張 瑩，劉 旭，王 彬，潘秀頡，楊陟華，周平坤，朱茂祥，顧永清

(1. 石河子大學醫(yī)學院，新疆石河子 832003；2. 石河子大學生命科學學院，新疆石河子 832003；3. 軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所，北京 100850)

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◇基礎研究◇

人CAP1蛋白與PIF1解螺旋酶及其剪接體蛋白的相互作用

張 瑩1,3，劉 旭2,3，王 彬2,3，潘秀頡3，楊陟華3，周平坤3，朱茂祥3，顧永清1,3

(1. 石河子大學醫(yī)學院，新疆石河子 832003；2. 石河子大學生命科學學院，新疆石河子 832003；3. 軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所，北京 100850)

目的 在細胞水平及體外驗證腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白1(CAP1)蛋白與PIF1解螺旋酶及其剪接體是否存在相互作用。方法 采用激光共聚焦免疫熒光實驗，通過細胞內(nèi)蛋白共定位確定蛋白質(zhì)間的相互作用關(guān)系；GST Pull-down實驗在體外驗證CAP1與PIF1及其剪接體是否存在直接的相互作用。結(jié)果 激光共聚焦免疫熒光實驗顯示，CAP1與PIF1全長蛋白及其剪接體BC018978沒有共定位，但與剪接體AF108138C存在共定位。GST Pull-down未檢測到CAP1與PIF1全長及其剪接體的相互作用。結(jié)論 CAP1與PIF1剪接體蛋白可能存在非直接相互作用。

腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白1(CAP1)；PIF1；激光共聚焦免疫熒光；GST Pull-down

能使DNA雙鏈解開形成單鏈的酶是DNA解螺旋酶，在幾乎所有的核酸代謝過程中都很重要。因此，一些DNA解螺旋酶的突變會引起人類遺傳病，如Bloom綜合征、Werner’s綜合征以及Rothmund-Tomson綜合征等[1]。PIF1解螺旋酶家族在從酵母到人的進化中非常保守，對維持基因組的穩(wěn)定非常重要。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的PIF1蛋白在體內(nèi)具有眾多生理功能[2-6]，如參與DNA損傷修復、抑制端粒酶活性、參與岡崎片段的成熟、抑制rDNA復制、參與G4 DNA解聚等。

人類PIF1解螺旋酶的研究起步較晚。現(xiàn)有研究顯示，人PIF1能調(diào)節(jié)端粒長度、G4 DNA的解鏈及抑制腫瘤細胞凋亡等生理活動[7-10]。已有研究顯示，PIF1解螺旋酶在細胞癌變過程中也有發(fā)揮了重要的作用[11]。多種真核生物都有不止1個PIF1同源蛋白[2]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，盡管人只有1個PIF1蛋白，但人PIF1具有多個剪接體，這可能彌補了其只有1個PIF1解螺旋酶的不足，多個剪接體可能具有不同生理功能，參與生物體內(nèi)代謝。

CAP1(edenylyl cyclese-essocieted protein 1)即腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白1，最先于釀酒酵母中被發(fā)現(xiàn)，名為CAP/Srv2。釀酒酵母中該類蛋白N端結(jié)構(gòu)域可與腺苷酸環(huán)化酶Cyr1結(jié)合參與Ras信號通路，影響酵母細胞生長，C端結(jié)構(gòu)域通過與G蛋白結(jié)合而影響Actin等肌動蛋白的聚合，參與調(diào)控細胞骨架的動態(tài)平衡。有研究表明，在人類細胞中CAP1蛋白C端結(jié)構(gòu)域具有與酵母細胞中同樣的功能，參與調(diào)控肌動蛋白的聚合，其N端結(jié)構(gòu)域功能目前研究較少，是否參與Ras信號通路目前尚不能證實。在前期研究中，我們通過酵母雙雜交實驗篩選出CAP1蛋白與PIF1具有相互作用, 本研究旨在確定PIF1全長及其剪接體蛋白與CAP1的相互作用，為進一步全面了解PIF1及其剪接體的生理功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 pMStRNA質(zhì)粒由日本廣島大學Yuji Masuda博士惠贈；質(zhì)粒Myc-CAP1、Flag-PIF1、Flag-PIF1N、Flag-PIF1C、pEGX-4T-1由本實驗室保藏；LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；GST、Myc、His標簽抗體購自Santa Cruz Biotechnology；Flag標簽抗體購自Sigma公司；熒光標記二抗Alexa Fluor?488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody，Alexa Fluor?568 conjugate Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody購自Life Technologies公司。

