魏 霜，汪天杰，龍 陽(yáng)，周廣彪，林春貴，黃 帥，吳希陽(yáng)

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多重富集定量PCR（ME-qPCR）同時(shí)檢測(cè)4種食源性病原弧菌

魏 霜1,2，汪天杰3，龍 陽(yáng)4，周廣彪1，林春貴1，黃 帥1，吳希陽(yáng)2

（1汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東汕頭 515041；2暨南大學(xué)理工學(xué)院食品科學(xué)與工程系，廣州 510632；3廣州出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣州 510632；4湛江出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東湛江 524022）

【目的】溶藻弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、霍亂弧菌是4種重要的食源性病原弧菌，能夠造成人類多種疾病，建立同時(shí)檢測(cè)這4種食源性病原弧菌的檢測(cè)方法是保障食品安全的基礎(chǔ)。本研究旨在建立同時(shí)檢測(cè)溶藻弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、霍亂弧菌的多重富集定量PCR（multiplex enrichment quantitative PCR，ME-qPCR）方法，并含擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)用于指示PCR反應(yīng)的假陰性，創(chuàng)新一種高通量、高靈敏度、具備定量能力的檢測(cè)方法，為這4種食源性病原弧菌的檢測(cè)提供新方法。【方法】以細(xì)菌為擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)靶序列設(shè)計(jì)引物，并針對(duì)副溶血弧菌的、溶藻弧菌的、霍亂弧菌的、創(chuàng)傷弧菌的，分別設(shè)計(jì)內(nèi)、外2對(duì)特異性引物，首先將所有內(nèi)、外引物混合，進(jìn)行一個(gè)循環(huán)數(shù)較少（10—20 cycles）的高通量多重富集PCR將靶基因富集出來(lái)，由于循環(huán)數(shù)較少，各個(gè)基因得到均勻的擴(kuò)增，每個(gè)基因均有4種可能的產(chǎn)物，每1種產(chǎn)物均能作為第二輪巢氏熒光定量PCR的模板，這增加了靶基因從模板中被富集出來(lái)的概率，然后將產(chǎn)物稀釋后作為模板，利用內(nèi)引物分別進(jìn)行巢式熒光定量PCR檢測(cè)各個(gè)基因，最后根據(jù)擴(kuò)增曲線和熔融曲線分析結(jié)果。通過(guò)設(shè)置不同的第一輪多重富集PCR循環(huán)數(shù)（10、15和20個(gè)循環(huán)），優(yōu)化ME-qPCR第一輪循環(huán)數(shù)。采用14株標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA作為模板，評(píng)價(jià)ME-qPCR的特異性。并以4種弧菌基因組DNA混合物梯度稀釋的樣品（100、10、1、0.1、0.01和0.001 ng·μL-1）作為模板，對(duì)建立的ME-qPCR進(jìn)行靈敏度和定量能力的評(píng)價(jià)。并將該方法應(yīng)用于已分離到的69株疑似弧菌菌落的鑒定中，與傳統(tǒng)生理生化鑒定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比?！窘Y(jié)果】?jī)?yōu)化后，ME-qPCR的第一輪循環(huán)數(shù)確定為15，特異性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示該方法特異性強(qiáng)，靈敏度達(dá)0.001 ng，高于普通熒光定量PCR約1個(gè)數(shù)量級(jí)，并能有效指示PCR反應(yīng)的假陰性，且擁有與普通熒光定量PCR相同的定量能力，擴(kuò)增效率和R符合定量的要求；將建立的ME-qPCR方法應(yīng)用于69株疑似弧菌菌株的鑒定，24個(gè)綠色菌落為副溶血弧菌，22個(gè)黃色菌落為溶藻弧菌，1個(gè)黃色菌落為創(chuàng)傷弧菌，沒(méi)有檢出霍亂弧菌，其結(jié)果與生理生化鑒定結(jié)果一致?！窘Y(jié)論】該方法能夠定量、快速準(zhǔn)確地檢測(cè)副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌這4種食源性病原弧菌，靈敏度高，并能有效指示PCR反應(yīng)的假陰性，結(jié)果無(wú)需凝膠電泳，適用于食品中4種常見病原弧菌的快速篩檢。

霍亂弧菌；創(chuàng)傷弧菌；副溶血弧菌；溶藻弧菌；擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)；多重富集定量PCR

