王子健，劉 穎，劉思燚，李 寧，盧建秋，張加余

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)北京中醫(yī)藥研究院，北京 100029；2.香港科技大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518057；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)圖書館，北京 100029)

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UPLC-HRMSn結(jié)合高能誘導(dǎo)裂解快速鑒定麥冬中高異黃酮類成分

王子健1，劉 穎1，劉思燚1，李 寧2，盧建秋3，張加余1

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)北京中醫(yī)藥研究院，北京 100029；2.香港科技大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518057；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)圖書館，北京 100029)

應(yīng)用UPLC-LTQ-Orbitrap法快速鑒定麥冬藥材中高異黃酮類化合物，考察不同高能誘導(dǎo)裂解(HCD)能量下高異黃酮的裂解情況，優(yōu)選特征碎片離子對(duì)進(jìn)行鑒定，并探索麥冬中高異黃酮類成分的裂解規(guī)律。應(yīng)用該方法在麥冬提取物中鑒定出68個(gè)高異黃酮類成分，其中包括26個(gè)高異黃酮成分，31個(gè)高異黃烷酮成分，11個(gè)高異黃酮糖苷類成分。結(jié)果表明，HCD模式能夠提供豐富穩(wěn)定的裂解碎片離子信息，結(jié)合UPLC-LTQ-Orbitrap技術(shù)能夠快速準(zhǔn)確地鑒定復(fù)雜組分中高異黃酮類成分，可為中藥系列成分研究提供有價(jià)值的方法參考。

麥冬；高異黃酮；高能誘導(dǎo)裂解(HCD)；UPLC-LTQ-Orbitrap；質(zhì)譜裂解

麥冬(Radix Ophiopogonis)是百合科沿階草屬植物麥冬(Ophiopogonjaponicus(L.f) KerGawl)的塊根，是常用中藥。高異黃酮類化合物是麥冬中特有的一類成分，已被證明具有廣泛的生物學(xué)活性，如雌激素樣作用、抗炎、抑制磷酸化等[1]。

目前，對(duì)麥冬中高異黃酮類成分的分析主要采用柱色譜法分離得到單一產(chǎn)物，然后經(jīng)核磁共振(NMR)鑒定以及HPLC-MS/MS分析。但提取分離過程耗時(shí)費(fèi)力，且不能整體表征麥冬中高異黃酮類成分。同時(shí)，由于麥冬藥材中含有的高異黃酮類成分?jǐn)?shù)量眾多、結(jié)構(gòu)類似、同分異構(gòu)體難以區(qū)分且含量相差懸殊，目前采用的液質(zhì)聯(lián)用方法對(duì)其物質(zhì)基礎(chǔ)研究尚不深入[2-5]，無論是色譜分離度還是質(zhì)譜碎片信息準(zhǔn)確度都有待進(jìn)一步提升[4-5]。

超高效液相色譜-質(zhì)譜法(UPLC-MS)結(jié)合了超高效液相色譜的快速分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度、高專屬性的檢測能力，現(xiàn)已成為中藥復(fù)雜體系成分結(jié)構(gòu)鑒定的常用方法[6-9]。線性離子阱-串聯(lián)靜電軌道阱(LTQ-Orbitrap)的高分辨質(zhì)譜儀可提供高分辨(分辨率最高達(dá)100 000)的相對(duì)分子質(zhì)量和豐富的碎片信息。同時(shí)，高能誘導(dǎo)裂解(higher energy collision induced dissociation, HCD)相對(duì)于常規(guī)的碰撞誘導(dǎo)裂解(collision induced dissociation, CID)可提供更穩(wěn)定的高能裂解方式，不會(huì)發(fā)生CID裂解中的低質(zhì)量碎片丟失(cut-off)效應(yīng)，一次高能碎裂反應(yīng)即可獲得化合物全面的碎片信息，可明顯提高化合物的鑒定效率[10]。