1.2 激光共聚焦免疫熒光實驗 于60 mm培養(yǎng)皿中先放置細胞玻片，按1×104/皿接種細胞，待長至12 h轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。具體轉(zhuǎn)染程序按LipofectamineTM2000操作說明進行。12 h后將細胞玻片放置于6孔板中，PBS清洗3次，預冷的40 g/L多聚甲醛4 ℃固定備用。PBS清洗3次，2.5 mL/L Triton 100破膜20 min，10 g/L BSA室溫封閉30 min。一抗?jié)窈袃?nèi)4 ℃過夜。PBS清洗3次，熒光二抗室溫避光孵育1 h。PBS清洗3次，滴加DAPI，濕盒內(nèi)室溫避光孵育20 min。100 mL/L甘油封片，濕盒避光保存。激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.3 CAP1原核表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以pEGX-4T-1質(zhì)粒為載體，構(gòu)建帶GST標簽的CAP1蛋白原核細胞表達重組質(zhì)粒。生物信息學網(wǎng)站查ORF框，并設計引物。F：5′-CGCGTCGACCATGGCTGACATGCAAAATCT-3′，R，5′-GGAAGATCTCTTATCCAGCAATTTCTGTCAC-3′。反應總體系50 μL，反應條件為：94 ℃ 2 min變性，98 ℃ 10 s退火，68 ℃ 2 min延伸，38個循環(huán)。限制性內(nèi)切酶SalⅠ和NotⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物及pGEX-4T-1，凝膠回收純化后，將目的片段與線性化pGEX-4T-1載體連接，構(gòu)建GST-CAP1，送公司進行測序鑒定。

1.4 蛋白的原核誘導表達 將GST-CAP1與pMStRNA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，挑取單克隆接種到3 mL雙抗培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)過夜，第2天接種至新的10 mL雙抗培養(yǎng)液中，20 ℃培養(yǎng)。待長至對數(shù)生長期時，收菌1 mL作為0 h 樣品，余下菌液中加入IPTG，每隔2 h收菌1次，并檢測各時間點菌液A600值。加入相應2×loading buffer，100 ℃煮沸5 min，離心后取上清用于后續(xù)考馬斯亮藍染色及Western blot檢測。

1.5 考馬斯亮藍染色 將處理好的樣品取上清10 μL 進行SDS-PAGE電泳分離，然后將分離膠部分浸泡于考馬斯亮藍染液中，置于搖床上室溫下緩慢搖動4 h。將染色后的分離膠浸泡于脫色液中，置于搖床上緩慢搖動，直至可看到清晰條帶為止。

1.6 Western blot檢測 取處理好的樣品上清10 μL進行SDS-PAGE電泳分離，先80 V恒壓電泳30 min，再120 V電泳1 h。100 V恒壓濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜70 min，50 g/L脫脂牛奶室溫封閉1 h。一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜，8 min/次，共3次。相應二抗(1∶4 000)室溫孵育1 h。TBST洗膜，8 min/次，共3次。ECL顯色。

1.7 GST Pull-down實驗 GST-CAP1的原核誘導表達菌體，經(jīng)細胞重懸、超聲裂解，離心取上清。上清中加50%谷胱甘肽-瓊脂糖珠懸液制備結(jié)合GST融合蛋白谷胱甘肽-瓊脂糖珠，PBS清洗3次。同時，His-PIF1、His-PIF1C和His-PIF1N原核誘導表達菌體，也經(jīng)細胞重懸，超聲裂解，離心取上清，分別加入各GST融合蛋白反應體系中。100 g/L SDS-PAGE分離蛋白樣品，行Western blot分析。

2 結(jié) 果

2.1 人PIF1的生物信息學分析 人PIF1基因位于染色體15q22.31(圖1A)，含有13個外顯子，共覆蓋10 000 bp基因組序列(圖1B)。人PIF1cDNA全長2 682 bp，GenBank開放閱讀框(ORF)長1 926 bp(GenBank accession number, EU084033)，編碼一個含有641個氨基酸的蛋白質(zhì)，計算PIF1蛋白分子質(zhì)量為70 ku。GenBank數(shù)據(jù)庫分析顯示，人PIF1有多個剪接體(圖1C)，剪接體的GenBank accession number分別為BC018978、AF108138、AK026345、BC033254，其中分子質(zhì)量最小的剪接體BC018978，含2個外顯子，分子質(zhì)量最大的剪切體AF108138，含11個外顯子。多個剪接體提示PIF1具有眾多的復雜功能，剪接體也直接參與生物體內(nèi)代謝功能。

