL)、藥液高劑量組(WH)、藥液低劑量組(WL)、模型對照組(MG)。按照人和動物體表面積折算等效劑量，CG、PG、PH、PL、RH、RL、WH、WL和MG組分別予以5、5、4、1、4、1、5、2.5、5 mL/kg灌胃。連續(xù)灌胃給藥4周，每周稱量2次體重，并根據(jù)體重調(diào)整用藥劑量。

1.7 實驗條件

1.7.1 色譜條件 色譜柱：XBridge Amide(2.1 mm×50 mm×3.5 μm)；流動相：A相為乙腈，B相為6 mmol/L乙酸銨(含0.1%冰醋酸)；梯度洗脫程序：0～3 min、98%B，3～6 min、98%～85%B，6～9 min、85%～70%B，9～12 min、70%～50%B，12～13 min、50%～98%B，13～15 min、98%B；柱溫40 ℃；流速0.8 mL/min；檢測波長254 nm；進樣量1 μL。

1.7.2 質(zhì)譜條件 Turbo Spray離子源，ESI+電離模式，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)采集方式，離子化溫度550 ℃，噴霧電壓5 500 V，霧化氣(GS1)流速55 L/min，輔助氣(GS2)流速55 L/min，氣簾氣流速35 L/min。用于定量的離子分別為：Glu母離子m/z148，子離子m/z84；Gly母離子m/z76，子離子m/z30；Asp母離子m/z134，子離子m/z74；GABA母離子m/z104，子離子m/z8。

1.7.3 標準儲備液的配制 取4種氨基酸對照品各100 mg，精密稱定，分別置于100 mL容量瓶中，用純水溶解并稀釋至刻度，得4種氨基酸標準品儲備液。

1.7.4 標準曲線及線性范圍 取不同體積的各氨基酸標準儲備液，用超純水稀釋并定容至10 mL容量瓶中，得一系列濃度梯度的混合對照品溶液，詳情列于表1。以峰面積y對濃度x(mg/L)進行線性回歸，結(jié)果列于表2。

表1 不同濃度梯度的氨基酸標準品在10 mL容量瓶中的加入量

表2 各種氨基酸的標準曲線及線性范圍

1.7.5 海馬、皮層樣品的處理 大鼠冰上斷頭取腦，分離皮層及海馬，在冷生理鹽水(4 ℃)中洗去血液，用濾紙吸干水分，稱其質(zhì)量；按料液比1∶9加入0.4 mol/L高氯酸沉淀蛋白，勻漿機勻漿，徹底混勻組織液；以12 000 r/min低溫離心15 min，取上清液，于-80 ℃冰箱保存，待測。測定前用稀氨水調(diào)至pH中性，過0.45 μm微孔濾膜。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 專屬性實驗 精密量取1.7.3節(jié)配制的標準品儲備液適量，制成適當(dāng)濃度的混標溶液，在1.7.1和1.7.2節(jié)條件下檢測，并與腦組織樣本的色譜圖進行比較，結(jié)果示于圖1。可見，各色譜峰的保留時間在7～8 min之間，無雜質(zhì)干擾，峰型良好。

2.1.2 精密度實驗 日內(nèi)精密度：取同一混合對照品溶液，于同一天不同時間段每隔2 h進樣1次，連續(xù)進樣6次，計算得Glu、Asp、Gly和GABA峰面積的RSD分別為3.29%、3.25%、2.88%、2.41%。

日間精密度：取同一混合對照品溶液，于第1、2、3、4、5天分別進樣，計算得Glu、Asp、Glyp和GABA峰面積的RSD分別為3.19%、2.63%、3.04%、2.25%。

2.1.3 準確度實驗 取同一組織勻漿，按1.7.5節(jié)條件處理腦樣品，平行制備5份樣品，進行LC-MS/MS分析，計算得皮層樣品和海馬樣品的Glu、Asp、Gly、GABA峰面積的RSD分別為1.47%、1.61%、3.47%、2.39%和4.36%、1.87%、2.11%、3.14%，均符合生物樣品的分析要求。

2.1.4 穩(wěn)定性實驗 取2.1.2節(jié)配制的同一混合對照品溶液，于4 ℃保存，分別在0、6、12、24 h進樣分析。結(jié)果表明，在4 ℃條件下，樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。取1.7.5節(jié)的皮層及海馬樣品各3份，于-80 ℃保存，每3周測定1份，比較各種氨基酸在不同時間點的含量變化。結(jié)果表明，保存于-80 ℃的樣品較穩(wěn)定，在2個月內(nèi)無明顯降解。