本工作通過對(duì)比不同水平裂解能量下的高分辨質(zhì)譜信息，優(yōu)化分析條件，并結(jié)合該類化合物的HCD質(zhì)譜裂解規(guī)律，對(duì)麥冬藥材中高異黃酮類成分進(jìn)行篩選和表征，希望為麥冬藥效成分的快速發(fā)現(xiàn)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

Accele 600 Pump高效液相色譜儀和LTQ-Orbitrap XL線性離子阱-串聯(lián)靜電軌道場質(zhì)譜儀：美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源(ESI)和Xcalibur 2.1工作站；KQ-250DE 型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；Millipore Synergy UV 型超純水機(jī)：美國Millipore公司產(chǎn)品；R200D型電子分析天平(十萬分之一)：德國 Sartorius公司產(chǎn)品。

1.2 藥材與試劑

麥冬藥材：購自北京同仁堂藥店，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)譚鵬副教授鑒定為百合科植物麥冬Ophiopogonjaponicus(Thunb.) Ker Gaw l. 的干燥塊根；高異黃酮對(duì)照品(5,7,4′-三羥基-6-甲基二氫高異黃酮、麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、甲基麥冬二氫高異黃酮A、5,7,2′-三羥基-4′-甲氧基-6,8-二甲基二氫高異黃酮和麥冬二氫高異黃酮E)：均為本實(shí)驗(yàn)室從麥冬藥材中分離而得，純度大于95%；甲醇、乙腈和甲酸：均為色譜純，美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水：Millipore超純水。

1.3 麥冬提取物的制備

稱取500 g麥冬藥材，粉碎成粗粉，加75%乙醇回流提取2次，合并得到的乙醇提取液，減壓濃縮至無醇味后，放置至室溫；將其注入NKA大孔吸附樹脂柱，水洗至無糖反應(yīng)，用80%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇，經(jīng)真空干燥后，即得麥冬提取物。

1.4 溶液的配制

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 分別稱取適量的上述標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱定，加入80%甲醇超聲溶解，配制成1 mg/L混合溶液。

1.4.2 供試品溶液的制備 精密稱取0.2 g麥冬提取物，加入25 mL 80%甲醇，超聲提取30 min，靜置冷卻后，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

1.5 實(shí)驗(yàn)條件

1.5.1 色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm×1.7 μm)；流動(dòng)相：A為0.05%甲酸-水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～7 min、25%～35%B，7～9 min、35%～37%B，9～12 min、37%B，12～30 min、37%～57%B，30～34.5 min、57%～65%B，34.5～36 min、65%～90%B；流速：0.3 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，負(fù)離子檢測模式；鞘氣和輔助氣均為氮?dú)猓兌?99%；鞘氣流速40個(gè)單位，輔助氣流速20個(gè)單位；碰撞氣為氦氣，純度>99.99%；電離源電壓：-4 kV；離子源溫度：350 ℃；毛細(xì)管電壓：-35 V；管透鏡電壓：-110 V；樣品采用傅里葉變換高分辨全掃描(FT)，質(zhì)量掃描范圍m/z150～1 500；檢測分辨率：30 000；二級(jí)質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴型掃描，選取一級(jí)豐度最高的3個(gè)色譜峰進(jìn)行HCD碎裂；HCD參數(shù)為：分辨率15 000，歸一化碰撞能量120、150單位。

2 結(jié)果與討論

2.1 高異黃酮類成分檢測條件的優(yōu)化

2.1.1 液相色譜條件的優(yōu)化 為了同時(shí)獲得良好的高異黃酮色譜峰形和質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)，采用0.05%甲酸作為流動(dòng)相改性劑。實(shí)驗(yàn)對(duì)比了甲醇-0.05%甲酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.05%甲酸溶液和乙腈-甲醇-0.1%甲酸溶液等不同流動(dòng)相體系對(duì)高異黃酮色譜分離效果的影響，從而優(yōu)化色譜分離條件，得到的麥冬中高異黃酮的總離子流圖示于圖1。