圖1 人PIF1的生物信息學分析Fig.1 Bioinformatics analysis of human PIF1

DNA解螺旋酶的一個重要特征是在解螺旋酶的一級結(jié)構(gòu)中存在一些高度保守的氨基酸序列，被稱作解螺旋酶模序(helicase motif)，對解螺旋酶的功能起重要作用。經(jīng)分析PIF1解螺旋酶結(jié)構(gòu)域位于剪切體AF108138。此外，在前期研究中，我們通過生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)PIF1解螺旋酶家族不僅7個解螺旋酶區(qū)域在進化中高度保守，其解螺旋酶模序的上游，PIF1蛋白的N-末端在進化中也很保守，具有較高的同源性。我們將其命名為PINT功能域(PIF1 N-terminal, domain)，經(jīng)分析PINT結(jié)構(gòu)域位于剪切體BC018978。

2.2 激光共聚焦免疫熒光實驗分析PIF1剪接體與CAP1存在細胞內(nèi)共定位 將PIF1全長cDNA、包含PINT結(jié)構(gòu)域的N端(剪接體BC018978)、包含解螺旋酶模序的C端(剪接體AF108138)，分別插入帶Flag標簽的pCMV-Tag 2B真核表達載體，產(chǎn)生重組質(zhì)粒命名為Flag-PIF1、Flag-PIF1N和Flag-PIF1C。CAP1插入真核表達載體PCMV-Myc，產(chǎn)生重組質(zhì)粒命名為Myc-CAP1。Flag-PIF1、Flag-PIF1N和Flag-PIF1C分別與Myc-CAP1共轉(zhuǎn)染HeLa細胞，激光共聚焦分析CAP1及其剪接體是否存在細胞內(nèi)共定位。結(jié)果顯示，PIF1全長主要存在于細胞核，CAP1主要存在于細胞質(zhì)，二者在細胞內(nèi)沒有共定位(圖2)。PIF1N也主要存在于細胞核，與CAP1沒有共定位(圖3)，而PIF1C主要存在于細胞質(zhì)，與CAP1在細胞內(nèi)共定位(圖4)。

圖2 CAP1蛋白與PIF1全長蛋白在細胞內(nèi)的定位Fig.2 Intracellular location of CAP1 and PIF1 full-length protein

圖3 CAP1蛋白與PIF1N蛋白在細胞內(nèi)的定位Fig.3 Intracellular location of CAP1 and PIF1N protein

圖4 CAP1蛋白與PIF1C蛋白在細胞內(nèi)的定位Fig.4 Intracellular location of CAP1 and PIF1C protein

2.3 GST Pull-down實驗體外驗證PIF1及其剪接體蛋白與CAP1的相互作用

2.3.1 CAP1原核表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建 CAP1 cDNA全長2 781 bp，開放閱讀框ORF 1 428 bp。以HeLa細胞cDNA為模板經(jīng)PCR擴增CAP1 ORF(圖5)，PCR產(chǎn)物酶切后插入原核表達重組質(zhì)粒pGEX-4T-2得到原核表達重組質(zhì)粒，測序正確，命名為GST-CAP1。

圖5 CAP1原核表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.5 Construction of the prokaryotic expression recombinant plasmids of CAP1

PIF1全長基因及其剪接體蛋白插入帶his標簽的原核表達載體pET15b，命名為His-PIF1、His-PIF1N、 His-PIF1C。

2.3.2 原核誘導表達蛋白的鑒定 將原核表達質(zhì)粒GST-CAP1與pMStRNA質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化BL21菌株感受態(tài)細胞，經(jīng)誘導表達后，按不同時間點收菌液。經(jīng)考馬斯亮藍染色及Western blot驗證，得到特異性條帶，與預計分子質(zhì)量大小一致，表達量隨時間延長而增加，表明GST-CAP1在大腸桿菌成功表達(圖6)。

圖6 GST-CAP1原核誘導表達Fig.6 The prokaryotic-induced expression of GST-CAP1

帶His標簽的PIF1全長及其剪接體重組質(zhì)粒His-PIF1、His-PIF1N、His-PIF1C經(jīng)考馬斯亮藍染色及Western blot驗證，也得到與預計分子質(zhì)量大小一致的特異性條帶70、55、22 ku，且條帶濃度隨時間延長而增加，表明上述原核表達質(zhì)粒均能夠?qū)崿F(xiàn)誘導表達(圖7～圖9)。