2.2 數(shù)據(jù)處理與分析

注：A.對照品；B.皮層樣品；C.海馬樣品；1.Glu；2.Gly；3.Asp；4.GABA

2.2.2 測定結(jié)果 在皮層中，與MG組比較，其他各組Gly含量占總氨基酸含量的比例明顯升高，其中CG和PG組具有極顯著性差異(P<0.01)，RH、RL組具有顯著性差異(P<0.05)；Asp/GLy含量明顯降低，其中CG、PG及PH組具有極顯著性差異(P<0.01)，RL、WH和WL組具有顯著性差異(P<0.05)；Glu/GLy含量明顯降低，其中CG、PG、RH和RL組具有極顯著性差異(P<0.01)，WH組具有顯著性差異(P<0.05)；PH和PL組具有明顯的量效關(guān)系，結(jié)果列于表3。

在海馬中，與MG組比較，其他各組Glu濃度均降低，其中RH、RL、WH和WL組具有極顯著差異(P<0.01)；Asp濃度均降低，其中PG組具有極顯著差異(P<0.01)，CG、PH、RH和RL具有顯著性差異(P<0.05)；Gly濃度均降低，其中CG、PG、PH和RL組具有極顯著差異(P<0.01)，RH和WH組具有顯著性差異(P<0.05)；GABA濃度均降低，其中CG、PG、PH、PL、RH、RL和WL組具有極顯著差異(P<0.01)，WH組具有顯著性差異(P<0.05)；PH組對Asp、Gly、GABA的干預(yù)作用最強；PH和PL組具有明顯的量效關(guān)系，結(jié)果列于表4。

表3 皮層中，Gly、Asp/Gly和Glu/Gly水平

注： #表示Gly占氨基酸總含量的百分比； *表示P<0.05；**表示P<0.01

表4 海馬中，Glu、Asp、Gly及GABA含量

注： *表示P<0.05；**表示P<0.01

2.3 討論

2.3.1 供試品制備方法的優(yōu)化 選取甲醇、乙腈、高氯酸這3種蛋白沉淀劑進行比較，結(jié)果表明，高氯酸的沉淀能力較強。實驗對勻漿濃度(1∶4、1∶9和1∶19)進行了比較，結(jié)果顯示，在1∶9時響應(yīng)值最好，但色譜峰有分岔現(xiàn)象?？紤]到可能由于高氯酸的酸性過強，因此采用稀氨水調(diào)至pH中性，最終獲得了理想的峰型。2.3.2 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化 XBridge Amide分析柱可用于極性物質(zhì)的保留分析，耐受性較好，可取代硅膠氨基柱，能從根本上解決氨基鍵合硅膠柱不耐高pH值和鍵合相流失嚴重的問題，其性能大大優(yōu)于傳統(tǒng)的硅膠基質(zhì)氨基柱，且3.5 μm粒徑能提升柱效與分辨率。實驗選擇了信噪比較低的正離子模式，同時對質(zhì)譜參數(shù)中的母離子、子離子進行摸索，對裂解能量和碰撞能量進行優(yōu)化。

2.3.3 給藥樣品的選擇 為了考察不同給藥樣品的有效性和臨床上水煎后廢棄的藥渣是否仍具有藥效，以充分利用青礞石資源，本實驗設(shè)有粉末組、水煎液組及藥渣組。若粉末組最有效，水煎液組次之，藥渣組效果最不明顯，則說明青礞石的有效成分可通過水煎液煎出；若粉末組最有效，藥渣組次之，水煎液組效果最不明顯，則說明青礞石的有效成分不可通過水煎液煎出。