2.1.2 HCD裂解條件的優(yōu)化 碰撞能量對(duì)于產(chǎn)生碎片離子的種類和強(qiáng)度具有至關(guān)重要的作用。為了獲得豐富全面的高異黃酮碎片信息，提高鑒定精確度，實(shí)驗(yàn)以標(biāo)準(zhǔn)品作為研究對(duì)象，考察了不同碰撞能量(30、50、70、90、120、150、200單位)下母離子的碎裂狀態(tài)。結(jié)果表明：在較低碰撞能量(低于70單位)下，母離子幾乎未發(fā)生碎裂；當(dāng)碰撞能量處于70～150單位時(shí)，碎片離子的種類比較豐富，特征離子的相對(duì)豐度較高，可提供詳細(xì)的結(jié)構(gòu)信息；當(dāng)碰撞能量進(jìn)一步提高時(shí)，多數(shù)特征離子被過度碎裂，相對(duì)豐度降低，不利于結(jié)構(gòu)解析。因不同高異黃酮化合物的最優(yōu)碰撞能量并不相同，經(jīng)對(duì)比優(yōu)化，最終采用120、150單位碰撞能量下的碎片信息進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

圖1 麥冬中高異黃酮類成分的總離子流圖

2.2 高異黃酮HCD裂解規(guī)律的分析

高異黃酮是比異黃酮多1個(gè)亞甲基的特殊黃酮，結(jié)構(gòu)類型示于圖2。亞甲基的存在導(dǎo)致此處容易發(fā)生質(zhì)譜裂解反應(yīng)，從而產(chǎn)生失去B環(huán)的碎片離子，即高異黃酮最主要的特征離子[11]，據(jù)此可對(duì)A環(huán)及B環(huán)上的取代基類型及數(shù)量進(jìn)行快速推斷。在HCD模式下，高異黃酮不僅能產(chǎn)生上述診斷離子，而且母核上的取代基(如甲氧基)，以及A環(huán)本身也會(huì)發(fā)生裂解反應(yīng)。以標(biāo)準(zhǔn)品麥冬黃烷酮A為例，其分子式為C18H16O6，準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-的精確質(zhì)量數(shù)為m/z327.086 5，推斷其分子式為C18H15O6，誤差為-2.81×10-6。該離子經(jīng)HCD裂解產(chǎn)生碎片離子m/z193.049 6[C10H9O4]-、m/z192.042 3[C10H8O4]-、m/z164.047 6[C9H8O3]-、m/z136.016 8[C7H4O3]-。根據(jù)特征離子m/z193.049 6，可推斷B環(huán)上有1個(gè)亞甲二氧基，而A環(huán)上有2個(gè)羥基和1個(gè)甲基；m/z164.047 6是中性丟失C4位羰基的碎片離子，m/z136.016 8是m/z164.047 6的C環(huán)繼續(xù)裂解的產(chǎn)物，其裂解途徑示于圖3。高異黃酮會(huì)產(chǎn)生相差13 u的特征碎片離子[M-H-B-ring]-和[M-H-B-ring+CH]-，這可作為判斷高異黃酮取代基種類和數(shù)量的依據(jù)。當(dāng)含有甲氧基取代時(shí)，會(huì)產(chǎn)生中性丟失1個(gè)CH3(-15 u)的碎片離子，依據(jù)產(chǎn)生該碎片離子的數(shù)量可判斷化合物中甲氧基的數(shù)量；當(dāng)含有醛基取代時(shí)，則會(huì)在準(zhǔn)分子離子基礎(chǔ)上產(chǎn)生中性丟失1個(gè)CO(-28 u)的碎片離子，依此可判斷醛基的有無[12]。上述特征裂解碎片及裂解方式可為高異黃酮類成分的結(jié)構(gòu)鑒定提供依據(jù)。

圖2 高異黃酮類成分的結(jié)構(gòu)類型

圖3 麥冬黃烷酮A的 HCD裂解途徑推斷

2.3 高異黃酮類成分結(jié)構(gòu)的快速鑒定

參照文獻(xiàn)報(bào)道[1-5,11]，設(shè)定麥冬高異黃酮的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理參數(shù)：最大分子質(zhì)量誤差為3×10-6，C、H、O原子數(shù)目的范圍分別為16～29、12～36、3～14。結(jié)合得到的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)和多級(jí)質(zhì)譜碎片信息，共從麥冬提取物中快速鑒定出68個(gè)高異黃酮類成分。各化合物的保留時(shí)間，高分辨質(zhì)譜質(zhì)量數(shù)的理論值和實(shí)測值，誤差，以及在120、150單位下的HCD多級(jí)裂解碎片等詳細(xì)信息列于表1。

