陳 睿，宋玉林，汪文玉，吳 凱，陳偉高

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科，江西南昌 330000)

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◇基礎(chǔ)研究◇

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與樹枝狀兩親性多肽自組裝凝膠支架的生物相容性

陳 睿，宋玉林，汪文玉，吳 凱，陳偉高

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科，江西南昌 330000)

目的 研究大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)與樹枝狀兩親性多肽自組裝凝膠支架的生物相容性。方法 獲取大鼠BMSCs，傳至第3代行流式細(xì)胞術(shù)表面抗原檢測(cè)及成脂分化誘導(dǎo)鑒定干細(xì)胞。設(shè)計(jì)含雙鏈-IKVAV活性集團(tuán)的樹枝狀兩親性多肽，用固相合成法合成多肽，質(zhì)譜儀(MS)測(cè)其分子量，高效液相色譜儀(HPLC)測(cè)其純度；將10 mg/mL樹枝狀兩親性多肽溶液在兔膝關(guān)節(jié)滑液作用下自組裝為凝膠支架，透射電鏡觀察凝膠超微結(jié)構(gòu)；1×109/L的BMSCs懸液分別接種于凝膠內(nèi)部(三維培養(yǎng)體系)及多聚賴氨酸包被的蓋玻片表面(二維培養(yǎng)體系)，CCK-8法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。DEAD/LIVE雙標(biāo)染色，熒光顯微鏡觀察BMSCs在三維多肽凝膠中成活及增殖情況。結(jié)果 分離獲取的細(xì)胞高表達(dá)CD29、CD90，不表達(dá)CD34、CD45，經(jīng)成脂誘導(dǎo)2周出現(xiàn)脂滴，油紅O染色成紅色。MS測(cè)得合成多肽相對(duì)分子質(zhì)量為2 344.2，與其理論值一致；HPLC分析其純度為95.15%；透射電鏡觀察凝膠由多孔納米纖維構(gòu)成，納米纖維直徑為5～7 nm，長(zhǎng)度為數(shù)百納米至數(shù)微米；CCK8試驗(yàn)示三維體系中細(xì)胞增殖率明顯高于二維培養(yǎng)體系(P<0.05)。DEAD/LIVE雙熒光染色后顯示三維培養(yǎng)體系中細(xì)胞生存、增殖情況良好，未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性導(dǎo)致細(xì)胞死亡。結(jié)論 含-IKVAV活性基團(tuán)的樹枝狀兩親性多肽與BMSCs具有良好的細(xì)胞相容性并能促進(jìn)其增殖。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；-IKVAV；樹枝狀兩親性多肽；細(xì)胞相容性

隨著我國(guó)交通和工業(yè)的快速發(fā)展，脊髓損傷發(fā)生率不斷增加，治療及康復(fù)困難，導(dǎo)致患者勞動(dòng)能力不同程度喪失，造成患者家屬極度身心痛苦，給社會(huì)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，是迫切需要解決的問題。

目前，仿生脊髓再生是治療脊髓損傷的有效方法。脊髓組織工程(tissue engineering)是仿生脊髓再生的理想技術(shù)[1]。兩親性多肽凝膠因具備高度仿生結(jié)構(gòu)和良好的生物相容性成為脊髓組織工程材料的優(yōu)先選擇[2]。樹枝狀兩親性多肽因在線性多肽的基礎(chǔ)上通過賴氨酸支化使其能同時(shí)攜帶多個(gè)一種或多種活性表位，從而能為細(xì)胞提供更多的生物信號(hào)而被重視[3]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)由于其具有多向分化潛能、低免疫原性、易獲性等優(yōu)點(diǎn)而成為脊髓組織工程的理想種子細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)通過設(shè)計(jì)及合成樹枝狀兩親性多肽，自組裝形成多孔納米凝膠支架，研究大鼠BMSCs與其生物相容性研究，為進(jìn)一步的脊髓組織工程構(gòu)建提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康4周齡SD大鼠5只，健康3月齡日本大耳白兔3只，均由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。結(jié)構(gòu)式為IKVAV-KIKVAV-K KLLLAAA(K)-C16H31O 兩親性分支多肽委托上海波泰公司合成。