圖7 His-PIF1原核誘導表達Fig.7 The prokaryotic-induced expression of His-PIF1

圖8 His-PIF1N原核誘導表達Fig.8 The prokaryotic-induced expression of His-PIF1N

圖9 His-PIF1C原核誘導表達Fig.9 The prokaryotic-induced expression of His-PIF1C

2.3.3 GST Pull-down驗證蛋白相互作用關(guān)系 首先PIF1全長及剪接體蛋白的Input分別在70、55、22 ku 處有特異性條帶，CAP1蛋白Input也可見特異性條帶，表明帶GST標簽的CAP1、PIF1全長及剪接體蛋白正確表達(圖10)。但是，讓我們意外的是，GST pull-down顯示帶GST標簽的CAP1并不能把PIF1全長蛋白、PIF1N沉淀下來，甚至PIF1C也不能沉淀下來。

圖10 GST Pull-down實驗體外驗證相互作用關(guān)系Fig.10 Verification of the interaction by GST Pull-downinvitro

3 討 論

DNA遺傳信息的讀取需要其雙鏈的打開并暴露出其中的堿基序列作為模版， DNA雙鏈解開形成單鏈的酶是DNA解螺旋酶，在幾乎所有的核酸代謝過程中都很重要，對維持基因組的穩(wěn)定是必須的。因此一些螺旋酶突變會導致Werner綜合征(Werner syndrome, WS)、Bloom綜合征(Bloom syndrome, BS)等多種人類遺傳疾病[1]。

PIF1解螺旋酶家族在從酵母到人的進化中非常保守。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的PIF1蛋白對維持基因組的穩(wěn)定具有重要作用，在體內(nèi)具有眾多生理功能[2-6]，如參與DNA損傷修復、抑制端粒酶活性、參與岡崎片段的成熟、抑制rDNA復制、參與G4 DNA解聚等。釀酒酵母還有一個PIF1同源蛋白-RRM3，似乎具有與PIF1不同的生理功能，例如促進rDNA復制，在RRM3缺失的酵母細胞中包括rDNA、tRNA、中心體DNA、端粒DNA均發(fā)現(xiàn)復制叉的停頓。

除釀酒酵母存在2個PIF1解螺旋酶外，在一些真菌基因組(如白色念珠菌，新型隱球菌)也編碼2個PIF1家族解旋酶[2]，擬南芥有3種PIF1解旋酶，原生動物寄生蟲有7到8種PIF1解旋酶。多種真核生物存在2種以上PIF1解螺旋酶提示PIF1家族解螺旋酶在體內(nèi)功能眾多，有些看起來互相拮抗，從而使生物體處于動態(tài)平衡具有不同功能，處于動態(tài)平衡，提示其具有非常重要的作用。

人PIF1全長直到2006年才首次被克隆，隨后研究顯示人PIF1具有調(diào)節(jié)端粒長度、參與G4 DNA的解鏈 、抑制腫瘤細胞凋亡等眾多生理功能[7-10]。最近研究表明人PIF1解螺旋酶在細胞癌變過程中也發(fā)揮了重要的作用[11]。和釀酒酵母、擬南芥不同的是，人只有一種PIF1解螺旋酶。但是在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，人PIF1有多個剪接體(圖1)，剪接體的GenBank accession number分別為BC018978、AF108138、AK026345、BC033254，其中分子質(zhì)量最小的剪接體BC018978，含2個外顯子，分子質(zhì)量最大的剪接體AF108138，含11個外顯子。

DNA解螺旋酶的一個重要特征是在解螺旋酶的一級結(jié)構(gòu)中存在一些高度保守的氨基酸序列，被稱作解螺旋酶模序(helicase motif)，對解螺旋酶的功能起重要作用。經(jīng)分析PIF1解螺旋酶結(jié)構(gòu)域位于剪切體AF108138。此外，在前期研究中，我們通過生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)PIF1解螺旋酶家族不僅7個解螺旋酶區(qū)域在進化中高度保守，其解螺旋酶模序的上游，PIF1蛋白的N-末端在進化中也很保守，具有較高的同源性[12]。我們將其命名為PINT功能域(PIF1 N-terminal, domain)，PINT功能域具有與解螺旋酶矛盾的使DNA雙鏈退火的功能，經(jīng)分析PINT結(jié)構(gòu)域位于剪接體BC018978。PIF1具有多個剪接體可能彌補了其只有一個PIF1解螺旋酶的不足，多個剪接體可能具有不同生理功能，參與生物體內(nèi)代謝。

為了進一步探索人PIF1及其有代表性的剪接體AF108138(本研究中我們命名為PIF1C)、BC018978(本研究中我們命名為PIF1N)的功能及作用機制，本研究旨在通過篩選PIF1全長、PIF1C及PIF1N的相互作用蛋白，以全面了解PIF1及其剪接體的生理功能。

