郝秀靜，陽(yáng) 輝，王 娟，李 敏，李學(xué)強(qiáng)

(1. 西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川 750021；2. 寧夏大學(xué)，寧夏銀川 750021)

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◇基礎(chǔ)研究◇

18β-甘草次酸哌嗪衍生物抗肝癌SMMC-7721細(xì)胞活性研究

郝秀靜1,2，陽(yáng) 輝2，王 娟1,2，李 敏1,2，李學(xué)強(qiáng)2

(1. 西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川 750021；2. 寧夏大學(xué)，寧夏銀川 750021)

目的 研究18β-甘草次酸哌嗪衍生物D34、D35對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的的抑制作用及對(duì)凋亡的影響。方法 用18β-甘草次酸哌嗪衍生物D34、D35以不同濃度、不同時(shí)間段處理SMMC-7721細(xì)胞，顯微鏡下觀察其對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響；MTT法檢測(cè)18β-甘草次酸哌嗪衍生物D34、D35對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制率；Hoechst-33258細(xì)胞凋亡染色試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果 MTT檢測(cè)結(jié)果表明，18β-甘草次酸哌嗪衍生物D34、D35能夠抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖，且呈濃度依賴性(P<0.05)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，D35為26.71%、D34為36.95%。結(jié)論 18β-甘草次酸哌嗪衍生物D34、D35對(duì)SMMC-7721細(xì)胞有增殖抑制作用和促凋亡作用，且優(yōu)于18β-甘草次酸(GA)。

18β-甘草次酸；哌嗪衍生物；SMMC-7721；細(xì)胞凋亡

甘草(glycyrrhiza)是一味重要的傳統(tǒng)中藥，其主要的活性成分是甘草次酸[1-2]。研究表明，甘草次酸不僅具有抗炎、抗?jié)儭⒖惯^(guò)敏、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等功效[3-6]，還能抑制一些腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[7-8]。但是由于甘草次酸幾乎不溶于水以及高濃度時(shí)對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用，制約了其在臨床上的應(yīng)用[9]。研究表明，甘草次酸通過(guò)某些改造和修飾后，其生物活性明顯提高[10-11]。哌嗪基團(tuán)是一個(gè)增效基團(tuán)，能有效地調(diào)節(jié)藥物的脂水分配系數(shù)和酸堿平衡常數(shù)，在很多的活性藥物分子中都含有這一骨架結(jié)構(gòu)，顯示出廣泛的生物活性，如抗微生物、抗高血壓、抗癌、消炎和止痛等[12-14]。本研究將寧夏大學(xué)化工學(xué)院制備的18β-甘草次酸-哌嗪化合物D34、D35作用于SMMC-7721細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，為獲取新藥成分奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 18β-甘草次酸(GA，規(guī)格：97%，Sigma)，18β-甘草次酸哌嗪衍生物D34、D35(由本校化工學(xué)院提供，簡(jiǎn)稱D34、D35)；MTT(凱基)；RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO)；胎牛血清(HyClone)；DMSO(Sigma)；PBS(Solarbio)；Hoechst-33258細(xì)胞凋亡染色試劑盒(碧云天)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒(BD)。

1.2 主要儀器 微量移液器(Thermo)；酶標(biāo)儀(BIO-RAD)；熒光顯微鏡(LEICA，DM2500)；生物顯微鏡(OLYMPUS)；流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur)；培養(yǎng)箱(上海一恒)。

1.3 細(xì)胞株SMMC-7721 細(xì)胞株取自寧夏大學(xué)西部特色資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的種質(zhì)庫(kù)中。

1.4 方法

1.4.1 18β-甘草次酸哌嗪衍生物的合成路線 18β-甘草次酸與哌嗪基團(tuán)進(jìn)行酰胺化反應(yīng)得到18β-甘草次酸-哌嗪化合物(圖1)。D34、D35為其中的兩種化合物。

圖1 18β-甘草次酸哌嗪衍生物的合成路線Fig.1 The method of synthesizing 18β-GA derivatives containing piperazine

1.4.2 SMMC-7721細(xì)胞的培養(yǎng) 培養(yǎng)基：RPMI 1640培養(yǎng)基(含有100 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)；培養(yǎng)條件：50 mL/L的CO2的培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。