2.3.1 高異黃酮結(jié)構(gòu)鑒定 結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理參數(shù)和特征離子碎片信息，共鑒定出26個(gè)高異黃酮化合物。經(jīng)文獻(xiàn)[4-5，11]比對(duì)可以確定取代基位置的化合物有15個(gè)，未能確定取代基位置的化合物的取代基信息已于表1中列出。下面舉例說明高異黃酮的鑒定過程。

在負(fù)離子模式下，化合物22和25均產(chǎn)生m/z297.076 9[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，根據(jù)精確的相對(duì)分子質(zhì)量可推斷其分子式為C17H13O5，誤差為0.27×10-6。在HCD裂解過程中，m/z297.076 9均可產(chǎn)生m/z204.042 2[M-H-B-ring+CH]-、m/z191.034 5[M-H-B-ring]-的碎片離子，由此可推斷B環(huán)上有1個(gè)羥基取代，而A環(huán)上有2個(gè)羥基和1個(gè)甲基取代。根據(jù)色譜保留行為分析以及文獻(xiàn)報(bào)道[5]，將它們分別鑒定為5,7,4′-三羥基-8-甲基高異黃酮和5,7,4′-三羥基-6-甲基高異黃酮。

化合物53可產(chǎn)生m/z341.102 7[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，推斷其分子式為C19H17O6，誤差為-1.43×10-6。該化合物的HCD碎片離子m/z205.050 0[M-H-B-ring]-、m/z218.057 3[M-H-B-ring+CH]-分別為B環(huán)丟失后得到的，且進(jìn)一步產(chǎn)生了m/z326.077 9[M-H-CH3]-和m/z311.054 9[M-H-2CH3]-等碎片離子，說明其分子結(jié)構(gòu)中可能含有2個(gè)甲氧基。結(jié)合保留時(shí)間及相關(guān)文獻(xiàn)[5]，將其鑒定為5,3′-二羥基-7,4′-二甲氧基-6-甲基高異黃酮。

另外，在分析過程中還發(fā)現(xiàn)了一類含有醛基的高異黃酮，如化合物66產(chǎn)生m/z339.087 0[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，可推斷分子式為C19H15O6，誤差為-1.09×10-6。二級(jí)碎片離子m/z311.090 9[M-H-CO]-的產(chǎn)生表明其含有醛基，而m/z324.062 3[M-H-CH3]-表明其含有1個(gè)甲氧基，因此將其鑒定為6-醛基異麥冬黃酮B[5]。

2.3.2 高異黃烷酮結(jié)構(gòu)鑒定 結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理參數(shù)和特征離子碎片信息，共鑒定出31個(gè)高異黃烷酮化合物。經(jīng)文獻(xiàn)[4-5，11]比對(duì)可以確定取代基位置的化合物有22個(gè)，未能確定取代基位置的化合物的取代基信息列于表2。

在負(fù)離子模式下，化合物48產(chǎn)生m/z355.118 6[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，經(jīng)精確分子質(zhì)量比對(duì)，推斷其分子式為C20H19O6，誤差為-0.25×10-6。根據(jù)HCD裂解產(chǎn)生的m/z205.049 9[M-H-B-ring]-碎片離子，推斷B環(huán)上有1個(gè)亞甲二氧基取代，而依據(jù)m/z190.026 5[M-H-B-ring-CH3]-的碎片離子，可推斷A環(huán)有甲氧基取代。經(jīng)色譜保留行為及文獻(xiàn)比對(duì)[5-6]，將其鑒定為5-羥基-7-甲氧基-3′,4′-亞甲二氧基-6,8-二甲基高異黃烷酮。