1.2 主要試劑與儀器 DMEM-F12培養(yǎng)基、FBS(Gibco北美)；2.5 g/L胰蛋白酶-0.2 g/L(EDTA)(Gibco公司，美國(guó))；Ⅰ型膠原酶、地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、油紅O染色劑(Sigma公司，美國(guó))；吲哚美辛(Alexis公司，美國(guó))；兔抗大鼠CD29、CD34、CD45、CD90多克隆抗體(BD公司,美國(guó))；碘化丙啶(propidium iodide, PI)，鈣黃綠素乙酰氧基甲酯(Calcein-AM)(Invitrogen公司，美國(guó))；0.1 mol/L KCl、0.1 mol/L HCl(國(guó)藥集團(tuán))。

倒置相差顯微鏡、熒光倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)；透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM) (JEM, Japan)；流式細(xì)胞儀(BD公司，美國(guó))；CO2培養(yǎng)箱、多功能酶標(biāo)儀(Thermo公司，美國(guó))。

1.3 BMSCs的分離培養(yǎng)與鑒定

1.3.1 BMSCs的獲取 采用脊髓脫臼法處死健康4周齡SD大鼠，置入750 mL/L乙醇浸泡10 min；無菌條件下取出股骨及脛骨，PBS清洗3次；剪刀剪去股骨及脛骨兩端骨骺，用DMEM-F12培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，反復(fù)吹打沖洗液制備成單細(xì)胞懸液。1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，以含有100 mL/L FBS的DMEM-F12完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以1×109/L的細(xì)胞密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。原代培養(yǎng)過程中，48 h后半量更換新鮮培養(yǎng)液，以后每2 d全量更換新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底至細(xì)胞融合成單層，密度長(zhǎng)至80%融合時(shí)，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，按1∶2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。每天在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀況，傳至第3代供實(shí)驗(yàn)用。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMSCs表面抗原 取第3代BMSCs，胰蛋白酶消化，離心1 000 r/min×5 min，棄上清，加少量PBS吹打均勻，調(diào)整細(xì)胞密度為1×109個(gè)/L，將細(xì)胞懸液移入EP管(100 μL/管)，每管分別加入含有FITC標(biāo)記的-CD29、-CD34、-CD45、-CD90流式單克隆抗體各5 μL，以同型FITC-IgG抗體為陰性對(duì)照，避光室溫孵育45 min，PBS洗滌2次以去除未結(jié)合的抗體，離心棄上清后，以每管500 μL PBS重懸均勻，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.3.3 BMSCs的體外定向誘導(dǎo)分化 取第3代BMSCs胰蛋白酶消化，按1×108/L濃度接種于置有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板上，待細(xì)胞貼壁融合較多時(shí)，將培養(yǎng)基更換為成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基(高糖DMEM，100 mL/L FBS，1 μmol/L地塞米松，10 μmol/L胰島素，0.5 mmol/L IBMX，200 μmol/L吲哚美辛)，陰性對(duì)照用100 mL/L FBS的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每周換液2～3次。定期觀察細(xì)胞形態(tài)變化，培養(yǎng)2周后取細(xì)胞爬片，PBS清洗后40 g/L多聚甲醛固定5 min，洗滌后加入油紅O工作液染色15 min，PBS洗滌2次后行顯微鏡觀察。

1.4 樹枝狀兩親性肽凝膠的制備 采用空氣栓塞法處死健康3月齡日本大耳白兔，使用含雙抗的PBS溶液徹底清洗四肢，750 mL/L乙醇浸泡后使用無菌手術(shù)器械分離切開膝關(guān)節(jié)，當(dāng)關(guān)節(jié)囊切口后使用無菌注射器收集關(guān)節(jié)液，完畢后放置于4 ℃冰箱中待用。