1.4.3 鏡檢法觀察18β-甘草次酸衍生物對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 先將D34、D35、GA用DMSO配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的貯備液，臨用前用培養(yǎng)液稀釋成濃度梯度為50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL，備用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以3×103個(gè)/孔接種于96孔板，每孔100 μL。24 h后去上清，加入已經(jīng)配置好的待測(cè)藥物，每孔100 μL。設(shè)空白對(duì)照并且每個(gè)藥物濃度設(shè)置5個(gè)平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)，在24、48、72 h三個(gè)時(shí)段用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。

1.4.4 MTT法檢測(cè)D34、D35對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以3×103個(gè)/孔接種于96孔板，每孔100 μL。24 h后去上清，加入已經(jīng)配置好的待測(cè)藥物，每孔100 μL。設(shè)空白對(duì)照并且每個(gè)藥物濃度設(shè)置5個(gè)平行孔，MTT法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用。按下述公式計(jì)算抑制率：

1.4.5 Hoechst染色觀察 取經(jīng)D34、D35、GA(終質(zhì)量濃度50 μg/mL)作用72 h后的細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞凋亡Hoechst-33258染色試劑盒提供的操作步驟處理后，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.4.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1×106個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)12 h。實(shí)驗(yàn)組分別加入終質(zhì)量濃度均為50 μg/mL藥物GA、D35、D34，對(duì)照組加入等量培養(yǎng)液。48 h后，收集細(xì)胞，按BD公司的Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)凋亡的試劑盒步驟處理，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié) 果

2.1 18β-甘草次酸衍生物對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 在顯微鏡下，未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞增殖很快，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，未出現(xiàn)膨脹和皺縮現(xiàn)象；但實(shí)驗(yàn)組隨著藥物濃度的增加以及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、裂解、甚至碎片化。提示18β-甘草次酸及其衍生物對(duì)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)有明顯影響，抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖2)。

圖2 GA、D35、D34(50 μg/mL) 作用不同時(shí)間段對(duì)SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.2 Effects of GA, D35, D34 (50 μg/mL) on the morphology of SMMC-7721cells at different time points (×200)

2.2 D34、D35、GA對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用 MTT法結(jié)果顯示，不同濃度的GA、D35、D34對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖均有抑制作用，呈濃度依賴性，且D35、D34對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖抑制率高于GA。經(jīng)單因素ANOVA分析，D34、D35各組抑制率與對(duì)照組GA相比除個(gè)別數(shù)據(jù)外差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.3 Hoechst-33258熒光染色顯示藥物對(duì)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)影響 收集經(jīng)GA、D35、D34(終質(zhì)量濃度均為50 μg/mL)處理72 h后的細(xì)胞，按細(xì)胞凋亡Hoechst-33258染色試劑盒步驟操作，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，經(jīng)染色呈現(xiàn)正常的均勻的藍(lán)色，只有個(gè)別細(xì)胞破碎，呈現(xiàn)亮藍(lán)色；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞結(jié)構(gòu)變形，呈現(xiàn)碎片狀，熒光顏色呈現(xiàn)亮藍(lán)色(圖3)。提示D34、D35對(duì)肝癌細(xì)胞有誘導(dǎo)其凋亡的作用。

圖3 Hoechst 染色SMMC-7721細(xì)胞的凋亡情況Fig.3 Apoptosis of Hoechst staining of SMMC-7721 cells (72 h, ×400)

表1 不同濃度D34、D35、GA對(duì)SMMC-7721人肝癌細(xì)胞的抑制率Tab.1 The inhibition rate of D34, D35 and GA on SMMC-7721 cells

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率的比較 收集經(jīng)GA、D34、D35(終質(zhì)量濃度均為50 μg/mL)作用48 h的細(xì)胞，對(duì)照組為加入與實(shí)驗(yàn)組等量的培養(yǎng)液的細(xì)胞，按BD公司Annexin V-FITC/PI雙染的檢測(cè)凋亡的試劑盒步驟處理，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率(FL1為FITC熒光通道，F(xiàn)L2為PI熒光通道)。結(jié)果顯示，GA作用細(xì)胞后的凋亡率為23.95%、D35為26.71%、D34為36.95%，均高于未加藥處理組(4.23%)，且D35、D34的流式檢測(cè)凋亡率高于GA組(圖4)。