2.3.4 實驗結(jié)果分析 GABA通過Glu脫羧而成，經(jīng)GABA轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)而降解；Gly主要分布于中間神經(jīng)元，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的某些區(qū)域，Gly與GABA呈同步性釋放；而Asp與Glu同為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。文獻[19-20]報道了通過Glu/GABA值及Glu/Gly值考察興奮性與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)在腦內(nèi)的平衡關(guān)系，但鮮有Asp/Gly值的報道。本實驗中，青礞石能夠降低癲癇大鼠海馬中興奮性氨基酸遞質(zhì)Glu和Asp的含量，各組樣品均能提高癲癇大鼠皮層抑制性神經(jīng)遞質(zhì)Gly的比例，降低Asp/Gly值和Glu/Gly值。興奮性氨基酸含量的降低，說明青礞石可以通過降低腦內(nèi)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的毒性作用[21]來保護神經(jīng)元，從而抑制癲癇發(fā)作。對于皮層中Gly含量升高、海馬中Gly和GABA含量降低的現(xiàn)象，可能有以下原因：1) 雖然Gly通常被認為是抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[22-24]，但也有文獻[25-26]認為它是興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，由此猜想，Gly在皮層中可能作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，而在海馬中卻作為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)存在；2) Gly在皮層和海馬中給藥后的含量變化相反，這可能與皮層和海馬的不同功能定位有關(guān)[27]；3) 青礞石降低了癲癇大鼠海馬GABA的含量，可能與癲癇發(fā)生后的體內(nèi)代償反應(yīng)有關(guān)，這一現(xiàn)象與文獻[28-29]的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本研究建立了Qtrap-UPLC-MS/MS同時測定4種氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)的方法，分析了青礞石對戊四氮點燃癲癇大鼠腦組織(海馬、皮層)中氨基酸遞質(zhì)含量的影響。結(jié)果表明：青礞石藥材組、藥液組及藥渣組對抑制癲癇均有效。由此推測：青礞石抗癲癇作用機制是在降低興奮性神經(jīng)遞質(zhì)含量的同時，又提高了抑制性神經(jīng)遞質(zhì)在腦內(nèi)的含量。通過減少興奮性神經(jīng)遞質(zhì)對神經(jīng)組織的興奮毒性作用，維持了腦內(nèi)興奮性與抑制性氨基酸之間的平衡關(guān)系，抑制了異常放電，從而達到抗癲癇的作用。本研究可為礦物藥青礞石治療癲癇疾病的作用機制提供參考。

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Effect of Mineral Chinese Medicine Chloriti Lapis on Amino Acid Content in Brain Tissues of Pentylenetetrazol-Kindled Epileptic Rats

LIU Sheng-jin1, WU Lu-ting1, WU De-kang1, WANG Rui1, YU Bin1,WANG Yu-hua1, LIU Pei1, YANG Wen-guo2

(1.JiangsuCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization,SchoolofPharmacy,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China；2.InformationTechnologyCollege,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China)

The method of Qtrap-ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (Qtrap-UPLC-MS/MS) was established for simultaneous determination four amino acid neurotransmitters in rat’s brain tissue. The effects of powder, water decoction and dregs of Chloriti Lapis on amino acid content in PTZ-kindled epileptic rat’s brain tissue were studied. The contents of Glu, Gly, Asp and GABA in rat’s brain tissue (cortex and hippocampus) were detected by multiple reactions monitoring (MRM) scan mode in positive electrospray ionization (ESI+). The result shows that the four amino acids have good linear relationship, the RSDs of precision and accuracy conform to the requirements of analysis in biological samples. After rats were treated with different samples of Chloriti Lapis, excitatory neurotransmitter Glu, Asp in cerebral cortex and hippocampus decreased significantly. Compared with the model group, the content of Gly in cerebral cortex is increased in the percentage of total amino acidcontents, while the ratio of Asp/Gly and Glu/Gly are decreased. The contents of Glu, Asp, Gly and GABA in other groups display reduction in hippocampus compared with the model group. This shows that mineral Chinese medicine Chloriti Lapis can effectively reduce the excitatory amino acid contents in PTZ-kindled rat’s brain, and effectively regulate the content of Gly in the cortex and hippocampus.

Qtrap-ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (Qtrap-UPLC-MS/MS); mineral Chinese medicine; Chloriti Lapis; epilepsy; amino acid neurotransmitters; hippocampus; cortex

2016-02-24;

2016-05-09

國家自然科學(xué)基金項目(81303178)；江蘇省自然基金項目(BK20130957)；江蘇省高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目(二期)；江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程項目(PPZY2015A070)資助

劉圣金(1978—)，男(漢族)，安徽金寨人，講師，從事中藥鑒定及質(zhì)量標準和礦物藥研究。 E-mail: 13770653305@139.com

吳德康(1951—)，男(漢族)，江蘇宜興人，教授，從事中藥鑒定及質(zhì)量標準和礦物藥研究。E-mail: wudekang2008@126.com

時間：2016-09-01；

http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20160901.1515.006.html

O657.63

A

1004-2997(2016)06-0533-09

10.7538/zpxb.youxian.2016.0040