化合物37產(chǎn)生m/z327.123 0[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，推斷其分子式為C19H19O5，誤差為-2.38×10-6。在HCD碎裂下產(chǎn)生m/z191.034 8碎片離子，據(jù)此推斷B環(huán)取代的可能性有甲氧基或羥基加甲基，而依據(jù)產(chǎn)生的m/z312.099 4[M-H-CH3]-、m/z297.076 5[M-H-2CH3]-碎片離子，進(jìn)一步推斷其含有2個(gè)甲氧基取代，故確定B環(huán)取代為甲氧基，結(jié)合文獻(xiàn)[5]將其鑒定為5-羥基-7,4′-二甲氧基-8-甲基高異黃烷酮。

2.3.3 高異黃酮類葡萄糖苷結(jié)構(gòu)鑒定 當(dāng)HCD碰撞能量為120單位，高異黃酮葡萄糖苷產(chǎn)生的碎片離子信息較少，主要為丟失一分子葡萄糖殘基產(chǎn)生[M-H-Glu]-；當(dāng)碰撞能量提高至150單位時(shí)，苷元進(jìn)一步裂解產(chǎn)生特征碎片離子，據(jù)此可以通過推斷它們的取代基分布情況鑒定這些糖苷類成分的結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)共鑒定出11個(gè)糖苷化合物，根據(jù)文獻(xiàn)及保留時(shí)間可以推斷苷元取代基位置的有6個(gè)，未能確定取代基位置化合物的苷元信息列于表2。

表1 麥冬提取物中高異黃酮類成分的HCD裂解信息及鑒定

Table 1 Characterizations of homoisoflavone in extract ofOphiopogonjaponicasby UPLC-LTQ-Orbitrap-HCD-MSn

序號(hào)tR/min分子式理論值(m/z)實(shí)測值(m/z)誤差/10-6HCD裂解碎片鑒定結(jié)果1*3.80C17H15O5299.0925299.09260.40193.0503,149.06075,7,4'三羥基-6-甲基-高異黃烷酮葡萄糖苷3.80C23H25O10461.1442461.14542.54193.0499,149.0603,165.0551,165.0188,164.0473,178.02642*3.91C17H15O5299.0925299.09250.10193.0504,149.06085,7,4'三羥基-6-甲基-高異黃烷酮葡萄糖苷3.91C23H25O10461.1442461.14542.60193.0503,149.0608,165.0192,119.0503,178.02693*4.09C18H17O6329.1031329.1028-0.76193.0502,149.0606,192.0425,164.0477-4.09C24H27O11491.1548491.15581.97193.0503,164.0477,149.0606,165,0553,178.02674*4.21C18H17O6329.1031329.1030-0.09193.0500,149.0607-4.21C24H27O11491.1548491.15643.22193.0499,164.0473,149.06045*4.28C17H13O5297.0769297.0768-0.13297.0761,191.03445,7,4'三羥基-8-甲基-高異黃酮葡萄糖苷4.28C23H23O10459.1286459.13003.20297.0761,191.0341,204.04266*4.88C17H13O5297.0769297.0768-0.13297.0761,191.0345,204.0424,165.0192,203.03415,7,4'三羥基-6-甲基-高異黃酮葡萄糖苷4.88C23H23O10459.1286459.12972.46297.0763,191.0347,204.04267*5.12C18H13O7341.0667341.06670.09311.0555,165.0192,147.0450,175.0397,295.0605,191.0345-5.12C24H23O12503.1184503.11992.92341.0658,313.0710,311.0555,165.0192,204.0424,295.0606,191.03478*5.31C18H13O7341.0667341.06670.00204.0424,191.0345,203.0346,175.0398,341.0654-9*5.49C17H15O5299.0925299.0924-0.20193.0503,149.06095,7,4'三羥基-6-甲基-高異黃烷酮葡萄糖苷5.49C23H25O10461.1442461.14593.58193.0504,299.0917,164.047710*5.60C18H17O6329.1031329.1028-0.94193.0503,314.0421,171.1027-5.60C24H27O11491.1548491.15633.09193.0503,192.0425,208.0374,164.0476,314.042111#5.67C16H11O6299.0561299.05620.43190.0264,299.0547,161.0239,189.0186,177.0187,189.0550,5,6,7,4'-四羥基-高異黃酮151.0033,147.0449,255.0652,213.054812*5.75C18H13O7341.0667341.06670.09204.0426,203.0347,175.0399,191.0348,341.0664,178.0634-13*5.86C18H17O5313.1082313.1080-0.38207.0658,192.0425,164.0477,191.0347-14*6.18C18H13O7341.0667341.06680.35311.0557,147.0451,165.0191,204,0424,191.0349,203.0348,178.0632-6.18C24H23O12503.1184503.11931.71341.0659,313.0711,311.0554,204.0425,165.0192,191.0346