0 引言

【研究意義】弧菌屬（）為革蘭氏陰性菌，嗜鹽，廣泛存在于海水中，是引起魚、蝦等水產(chǎn)品疾病的重要病原菌[1-2]。其中，副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌同時(shí)也是重要的食源性病原弧菌[3-4]，對(duì)人類具有較強(qiáng)的致病性，例如霍亂弧菌能引起人腹瀉、嘔吐等病癥，曾經(jīng)在世界上多次爆發(fā)；溶藻弧菌也早在1979年就有報(bào)道稱其對(duì)人類的致病性，能夠引起中耳炎等疾病[5]，而這些弧菌常常存在于人類食用的海產(chǎn)品中，對(duì)海產(chǎn)品中這些弧菌的檢測(cè)、監(jiān)測(cè)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】弧菌的檢測(cè)主要包括生理生化鑒定、PCR法等，生理生化鑒定方法周期長(zhǎng)，不能滿足快速檢測(cè)的要求；而以PCR為基礎(chǔ)的方法由于其高特異性、高靈敏度、快速等特點(diǎn)得到了廣泛的應(yīng)用。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外用于弧菌快速檢測(cè)的方法有PCR[6-7]、巢氏PCR[8-9]、多重PCR[10-11]、熒光定量PCR[12-13]、多重?zé)晒舛縋CR[14-15]等。多重PCR具有高通量的特點(diǎn)，但由于引物之間的競(jìng)爭(zhēng)，其檢測(cè)通量受到了限制，而且結(jié)果需要進(jìn)一步凝膠電泳分析，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；巢氏PCR擁有高靈敏度的特點(diǎn)，但在其檢測(cè)通量方面無(wú)法與多重PCR相比；熒光定量PCR因無(wú)需凝膠電泳，得到了最為廣泛的應(yīng)用，但多重?zé)晒舛縋CR由于引物探針之間的競(jìng)爭(zhēng)和儀器熒光檢測(cè)通道的限制，難以實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)。因此，需要建立一種基于熒光定量PCR的高通量、高靈敏、具備定量能力的檢測(cè)方法。【本研究切入點(diǎn)】本研究以4種重要食源性病原弧菌（副溶血弧菌、霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌）為靶目標(biāo)，提出一種多重富集定量PCR（multiplex enrichment quantitative PCR, ME-qPCR）方法，改變現(xiàn)有方法存在的缺陷，真正實(shí)現(xiàn)高通量、高靈敏度、定量檢測(cè)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究擬針對(duì)常見的4種食源性病原弧菌——副溶血弧菌的、溶藻弧菌的、霍亂弧菌的和創(chuàng)傷弧菌的，分別設(shè)計(jì)特異性內(nèi)、外引物，并針對(duì)細(xì)菌保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物作為擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)，建立同時(shí)能檢測(cè)4種食源性病原弧菌的ME-qPCR體系，同時(shí)能夠指示PCR反應(yīng)的假陰性，結(jié)果無(wú)需凝膠電泳，真正達(dá)到定量、高通量、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)要求。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015年9月至2016年3月在汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心進(jìn)行。

1.1 材料

河流弧菌、擬態(tài)弧菌、鰻弧菌、哈維氏弧菌、梅氏弧菌保存于汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室。副溶血弧菌（ATCC17802）、溶藻弧菌（ATCC17749）、霍亂弧菌（ATCC14035）、創(chuàng)傷弧菌（ATCC27562）、大腸桿菌（ATCC8739）、單增李斯特菌（ATCC19111）、金黃色葡萄球菌（ATCC43300）、枯草芽孢桿菌（ATCC6633）、傷寒沙門氏菌（ATCC14028）保存于暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)及基因組DNA的提取