在前期研究中，我們通過酵母雙雜交實驗，篩選到CAP1與PIF1具有相互作用。CAP1是一類廣泛存在于真核生物的保守蛋白[13]，在人類肝癌、胰腺癌等多種癌細胞中均發(fā)現(xiàn)CAP1的表達變化，提示CAP1可能參與癌細胞的轉(zhuǎn)移、侵入[14-15]。另有報道稱其在肺癌細胞中存在生化性質(zhì)轉(zhuǎn)變并具有作為顱內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移診斷標志物的潛在應用前景[16]。此外，在胰腺癌等多種癌細胞中，CAP1存在表達上調(diào)并推測可能促進細胞遷移[17]。而人PIF1解螺旋酶在細胞癌變過程中也發(fā)揮了重要的作用。因此，我們推測PIF1可能通過與CAP1相互作用發(fā)揮在腫瘤發(fā)生中的作用。

本研究首先通過激光共聚焦實驗觀察CAP1與PIF1全長及其剪接體是否在細胞內(nèi)共定位，結(jié)果顯示PIF1全長和PIF1N主要定位于細胞核，而CAP1定位于細胞質(zhì)，所以PIF1全長和PIF1N與CAP1沒有共定位。PIF1C主要在細胞質(zhì)中表達，因此剪切體PIF1C與CAP1在細胞質(zhì)內(nèi)共定位。隨后我們試圖通過GST Pull-down實驗進一步確定PIF1C與CAP1的相互作用，但是讓我們意外的是帶GST標簽的CAP1并不能把PIF1全長蛋白、PIF1N沉淀下來，甚至PIF1C也不能沉淀下來。該結(jié)果提示有2種可能性：一是CAP1與PIF1及其剪接體的相互作用很可能是短暫的、微弱的，由于實驗方法限制并不能靈敏的檢測到。因為PIF1蛋白N-末端為一級去穩(wěn)定殘基的亮氨酸，容易通過泛素化標記被蛋白酶體降解，與之相對應的是PIF1在人體大部分組織中均低表達。因此，體內(nèi)PIF1剪接體與CAP1的作用可能是短暫的，甚至是微弱的。在體外這種短暫的、微弱的相互作用由于實驗方法限制并不能靈敏地檢測到。二是PIF1C與CAP1的相互作用是間接的，還需要其他蛋白介導，而GST Pull-down實驗只能檢測蛋白質(zhì)的直接相互作用。因此，我們還將選擇其他的研究蛋白質(zhì)相互作用的實驗方法，如雙分子熒光互補技術(shù)(Bimolecular fluorescence complementation, BiFC)[18-19]、Far-western blotting[20-21]，進一步驗證PIF1剪接體與CAP1的相互作用。本研究對進一步揭示人類PIF1解螺旋酶的功能及其參與細胞生理、生化過程的機制具有積極的指導意義。

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(編輯 卓選鵬)

Interaction among human CAP1, PIF1 helicase and its splice variants proteins

ZHANG Ying1,3, LIU Xu2,3, WANG Bin2,3, PAN Xiu-jie3,YANG Zhi-hua3, ZHOU Ping-kun3, ZHU Mao-xiang3, GU Yong-qing1,3

(1. School of Medicine, Shihezi University, Shihezi 832003; 2. College of Life Sciences,Shihezi University, Shihezi 832003; 3. Department of Radiation Toxicology and Oncology, Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing 100850, China)

Objective To determine whether human CAP1 interacts with PIF1 helicase and its splice variants proteinsinvivoandinvitro. Methods The co-localization of protein was directly observed to determine the interaction between the proteins by confocal immunofluorescence assay. The GST Pull-down experiment was used to test the existence of a direct interaction between CAP1 protein and PIF1 or its splice variants proteins. Results By using confocal immunofluorescence assay, CAP1 protein and PIF1 protein or its splice variants BC018978 had no co-localization, but CAP1 and splice variants AF108138C were co-located in the cytoplasm. Experimental results of the GST Pull-down showed that there was not direct interaction between CAP1 and PIF1 or its splice variants proteins. Conclusion These results show that there may be indirect interaction between CAP1 and PIF1 splice variants proteins.

edenylyl cyclese-essocieted protein 1 (CAP1); PIF1; confocal immunofluorescence; GST Pull-down

2016-02-06

2016-05-26

國家自然科學基金資助項目(No.31160183, 31270894, 31470827)

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.31160183, 31270894 and 31470827)

顧永清. E-mail: yqgu96@163.com

R34

A

10.7652/jdyxb201606002

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20161010.1619.004.html(2016-10-10)