10 mg(IKVAV)2-PA多肽置入裝有600 μL 0.1 mol/L KCl溶液血清瓶中，使用0.1 mol/L HCl溶液及三蒸水調(diào)節(jié)多肽溶液濃度及pH值，將溶液pH值調(diào)至5，濃度為1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))后渦旋機(jī)反復(fù)震蕩形成澄清的臨界狀態(tài)下自組裝溶液。500 μL 1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))臨界多肽溶液加入到等體積關(guān)節(jié)液中形成多肽自組裝凝膠。50 μL 1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))臨界多肽溶液與等體積關(guān)節(jié)液充分混合形成凝膠涂布于金屬濾網(wǎng)上，脫水，臨界點(diǎn)干燥，磷酸鎢染色，作TEM觀察。

1.5 樹枝狀兩親性多肽自組裝凝膠與BMSCs細(xì)胞的相容性檢測(cè) 將300 μL 1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))臨界多肽溶液加入到300 μL 1×107/L細(xì)胞懸液中數(shù)秒后形成凝膠，吸去多余液體后加入500 μL完全培養(yǎng)基形成三維培養(yǎng)體系，置于37 ℃、50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)。分別于第3、5、7天進(jìn)行Calcein-AM和PI染色，觀察每孔板中加入含1/10體積2 μmol/L、4 μmol/L的Calcein-AM和PI的細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37 ℃孵箱孵育15 min，再用PBS洗滌2遍。在熒光顯微鏡下，先使用490 nm激發(fā)波長(zhǎng)觀察綠色的活細(xì)胞，然后用545 nm激發(fā)波長(zhǎng)觀察紅色的死細(xì)胞。觀察各個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞形態(tài)特征、活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)量。每組隨機(jī)選取3個(gè)視野下拍攝的綠色熒光和紅色熒光圖片通過2名實(shí)驗(yàn)者用Photoshop點(diǎn)計(jì)數(shù)工具進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)學(xué)作圖軟件制作柱狀圖。

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代BMSCs，血清消化后用關(guān)節(jié)液重懸細(xì)胞制成密度為1×107/L細(xì)胞懸液。將96孔板隨機(jī)分為2組。對(duì)照組：加入100 μL 1×107/L細(xì)胞懸液，待8 h后細(xì)胞完全貼壁后吸去關(guān)節(jié)液，加入100 μL完全培養(yǎng)基形成二維培養(yǎng)體系。實(shí)驗(yàn)組：加入100 μL 1×107/L細(xì)胞懸液后每孔加入100 μL 1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))臨界多肽溶液，數(shù)秒后形成凝膠，吸去多余液體后加入100 μL完全培養(yǎng)基形成三維培養(yǎng)體系。成膠后再每孔加入100 μL細(xì)胞懸液。每組5個(gè)復(fù)孔，共接種4塊96孔板。置于37 ℃、50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)。分別在1、3、5、7 d各取出一板，于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別加入CCK8 10 μL，孵箱中培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處A值。將每天平均A值用統(tǒng)計(jì)學(xué)作圖軟件在坐標(biāo)紙上繪出實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的增殖曲線。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs光鏡下的形態(tài)學(xué)觀察 原代細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶后，細(xì)胞呈圓形，大小不一，懸浮于培養(yǎng)液中。48 h后開始有細(xì)胞貼壁，呈梭形、多角形(圖1A)。通過換液逐漸除去不貼壁的雜質(zhì)細(xì)胞。3、4 d后可見放射狀排列的細(xì)胞集落，伸出長(zhǎng)短不一突起(圖1B)。當(dāng)培養(yǎng)到第8天左右細(xì)胞融合至90%，細(xì)胞呈現(xiàn)漩渦狀、魚群樣排列。傳代后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)均一，呈梭形生長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛。傳代時(shí)間穩(wěn)定約6 d(圖1C、1D、1E、1F)。

圖1 原代及傳代培養(yǎng)的BMSCs細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Morphological observation of first-generation and third- generation rat BMSCs (inverted phase contrast microscope)

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMSCs表面抗原的表達(dá)結(jié)果 選取的第3代BMSCs經(jīng)4種流式抗體結(jié)合后上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果顯示，BMSCs表達(dá)CD29(陽(yáng)性率99.88%)、CD90(陽(yáng)性率99.36%)，不表達(dá)或極低表達(dá)CD34(陽(yáng)性率1.15%)、CD45(陽(yáng)性率1.52%)(圖2)。

