李巧燕

摘 要：烈性腸道傳染病霍亂能引起大范圍乃至世界性大流行，在我國被列為甲類傳染病?；魜y弧菌是導(dǎo)致感染者嚴(yán)重腹瀉、引起霍亂的病原菌?；魜y弧菌的快速、準(zhǔn)確檢測是霍亂預(yù)防、控制的重要依據(jù)。目前，國內(nèi)、外針對霍亂弧菌建立了許多有效的檢測方法，尤其是分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)的應(yīng)用，為霍亂弧菌的檢測提供了新的手段。本文綜述了近年來霍亂弧菌檢測方法的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：霍亂弧菌；檢測方法；分子生物學(xué)技術(shù)

一、傳統(tǒng)檢測方法

霍亂弧菌為需氧或兼性厭氧菌，營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好，常以堿性蛋白胨水作為其選擇性增菌培養(yǎng)基?；魜y弧菌生長迅速，可將標(biāo)本在 37℃培 養(yǎng) 6～8h后取上層培養(yǎng)物做弧菌分離。霍亂弧菌在營養(yǎng)瓊脂和堿性瓊脂上呈無色、圓形、透明、光滑、濕潤、扁平或稍凸起、邊緣整齊的菌落。

為便于檢出，根據(jù)其生長特性、對某些抗生素的敏感性及與其他常見腸道菌的差別，國內(nèi)已研制出慶大霉素瓊脂、四號瓊脂，國外有TCBS等選擇性培養(yǎng)基。這些培養(yǎng)基一般都含有膽鹽、亞碲酸鉀、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、慶大霉素、多黏菌素等抑菌劑。

在不同的選擇性培養(yǎng)基上，霍亂弧菌具有不同的菌落特征。挑取可疑菌落后需進(jìn)行一系列生化反應(yīng)、血清凝集等試驗，對結(jié)果進(jìn)行綜合判定，從而確定為霍亂弧菌[1]。目前，細(xì)菌培養(yǎng)、生化和血清學(xué)鑒定仍是霍亂弧菌實驗室診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，具有較好的敏感度和特異度。但不可否認(rèn)，傳統(tǒng)方法檢測周期長、工作量大，且易受環(huán)境、培養(yǎng)條件及主觀因素影響，不能滿足疾病預(yù)防和控制快速反應(yīng)體系的需求，不利于實驗室的快速診斷。[2]

二、分子生物學(xué)方法

1.聚合酶鏈反應(yīng)

（1）普通聚合酶鏈反應(yīng)

運用常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechain reaction，PCR）檢測霍亂弧菌，一般選擇霍亂腸毒素（choleraenterotoxin，CT）基因 ctx的保守序列作為靶基因[3，4]。一些非產(chǎn)毒株（如環(huán)境來源的菌株）有可能通過基因水平轉(zhuǎn)移獲得毒力基因成為產(chǎn)毒株，若僅檢測 ctx基因容易造成漏檢。因此，霍亂弧菌的其他重要基因，如毒力協(xié)同調(diào)節(jié)菌毛 A 基因（tcpA）、0抗原基因（rfb）、外膜蛋白基因（omp）以及毒力表達(dá)調(diào)控基因（toxR）等也被選用為 PCR的靶基因[5，6]，這大大提高了檢測的特異度。PCR方法檢測霍亂弧菌的特異度和敏感度都很高，但其本身也有缺點：一是因樣本DNA交叉污染而出現(xiàn)假陽性；二是由于待測樣本中的某些雜質(zhì)蛋白及核酸提取過程中用到乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、SDS等，如未去除干凈就會成為 Taq DNA 聚合酶的抑制劑，造成擴(kuò)增失敗。此外，標(biāo)本中也可能含有會降解靶核酸的核酸酶，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。因此，在運用 PCR檢測霍亂弧菌時，要注意避免 DNA污染以及其他雜質(zhì)的干擾。

（2）多重PCR

與常規(guī)PCR相比，多重PCR一次反應(yīng)可檢測多個基因，節(jié)省了時間和成本。國內(nèi)外許多學(xué)者選用霍亂弧菌的毒素基因ctx、rfb、hly進(jìn)行組合[7]，作為共同的靶基因，克服了由于毒力基因特異度不夠高而造成的假陽性。多重 PCR 同時可準(zhǔn)確區(qū)分不同血清型的霍亂弧菌和快速鑒定其是否為產(chǎn)毒株，可謂舉多得，大大提高了檢測效率。