將弧菌單菌落接種于含3% NaCl的胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）培養(yǎng)基中，將非弧菌單菌落接種于腦心浸液（brian heart infusion，BHI）液體培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。采用試劑盒法（TIANamp Bacteria DNA kit，TIANGEN）提取細(xì)菌基因組DNA，提取后取1 μL用微量紫外分光光度計(jì)（ND-1000，NanoDrop）測(cè)定提取的基因組DNA的濃度和純度，基因組DNA保存于-20℃待用。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)副溶血弧菌（GenBank ID：AF326572.1）、溶藻弧菌（GenBank ID：AF007288）、霍亂弧菌（GenBank ID：X51948.1）和創(chuàng)傷弧菌（GenBank ID：AF376027.1）序列，以及細(xì)菌的保守序列，利用Primer Premier V5.0和Oligo V6.22軟件進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)和篩選，并保證內(nèi)、外引物產(chǎn)物大小符合熒光定量PCR的要求（小于200 bp）。在參考了大量文獻(xiàn)已報(bào)道的引物基礎(chǔ)上篩選出特異性外引物，在外引物產(chǎn)物片段序列內(nèi)設(shè)計(jì)內(nèi)引物，副溶血弧菌、溶藻弧菌和創(chuàng)傷弧菌的內(nèi)引物設(shè)計(jì)較困難，故保留外引物中特異性較強(qiáng)的那一條，僅設(shè)計(jì)一條內(nèi)引物，形成3對(duì)半巢式引物組，16S rRNA基因作為IAC的靶基因引物參考了已報(bào)道的文獻(xiàn)，但內(nèi)引物設(shè)計(jì)細(xì)菌通用引物難度較大，內(nèi)外引物均用同一對(duì)引物。上述所有 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

表1 各基因的內(nèi)外引物序列

1.4 ME-qPCR體系

多重富集定量PCR（Multiplex multiplex enrichment quantitative PCR，ME-qPCR）方法針對(duì)每一個(gè)靶基因序列均設(shè)計(jì)內(nèi)、外兩對(duì)引物，內(nèi)外引物產(chǎn)物大小符合基于SYBR Green I的熒光定量PCR的要求。首先，將所有內(nèi)、外引物全部混合，進(jìn)行一個(gè)循環(huán)數(shù)較少（10—20 cycles）的高通量多重富集PCR，然后將PCR產(chǎn)物用ddH2O稀釋作為模板，運(yùn)用內(nèi)引物進(jìn)行第二輪巢式熒光定量PCR，結(jié)果根據(jù)擴(kuò)增曲線和熔融曲線分析。在第一輪高通量多重PCR中，每個(gè)靶基因均有4種可能的產(chǎn)物類型，這4種產(chǎn)物類型均能作為第二輪巢式熒光定量PCR的模板，這意味著4條引物對(duì)應(yīng)的4種組合只要有1種能夠成功擴(kuò)增，整個(gè)反應(yīng)就能進(jìn)行，這相當(dāng)于將靶基因從模板中富集（enrichment）出來(lái)，這增加了本方法的成功率和穩(wěn)定性。同時(shí)，由于第一輪循環(huán)數(shù)較少，引物之間的競(jìng)爭(zhēng)較弱，各個(gè)基因均能得到均勻擴(kuò)增（圖1）。具體操作步驟如下：

第一輪多重富集PCR采用多重PCR反應(yīng)試劑盒（Multiplex PCR Assay Kit，TaKaRa），反應(yīng)體系為：Mix2溶液25 μL，Mix1溶液0.25 μL，各基因的內(nèi)、外引物混合物（各個(gè)引物終濃度均為0.1 μmol·L-1）和DNA模板各2 μL，用ddH2O調(diào)整體積至50 μL。反應(yīng)條件為：94℃ 1 min；94℃ 30 s，60℃ 60 s，72℃ 60 s，10—20個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min（Mastercycler ep，Eppendorf）。

將第一輪多重富集PCR產(chǎn)物用ddH2O稀釋100倍作為第二輪巢式熒光定量PCR的模板，使用SYBR熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒（SYBR Premix Ex Taq，TaKaRa），每孔體系為：SYBR溶液12.5 μL、第一輪PCR產(chǎn)物稀釋物1 μL、各基因的內(nèi)引物（引物終濃度均為0.4 μmol·L-1），用ddH2O調(diào)整體積至25 μL。反應(yīng)條件為95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 10 s，72℃ 10 s，35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)在72℃結(jié)束后檢測(cè)熒光信號(hào)；反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔融曲線分析：65—95℃，每0.5℃掃描熒光一次（CFX96，Bio-rad）。

1.5 ME-qPCR體系特異性的評(píng)價(jià)

利用1.1中的14株菌株，按照1.2的的方法提取基因組DNA，并按照1.4步驟進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)ME-qPCR體系的特異性。

圖1 ME-qPCR的原理

1.6 ME-qPCR體系的定量能力和靈敏度評(píng)價(jià)

按照1.2的方法分別提取溶藻弧菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌的基因組DNA，采用10倍梯度稀釋，分別制備成濃度分別為100、10、1、0.1、0.01和0.001 ng·μL-1的樣品，對(duì)上述樣品分別采用ME-qPCR和普通熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)，普通熒光定量PCR直接采用內(nèi)引物組，對(duì)比兩種方法的定量能力和靈敏度，評(píng)價(jià)ME-qPCR的定量能力和靈敏度。