圖2 第3代BMSCs流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面抗原的表達(dá)情況Fig.2 Detection of surface antigens of third-generation BMSCs by flow cytometry

2.3 BMSCs的成脂誘導(dǎo)和油紅O染色結(jié)果 BMSCs在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，第2天即可看到細(xì)胞骨架收縮，第3天后可見透亮脂滴開始增多變大。誘導(dǎo)2周后脂滴形成較多，融合為較大脂滴(圖3A)，經(jīng)油紅O染色后可見脂滴被染成紅色(圖3B)。

圖3 BMSCs成脂誘導(dǎo)2周油紅O染色結(jié)果Fig.3 Oil red O staining after induction to adipogenic differentiation for two weeks (inverted phase contrast microscope, ×200)

2.4 肽的檢測(cè)結(jié)果 肽分子結(jié)構(gòu)見圖4A，MS示其平均分子質(zhì)量為2 344.2，與其理論設(shè)計(jì)肽分子質(zhì)量一致(圖4B)；HPLC顯示合成的樹枝狀兩親性多肽的純度為95.15%(圖4C)；表明所合成的多肽為本實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)肽。

圖4 兩親性樹枝狀多肽檢測(cè)結(jié)果Fig.4 The detection results of the branched peptide-amphiphile

2.5 肽自組裝凝膠及檢測(cè)結(jié)果 當(dāng)在1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多肽溶液中加入等體積的關(guān)節(jié)液促發(fā)其自組裝，數(shù)秒后形成透明多肽凝膠緊貼于瓶壁，晃動(dòng)血清瓶凝膠不脫落(圖5A)。TEM觀察凝膠由納米纖維構(gòu)成，納米纖維直徑為5～7 nm，長(zhǎng)度為構(gòu)100～1 500 nm(圖5B)。

圖5 自組裝納米凝膠檢測(cè)結(jié)果Fig.5 The detection results of self-assembling nanofiber hydrogel

2.6 樹枝狀兩親性多肽凝膠與BMSCs細(xì)胞相容性 將300 μL 1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))臨界多肽溶液加入到300 μL 1×107/L細(xì)胞懸液中數(shù)秒后形成凝膠構(gòu)建細(xì)胞三維培養(yǎng)體系，8 h后活細(xì)胞向四周發(fā)出不規(guī)則突起，逐漸變?yōu)槎嘟切位蛩笮位謴?fù)為正常細(xì)胞形態(tài)，死細(xì)胞未伸長(zhǎng)呈圓形(圖6)。Calcein-AM和PI染色，細(xì)胞點(diǎn)計(jì)數(shù)第1、3、5天活細(xì)胞與死細(xì)胞數(shù)目，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加三維體系中活細(xì)胞數(shù)目明顯增多且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018)，但未出現(xiàn)更多的細(xì)胞死亡，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖7)。CCK結(jié)果顯示，第3天BMSCs開始出現(xiàn)明顯增殖，細(xì)胞在三維培養(yǎng)中增殖活性明顯高于二維體，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026)，當(dāng)?shù)降?天二維培養(yǎng)體系細(xì)胞達(dá)到一個(gè)平臺(tái)期不再出現(xiàn)細(xì)胞分裂增殖，但三維體系中細(xì)胞增殖情況仍然繼續(xù)(圖8)。

圖6 BMSCs在納米纖維凝膠中生長(zhǎng)8 h后Fig.6 The BMSCs living in the nanofiber hydrogel after 8 h

圖7 細(xì)胞三維培養(yǎng)下Calcein-AM和PI染色結(jié)果Fig.7 The calcein-AM and PI staining results of cells in three-dimensional culture

圖8 CCK8檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組BMSCs增殖曲線Fig.8 BMSCs’ growth curves in experimental group and control group by CCK8 test