Tarr等[8]運用多重 PCR技術(shù)同時檢測霍亂弧菌和擬態(tài)弧菌的 sodB、副溶血弧菌的laEf、創(chuàng)傷弧菌的 hsp等 基因，G6mez.Duarte等[9]運用多重PCR從腹瀉患者的臨床標(biāo)本中同時檢測到包括霍亂弧菌在內(nèi)的 7種腸道致病菌。這些都大大提高 了感染性腹瀉病原學(xué)診斷的效率和水平，為多種致病菌的快速診斷提供了很好的思路和方法。多重PCR 的引物設(shè)計要注意避免各對引物之間的相互干擾和各目的片段之間的非特異性擴(kuò)增。

（3）熒光定量 PCR 熒光定量

PCR 自動化程度高、特異性強(qiáng)、無交叉污染，在霍亂弧菌的快速診斷中得到廣泛應(yīng)用。尤其是近年來，隨著引物與探針的設(shè)計更精確、多通道熒光 PCR儀的開發(fā)與廣泛使用，多重?zé)晒舛?PCR技術(shù) 日臻成熟，并以其高通量、低成本、高效率等優(yōu)點而廣泛應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、真菌等多種病原體的快速檢測，成為應(yīng)用的熱點。Huang等[10] 選取 Ol和 O139群特異的 rbf基因以及 ctxA、hylA等作為靶點，建立了四重?zé)晒舛?PCR體系，不僅克服了單重?zé)晒舛?PCR僅檢測毒力基因特異度不高而造成假陽性的缺點，而且能很好檢測并區(qū)分 01群和 O139群霍亂弧菌及其毒力株，最低檢出限達(dá)每個反應(yīng) 2個菌落形成單位（colonyformingunit，CFU）。這與單重?zé)晒舛縋CR的最低檢出限相當(dāng)，降低了檢測成本，提高了檢測效率。Fykse等[1l]運用基于分子信號標(biāo)記的多重?zé)晒舛?PCR體 系檢測環(huán)境標(biāo)本中霍亂弧菌的 ctxA、tcpA、toxR、hlyA、groEL等多個基因的不同組合，在一定程度上削弱了標(biāo)本中雜質(zhì)的干擾，提高了 PCR技術(shù)對環(huán)境標(biāo)本檢測的特異度，敏感度也較 TaqMan探針和 SYBR Green I方法提高了 100 倍?？梢?，多重?zé)晒舛?PCR技術(shù)已成為未來檢測技術(shù)發(fā)展的趨勢，但必須保證不同探針?biāo)鶚?biāo)記的光基團(tuán)問無相互干擾，且各目的片段有相近的擴(kuò)增效率。

2、基因芯片

與 PCR方法相 比，基因芯片技術(shù)能同時獲得更多病原學(xué)、生物學(xué)方面的信息，從而更為全面地分析、掌握病原微生物的特征。Vora等[12]運用基因芯片技術(shù)對多種致病性弧菌的毒力、毒素、耐藥基因及潛在的毒力基因進(jìn)行全面分析，對掌握這些細(xì)菌的致病性及進(jìn)行有效預(yù)防、控制等具有重要意義。但基因芯片成本較高，距離推廣應(yīng)用尚需時間等待。

3、環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增（1oop.mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)是 2000年 Notomi等發(fā)明的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法。此方法針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計 4條特異性引物，利用鏈置換 DNA 聚合酶（BstDNA polymerase）在恒溫條件（60-65℃）孵育 40-60min，引發(fā)自動鏈循環(huán)取代反應(yīng)，完成對靶基因的擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物可通過電泳或直接通過副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀的濁度進(jìn)行檢測。Yamazaki等[13]。采用 LAMP檢測霍亂弧菌的 ctxA基因，最低檢測限達(dá)每個反應(yīng) 1.4 CFU，比普通PCR高近 10倍，說明該方法具有很高的靈敏度。

參考文獻(xiàn)

[1]聞玉梅.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)微生物學(xué)[M].上海：上海醫(yī)科大學(xué)出版社，1999：331-334.

[2]王秀茹.預(yù)防醫(yī)學(xué)微生物學(xué)及檢驗技術(shù)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：338-339.

[3]王家豪，楊長業(yè)，候金英 應(yīng)用一步法快速檢測乙型肝炎表面抗原 中國公共衛(wèi)生雜志，1998，14（1）：47～48.

[4]曾章新，劉文星，朱忠勇，等.膠體金免疫層析法檢測乙肝表面抗原的評價.中華 醫(yī)學(xué)檢驗雜志，1999，22（6）：327.