1.7 ME-qPCR體系檢測(cè)實(shí)際樣品

采用本課題組前期分離的69株疑似弧菌菌株[20]，利用已建立的ME-qPCR體系對(duì)上述弧菌菌落進(jìn)行鑒定，同時(shí)對(duì)這些疑似菌落進(jìn)行生理生化鑒定，對(duì)比兩種方法。

2 結(jié)果

2.1 ME-qPCR第一輪反應(yīng)循環(huán)數(shù)的優(yōu)化

第一輪多重富集PCR的循環(huán)數(shù)是ME-qPCR的關(guān)鍵參數(shù)。將4種弧菌的基因組DNA混合作為模板，進(jìn)行第一輪多重富集循環(huán)數(shù)分別為10、15和20的ME-qPCR，并直接運(yùn)用內(nèi)引物對(duì)上述模板進(jìn)行普通熒光定量PCR，對(duì)比在不同第一輪反應(yīng)循環(huán)數(shù)下ME-qPCR與普通熒光定量PCR的差別。結(jié)果如表2所示，當(dāng)?shù)谝惠喎磻?yīng)循環(huán)數(shù)為10時(shí)，其Ct值大于普通熒光定量PCR，說(shuō)明其靈敏度低于普通熒光定量PCR；當(dāng)?shù)谝惠喎磻?yīng)循環(huán)數(shù)為15和20時(shí)，其Ct值均小于普通熒光定量PCR。但理論上第一輪反應(yīng)循環(huán)數(shù)越小，引物之間的競(jìng)爭(zhēng)越少，PCR反應(yīng)偏好性越弱。綜合考慮，確定第一輪反應(yīng)循環(huán)數(shù)為15。

2.2 ME-qPCR體系的建立

在確定了ME-qPCR第一輪反應(yīng)的循環(huán)數(shù)后，混合溶藻弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌和霍亂弧菌的基因組DNA為模板，建立了ME-qPCR體系用于4種食源性病原弧菌的檢測(cè)，同時(shí)在體系中添加IAC能指示PCR反應(yīng)的假陰性。結(jié)果如圖2所示，5個(gè)基因均得到擴(kuò)增，每個(gè)基因3個(gè)復(fù)孔的重復(fù)性好，熔融曲線結(jié)果表明產(chǎn)物單一，沒(méi)有非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的出現(xiàn)。

2.3 ME-qPCR體系特異性評(píng)價(jià)

利用14株菌對(duì)ME-qPCR體系的特異性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果如圖3所示，14種菌的IAC均表現(xiàn)為陽(yáng)性擴(kuò)增，說(shuō)明反應(yīng)不存在假陰性，4種目標(biāo)菌順利檢出，其余非目標(biāo)菌均為陰性結(jié)果，表明建立的ME-qPCR體系特異性強(qiáng)。

2.4 ME-qPCR體系定量能力及靈敏度的評(píng)價(jià)

混合4種食源性病原弧菌的基因組DNA并稀釋成一系列濃度梯度，同時(shí)進(jìn)行ME-qPCR和普通熒光定量PCR，對(duì)比兩種方法的定量能力和靈敏度。結(jié)果如表3所示，ME-qPCR的靈敏度高于普通熒光定量PCR約1個(gè)數(shù)量級(jí)，2種方法的Ct值線性關(guān)系好，2均大于0.99，PCR擴(kuò)增效率符合熒光定量PCR的要求，這說(shuō)明ME-qPCR擁有和普通熒光定量PCR相同的定量能力。

2.5 ME-qPCR體系檢測(cè)實(shí)際樣品

利用建立好的ME-qPCR體系對(duì)課題組前期分離的69個(gè)疑似弧菌菌落進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果與前期的API生理生化試驗(yàn)結(jié)果一致[20]。