3 討 論

脊髓損傷后的治療及康復(fù)一直是世界性的難題，是當(dāng)今迫切需要解決的問題。正常脊髓由功能性微血管、完整血脊髓屏障、細(xì)胞外基質(zhì)、神經(jīng)細(xì)胞及誘導(dǎo)因子等構(gòu)成[4]。目前，脊髓損傷研究的熱點(diǎn)一直集中于脊髓組織工程的構(gòu)建。

脊髓組織工程是仿生脊髓再生的理想技術(shù)。樹枝狀兩親性多肽自組裝后形成高寬比的圓柱形納米支架材料具有如下優(yōu)點(diǎn)：①可通過肽分子賴氨酸位點(diǎn)進(jìn)行支化；②攜帶多個(gè)功能基團(tuán)或抗原表位，該功能基團(tuán)位于自組裝納米纖維表面，易于與受體結(jié)合，執(zhí)行復(fù)雜生物功能；③生物相容性好[5]。因此，樹枝狀兩親性多肽是目前構(gòu)建脊髓組織工程支架材料的良好選擇。

脊髓組織工程大多以神經(jīng)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，然而有活力的神經(jīng)干細(xì)胞主要從胚胎或新生哺乳動(dòng)物腦或脊髓中獲取,其取材受到倫理限制,必須考慮既合法又不違背倫理及易獲取等特點(diǎn)。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)可以克服這些缺點(diǎn)，它可以從哺乳動(dòng)物自身骨髓獲取，通過基因修飾可產(chǎn)生多種生長(zhǎng)因子，如neurotrophin-3(NT-3)、angiopoietin-1(Ang-1)及VEGF等；NT-3可通過酪氨酸激酶受體-3(NTPK-3/TrkC)誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞分化為神經(jīng)元,通過轉(zhuǎn)分化(transdifferentiation)誘導(dǎo)BMSCs分化為功能性神經(jīng)元[6]。所以，BMSCs才是較為理想的種子細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)合成的樹枝狀多肽特點(diǎn)在于：①含有長(zhǎng)鏈的烷基尾C16H31O-，該結(jié)構(gòu)可以提高肽對(duì)離子敏感度并調(diào)節(jié)自組裝納米纖維直徑和長(zhǎng)度。②含有A3L3(AAALLL)，一方面與烷基起協(xié)同效應(yīng)，另一方面使活性區(qū)域伸出纖維表面。③肽分子羧基末端引入3個(gè)賴氨酸分支單元，分別插入IKVAV活性集團(tuán)。優(yōu)點(diǎn)在于：①由于高電荷賴氨酸樹枝大分子提供空間位阻，使多肽分子互相分離，改善活性結(jié)構(gòu)與整合素受體結(jié)合。②肽分子在生理鹽溶作用下自組裝形成高寬比的納米纖維，其分支結(jié)構(gòu)置于納米纖維表面，增強(qiáng)結(jié)合能力，而且攜帶多個(gè)活性結(jié)構(gòu)。③IKVAV具有能夠促進(jìn)細(xì)胞粘附、神經(jīng)突觸形成、血管再生等作用[7]。

將多肽溶解形成臨界多肽溶液。當(dāng)加入等體積兔膝關(guān)節(jié)液后由于關(guān)節(jié)液內(nèi)各種離子的存在，多肽通過分子內(nèi)非共價(jià)鍵(氫鍵、疏水鍵、范德華力等)自組裝為三維多孔納米纖維凝膠支架。凝膠由高寬比的三維納米纖維組成，含水量高達(dá)99.5%，對(duì)細(xì)胞有良好的機(jī)械支撐作用，蛋白質(zhì)、生物因子、氧氣等通過在凝膠中彌散作用足夠滿足大量細(xì)胞生存[8]。