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

注1.△表示經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)；#表示經(jīng)特征離子比對(duì)和查閱文獻(xiàn)；*表示經(jīng)特征離子推斷取代基種類及數(shù)量

2.m/z193.0503表示裂解位置在C3-C9之間掉落B環(huán)的特征離子[M-H-B-ring]-；m/z218.0571表示裂解位置在C9-C1′之間掉落B環(huán)的特征離子[M-H-B-ring+CH]-；m/z324.0623表示含有1個(gè)或多個(gè)甲氧基取代有-15 u或-30 u特征掉落的特征離子[M-H-CH3]-和[M-H-2CH3]-；m/z313.1066表示含有醛基有-28 u特征掉落的特征離子[M-H-CO]-

表2 未確定取代基位置的高異黃酮類化合物的鑒定

化合物1、2、9均產(chǎn)生m/z461.145 9[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，且在相同保留時(shí)間的位置產(chǎn)生m/z299.092 4[M-H-Glu]-的苷元碎片，由精確分子質(zhì)量推斷其分子式分別為C23H25O10和C17H15O5，誤差分別為2.54×10-6和0.40×10-6。糖苷和苷元經(jīng)HCD裂解均產(chǎn)生m/z193.050 3[M-H-Glu-B-ring]-的碎片離子，據(jù)此可推斷其苷元B環(huán)為羥基取代。由于3個(gè)化合物苷元的裂解碎片種類和相對(duì)豐度與標(biāo)準(zhǔn)品5,7,4′-三羥基-6-甲基高異黃烷酮基本相同，結(jié)合三者的色譜保留行為將其鑒定為5,7,4′-三羥基-6-甲基高異黃烷酮葡萄糖苷或其同分異構(gòu)體。

化合物5、6在相同的保留時(shí)間均產(chǎn)生了m/z459.129 7[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰，同時(shí)產(chǎn)生m/z297.076 8[M-H-Glu]-苷元碎片分子，經(jīng)精確分子質(zhì)量推斷，其分子式分別為C23H23O10和C17H13O5，誤差分別為2.46×10-6和-0.13×10-6。根據(jù)多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)可知，這兩個(gè)化合物均產(chǎn)生了m/z191.034 3[M-H-Glu-B-ring]-和m/z204.042 6[M-H-Glu-B-ring+CH]-的碎片離子峰，由此可以推斷它們的B環(huán)上有1個(gè)羥基取代，而A環(huán)上有2個(gè)羥基和1個(gè)甲基取代。結(jié)合化合物22和25的碎片離子分析，可推斷化合物5、6為化合物22和25的葡萄糖苷。因此，將化合物5鑒定為5,7,4′-三羥基-8-甲基-高異黃酮葡萄糖苷，化合物6鑒定為5,7,4′-三羥基-6-甲基-高異黃酮葡萄糖苷。