3 討論

引物之間的競(jìng)爭(zhēng)一直是以PCR為基礎(chǔ)的高通量檢測(cè)技術(shù)的瓶頸，傳統(tǒng)多重PCR通過(guò)設(shè)計(jì)引物時(shí)降低理論上引物之間形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能性來(lái)提高多重PCR的成功率，而且同時(shí)要考慮不同靶基因的產(chǎn)物片段大小，這兩方面加在一起大大增加了引物的設(shè)計(jì)難度，因此有學(xué)者開發(fā)了多重PCR引物設(shè)計(jì)系統(tǒng)[21]，這一定程度上提高了構(gòu)建多重PCR體系的成功率。另外，還有學(xué)者將多重PCR與毛細(xì)管電泳技術(shù)[22]，或者改進(jìn)引物的設(shè)計(jì)方法，例如DPO（dual priming oligonucleotide）引物[23]、通用引物多重PCR（universal primer multiplex PCR，UP-M-PCR）[24]等，從而提高了多重PCR的檢測(cè)通量。但多重PCR的檢測(cè)通量依然受到多方面限制，而且多重PCR需要凝膠電泳或毛細(xì)管電泳分析，增加了檢測(cè)所需的時(shí)間。本研究建立的多重富集定量PCR（multiplex enrichment quantitative PCR，ME-qPCR）體系分2步反應(yīng)，首先進(jìn)行一輪高通量的多重富集PCR，然后將產(chǎn)物稀釋作為模板分別進(jìn)行第二輪熒光定量PCR。由于第一輪反應(yīng)的循環(huán)數(shù)較少，引物之間的競(jìng)爭(zhēng)減少，各個(gè)基因能得到均勻擴(kuò)增，這與多重串聯(lián)式PCR（multiplex tandem PCR，MT-PCR）的原理一致[25]。另外，將內(nèi)、外引物同時(shí)添加進(jìn)第一輪反應(yīng)中，會(huì)產(chǎn)生4種可能的產(chǎn)物，這4種可能的產(chǎn)物均能夠作為第二輪巢式熒光定量PCR的模板，這相當(dāng)于增加了模板被富集出來(lái)的概率，從而提高了反應(yīng)的成功率，這與擴(kuò)增子拯救多重PCR（amplicon rescue multiplex PCR，Arm-PCR）的原理一致[26]。本研究建立的ME-qPCR體系既提高了檢測(cè)的靈敏度，又能保證整個(gè)體系的定量能力，同時(shí)提高了檢測(cè)通量，結(jié)果無(wú)需凝膠電泳，適合實(shí)驗(yàn)室對(duì)這4種常見食源性病原菌的檢測(cè)。

表2 ME-qPCR第一輪循環(huán)數(shù)的優(yōu)化

多重富集定量PCR（Multiplex enrichment quantitative PCR，ME-qPCR）；熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）。下同 The same as below

A圖為擴(kuò)增曲線；B圖為熔融曲線 Fig A is amplification curve; Fig B is melting curve

Z軸坐標(biāo)代表35-Ct值；X軸坐標(biāo)VA、VP、VV、VC、IAC分別代表溶藻弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、霍亂弧菌的特異性引物和擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)；Y軸坐標(biāo)1—14分別代表溶藻弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、霍亂弧菌、擬態(tài)弧菌、河流弧菌、哈維氏弧菌、梅氏弧菌、鰻弧菌、大腸桿菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、傷寒沙門氏菌

表3 多重富集定量PCR（ME-qPCR）與實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）靈敏度及定量能力對(duì)比

—：未檢出 Not detected

靈敏度是基于PCR檢測(cè)方法的一個(gè)重要方面，熒光定量PCR的靈敏度一般高于普通PCR，而巢氏熒光定量PCR靈敏度又高于熒光定量PCR。COSTA等[27]建立了一種單管巢氏熒光定量PCR，高于普通熒光定量PCR法1個(gè)數(shù)量級(jí)。本研究建立的ME-qPCR方法，靈敏度高達(dá)0.001 ng，同樣高于普通熒光定量PCR法1個(gè)數(shù)量級(jí)，這是由于ME-qPCR的第一輪進(jìn)行了一次高通量多重富集PCR，然后將產(chǎn)物作為第二輪巢氏熒光定量PCR，這與巢氏PCR的效果相當(dāng)，因而提高了該方法的靈敏度。

在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，樣品中存在PCR抑制因子，或者儀器的故障等因素，都會(huì)導(dǎo)致PCR結(jié)果假陰性的出現(xiàn)[28]，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。目前，在PCR檢測(cè)體系中添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)（internal amplification control，IAC）是指示是否存在PCR反應(yīng)假陰性的重要方法[29]。Nordstrom等[30]針對(duì)副溶血弧菌、和這3類溶血素基因，建立了含擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的多重?zé)晒舛縋CR，在檢測(cè)的同時(shí)能指示PCR反應(yīng)的假陰性，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。魏霜等[20]針對(duì)溶藻弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌和霍亂弧菌，建立了添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的多重PCR。本研究建立的ME-qPCR體系內(nèi)添加了以為靶基因的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)，能有效指示PCR反應(yīng)的假陰性，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