由20世紀(jì)70年代FRIEDENSTEIN等采用差異貼壁法首次從骨髓中分離培養(yǎng)BMSCs，該法至今仍是培養(yǎng)BMSCs的常用方法。本實(shí)驗(yàn)采用該方法獲取的BMSCs后，通過形態(tài)學(xué)觀察、表面抗原檢測(cè)和定向誘導(dǎo)分化，驗(yàn)證獲取的細(xì)胞為BMSCs。將BMSCs與多孔納米纖維凝膠支架組合構(gòu)建三維培養(yǎng)體系后，由于自組裝三維多肽凝膠為細(xì)胞的生長(zhǎng)與繁殖提供了更大的生長(zhǎng)空間和-IKVAV活性表位。CCK-8結(jié)果顯示細(xì)胞在三維培養(yǎng)中增殖活性明顯高于二維體，且到達(dá)平臺(tái)期時(shí)細(xì)胞數(shù)量也明顯增多。DEAD/LIVE試劑盒是通過鈣黃綠素乙酰氧基甲酯(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)分別將活細(xì)胞胞質(zhì)和死細(xì)胞核染成綠、紅色，可進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記，也用于檢測(cè)細(xì)胞存活率[9]。三維培養(yǎng)體系通過染色后顯示，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，細(xì)胞健康程度明顯升高，提示多肽凝膠與BMSCs具有良好的生物相容性。而第1天中有一部分細(xì)胞死亡主要考慮自組裝過程中溶液離子濃度及pH值變化所致。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建以BMSCs為種子細(xì)胞、樹枝狀兩親性多肽為支架材料的三維培養(yǎng)體系，充分說明了樹枝狀兩親性多肽自主裝凝膠支架對(duì)BMSCs具有良好的生物相容性，為今后進(jìn)一步的脊髓組織工程模塊構(gòu)建提供基礎(chǔ)。

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(編輯 卓選鵬)

Compatibility between rat bone marrow mesenchymal stem cells and self-assembling branched peptide-amphiphile nanofiber hydrogel scaffolds

CHEN Rui, SONG Yu-lin, WANG Wen-yu, WU Kai, CHEN Wei-gao

(Department of Orthopedics Surgery, the Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330000, China)

Objective To study the compatibility between bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) and self-assembling branched peptide-amphiphile nanofiber hydrogel scaffolds. Methods First, we obtained BMSCs from rats by whole marrow adherence method and then detected surface antigens using flow cytometry, and induced adipogenic differentiation to identify these stem cells. We designed the branched peptide-amphiphile containing double-IKVAV epitopes. The peptide whose molecular weight (MW) and purity were detected by mass spectrometer (MS) and high performance liquid chromatograph (HPLC), respectively, was synthesized with solid phase method. The 10 mg/mL peptide solution was triggered to form self-assembling branched peptide-amphiphile nanofiber hydrogel under the effect of the rabbit knee joint synovial fluid. The self-assembly hydrogel was examined with transmission electron microscope (TEM). 1×109/L BMSCs were seeded in three-dimensional (3D) hydrogels (experimental group, EG) or surface of coverslips (control Group, CG). A growth curve of the cells was obtained according to CCK-8. After double-labeling with DEAD/LIVE, the survival and proliferation of the BMSCs living in three-dimensional (3D) hydrogels were observed by fluorescence microscope. Results The cells we obtained highly expressed CD29 and CD90, but did not express CD34 or CD45. Lipid droplets were generated after induction to adipogenic differentiation for two weeks, and oil red O staining was positive. MS showed that molecular weight of the peptide was 2 344.2, which was identical to that in theory. HPLC testified that the peptide purity was 96%.

bone marrow mesenchymal stem cell; -IKVAV; branched peptide amphiphile; cytocompatibility

2016-01-01

2016-04-19

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81360271)；江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(No.GJJ14054)

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81360271) and Key Science and Technology Research Programs of Jiangxi Provincial Education Department (No.GJJ14054)

宋玉林. E-mail: songyulin2001@163.com

R318

A

10.7652/jdyxb201606007

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20161010.1800.012.html(2016-10-10)

TEM showed that the hydrogel was composed of nanofibers with 5-7 nm in diameter and hundreds of nanometers to several microns in length. CCK8 test showed that BMSCs proliferated more actively in 3D hydrogel than in 2D culture (P<0.05). Observed under fluorescence microscope after DEAD/LIVE kit staining, the cells survived and proliferated in good condition, the hydrogel had no cytotoxicity to the cells. Conclusion The self-assembled hydrogel containing double-IKVAV epitopes can provide survival environment for BMSCs and promote their proliferation.