3 結(jié)論

本工作應(yīng)用UPLC-LTQ-Orbitrap技術(shù)結(jié)合高能誘導(dǎo)裂解模式對(duì)麥冬提取物中高異黃酮類成分進(jìn)行了快速鑒定。通過考察不同裂解能量對(duì)高異黃酮類成分的影響，優(yōu)化了最佳裂解條件，最終選擇120和150單位作為碰撞能量；歸納總結(jié)了高異黃酮類成分在上述碎裂能量下的HCD裂解規(guī)律和特征碎片離子，并據(jù)此對(duì)高異黃酮類成分的結(jié)構(gòu)及A、B環(huán)的取代模式進(jìn)行推斷。應(yīng)用該方法從麥冬提取物中鑒定出68個(gè)高異黃酮類成分的結(jié)構(gòu)，包括11個(gè)高異黃酮葡萄糖苷、26個(gè)高異黃酮、31個(gè)高異黃烷酮。結(jié)果表明，該方法能夠?qū)χ兴幹邢盗谐煞值慕Y(jié)構(gòu)進(jìn)行快速篩查和鑒定，可為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供方法參考。

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Rapid Identification of Homoisoflavonoids inOphiopogonjaponicasBased on UPLC-HRMSnCombined HCD Method

WANG Zi-jian1, LIU Ying1, LIU Si-yi1, LI Ning2, LU Jian-qiu3, ZHANG Jia-yu1

(1.BeijingInstitutionofChineseMedicine,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China;2.HKUSTShenzhenResearchInstitute,Shenzhen518057,China3.LibraryofBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Radix Ophiopogon, a kind of traditional Chinese medicine, is the root of LiliaceaeOphiopogonjaponicus(Thunb.) Ker Gaw l. Modern research demonstrates thatOphiopogonjaponicascan be used as a folk food medicine in free radical scavenging, reducing blood sugar, sedative hypnotic and anti-myocardial ischemia and arrhythmia, and so on. The major chemical compounds of this plant are mainly homoisoflavonoids, steroidal saponins and polysaccharides. According to the relevant reports, the homoisoflavonoids is a kind of specific compounds inOphiopogonjaponicus. However, due to the large number of different types of homoisoflavonoids in the herbal medicine, the structures are too similar to be distinguished from each other. Meanwhile, the differences of their relative contents inOphiopogonjaponicasare great. In this paper, the rapid separation ability of UPLC-LTQ-Orbitrap and the higher energy collision induced dissociation mode (HCD mode) were used to acquire high resolution fragment ion information and studied on the fragmentation patterns of homoisoflavonoids. The chromatographic separation ofOphiopogonjaponicusextract was used Waters Acuqity UPLCTMBEH C18 column, mobile phase was 0.05% formic acid in water and acetonitrile system, and the chromatographic conditions for the rapid separation were optimized. To avoid interference with other components and obtain the tandem mass spectrometry high content and low content data, a method based on parent ions detection list in the negative ion mode detection was established. Furthermore, the established method was helpful in investigating the dissociation pathways of homoisoflavonoids in different HCD cleavage energy and confirming the characteristic fragment ions for the identification. Meanwhile, 68 constituents attributed to homoisoflavonoids inOphiopogonjaponicasare finally identified, including 26 homoisoflavonoids, 31 homoisoflavanones, and 11 homoisoflavonoids glycosides. The results indicate that the HCD model can provide abundant and stable information of fragment ions, which can be adopted to quickly and accurately clarify the homoisoflavonoids in complex system. This study can provide an effective analytical method to explore the material basis of sequential constituents in traditional Chinese medicines.

Ophiopogonjaponicus; homoisoflavonoids；higher energy collision induced dissociation(HCD)；UPLC-LTQ-Orbitrap；mass fragmentation

2016-02-05;

2016-05-06

國家自然青年科學(xué)基金(81303206，81303189)；北京中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)課題(2015-JYB-JSMS043)資助

王子健(1988—)，男(漢族)，北京人，助理實(shí)驗(yàn)師，從事儀器分析方法開發(fā)研究。E-mail: helloffiresilver@gmail.com

張加余(1981—)，男(漢族)，山東人，副研究員，從事藥物分析研究。E-mail: zhangjiayu0615@163.com

盧建秋(1964—)，男(漢族)，黑龍江人，研究員，從事藥物分析研究。E-mail: lujq@vip.sina.com

時(shí)間：2016-09-01；

http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20160901.1531.012.html

O657.63

A

1004-2997(2016)06-0481-11

10.7538/zpxb.youxian.2016.0043