本研究建立了一套多重富集定量PCR用于同時(shí)檢測(cè)溶藻弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌和霍亂弧菌，并能有效指示PCR反應(yīng)的假陰性，該方法特異性強(qiáng)，比普通熒光定量PCR靈敏度高1個(gè)數(shù)量級(jí)，而且擁有與普通熒光定量PCR相同的定量能力，結(jié)果無(wú)需凝膠電泳分析，適用于食品中4種常見病原弧菌的快速篩檢。由于該方法同時(shí)兼顧了高通量、高靈敏度、定量等方面的優(yōu)勢(shì)，為某些痕量樣品的分析如石蠟包埋樣品各基因表達(dá)量的分析、深加工食品轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)等提供了一種新方法；同時(shí)，由于本方法是基于染料法的熒光定量PCR，也可將該方法與高分辨率溶解曲線（high resolution melting，HRM）技術(shù)相結(jié)合，用于SNP位點(diǎn)的檢測(cè)，適合于某些大量樣品、多位點(diǎn)的分析。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Multiplex Enrichment Quantitative PCR Assays for the Detection of,,and

WEI Shuang1,2, WANG Tian-jie3, LONG Yang4, ZHOU Guang-biao1, LIN Chun-gui1, HUANG Shuai1, WU Xi-yang2

(1Shantou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shantou 515041, Guangdong;2Department of Food Science and Engineering, College of Science and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632;3Guangzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Guangzhou 510632;4Zhanjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhanjiang 524022, Guangdong)

【Objective】,,andhave been recognized as the important foodborne pathogens causing human disease. It is important to establish a detection method to identify these 4 foodborne pathogenicspecies in order to ensure food safety. To develop a multiplex enrichment quantitative PCR (ME-qPCR) assay that can simultaneously detect,,andin the presence of an internal amplification control (IAC), to make it possible for researchers and technical staff achieve simple detection of these 4 foodborne pathogens. 【Method】 Inner and outer species-specific PCR primers were designed based ongene for,gene for,gene forandgene for,gene of bacteria as IAC primers was used to indicate false-negative results. All inner and outer primers were used in first round multiplex enrichment PCR with a small number of cycles so as to avoid competition between amplicons. Each gene has 4 types of probable products which can be the templates for the next nested real-time PCR. This can enrich the target genes from the genomic DNA template successfully. The reaction product was then diluted and analyzed individual real-time PCRs using inner primers. The results were analysed by amplification curve and melting curve. ME-qPCR method was developed after optimization of the first round multiplex enrichment PCR cycle numbers (10, 15 and 20 cycles). The specificity of ME-qPCR was validated by 14 bacteria standard strains. The sensitivity and quantitative capability of ME-qPCR were tested by using 10-fold serially diluted genomic DNA of 4strains. Strains as templates, and then, the ME-qPCR was used to detect 69 suspiciousstrains and the results were compared with physiological and biochemical experiments. 【Result】Fifteen cycles were determined to use in first round multiplex enrichment PCR in this study finally. The results showed that the ME-qPCR assay was rapid, high-throughput, sensitive and specificand the existence of IAC could successfully eliminate false-negative results. The sensitivity of ME-qPCR was 0.001ng per reaction, about 10 times higher than real-time PCR. The ME-qPCR was validated with 69 suspiciousstrains. The result showed that 27 green bacteria colonies were, 22 yellow bacteria colonies were, 1 yellow bacteria colony was, ande was not detected. The results are consistent with physiological and biochemical experiments. 【Conclusion】 The ME-qPCR assay is specific, stable and reliable for the detection of,,and. It’s sensitivity is high, and can effectively indicate the false negative of PCR reaction, the results without gel electrophoresis, and is suitable for the rapid screening of 4 common pathogenicin food.

;;;; internal amplification control; ME-qPCR

2016-05-03；接受日期：2016-06-27

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目-國(guó)際科技合作領(lǐng)域（2015A050502030）、湛江市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014C01007）、廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015GDK27）

魏霜，E-mail：weishuang2008@hotmail.com。通信作者吳希陽(yáng)，E-mail：tkentwu@jnu.edu.cn