圖4 SMMC-7721細(xì)胞流式凋亡圖(48 h, 50 μg/mL)Fig.4 Apoptosis of SMMC-7721cells detected by flow cytometry (48 h, 50 μg/mL)

3 討 論

甘草次酸及其衍生物具有廣泛的藥理活性，特別是在抗腫瘤方面。越來(lái)越多的研究表明，18β-甘草次酸對(duì)多種癌細(xì)胞，如HepG2肝癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞等表現(xiàn)出比較強(qiáng)的生物活性[15]。高振北等[16]對(duì)18β-甘草次酸A環(huán)進(jìn)行改造，其體外抗腫瘤活性與GA比明顯增強(qiáng)。文獻(xiàn)也報(bào)道了對(duì)甘草次酸進(jìn)行其他化學(xué)修飾和結(jié)構(gòu)改造后活性的變化，其抗炎、抗腫瘤、抗病毒等活性均得到提高[10-11]。

哌嗪基團(tuán)是一個(gè)增效基團(tuán)，在很多的活性藥物分子中都含有這一骨架結(jié)構(gòu)，一些藥物天然結(jié)構(gòu)中增加這一活性基團(tuán)后，生物活性明顯提高。李學(xué)強(qiáng)等[13]在青蒿素上嫁接哌嗪基團(tuán)后，對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖抑制率明顯增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)將18β-甘草次酸與哌嗪進(jìn)行酰胺化反應(yīng)得到了18β-甘草次酸-哌嗪化合物，經(jīng)初篩后選取其中的D34、D35作用于SMMC-7721肝癌細(xì)胞，尋求提高藥用效果、降低其毒副作用的新藥成分。

本研究結(jié)果表明，18β-甘草次酸哌嗪衍生物D34、D35等對(duì)SMMC-7721細(xì)胞均有抑制作用且優(yōu)于18β-甘草次酸，特別是D34在低濃度下作用48 h后對(duì)肝癌細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到了53%；從流式細(xì)胞凋亡數(shù)據(jù)可知，D35、D34均可誘導(dǎo)SMMC-7721肝癌細(xì)胞的凋亡，都優(yōu)于18β-甘草次酸，且D34的促凋亡比例更高 。提示，18β-甘草次酸經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)改造增加哌嗪基團(tuán)以后，其生物活性明顯提高。本研究為篩選出高活性的甘草次酸衍生物類藥物奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。而關(guān)于18β-甘草次酸哌嗪衍生物對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的促凋亡的作用機(jī)制以及是否對(duì)正常細(xì)胞有毒性等有待下一步的研究。

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(編輯 卓選鵬)

Effects of 18β-glycyrrhetinic acid derivatives containing piperazine on SMMC-7721 cell activity

HAO Xiu-jing1,2, YANG Hui2, WANG Juan1,2, LI Min1,2, LI Xue-qiang2

(1. Key Laboratory of Ministry of Education for Conservation and Utilization of Special Biological Resources in the Western China, Ningxia 750021; 2. Ningxia University, Ningxia 750021, China)

Objective To study the effects of 18β-glycyrrhetinic acid derivatives containing piperazine D34 and D35 on the proliferation and apoptosis of SMMC-7721cells. Methods The morphology of the cells treated with 18β-glycyrrhetinic acid derivatives containing piperazine D34 and D35 was observed under the microscope. The cellular inhibition rate was detected by MTT; apoptosis was detected by Hoechst-33258 Staining Kit; and apoptosis rate was analyzed by flow cytometry method. Results The proliferation of SMMC-7721 cells was significantly inhibited by 18β-glycyrrhetinic acid derivatives containing piperazine D34 and D35 in a dose-dependent manner (P<0.05). Conclusion 18β-glycyrrhetinic acid derivatives containing piperazine D34 and D35 can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of SMMC-7721 cells, and they are superior to GA.

18β-glycyrrhetinic acid; piperazine derivative; SMMC-7721; apoptosis

2015-12-01

2016-05-23

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.21062014)

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.21062014)

郝秀靜. E-mail: shuaxinxianlu@163.com

R966

A

10.7652/jdyxb201606005

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20161010.1656.008.html(2016-10-10)