魏士長，吳明權(quán)，王 歡，黃銀秋，周厚琴，張 璐，趙艷玲#

(1.解放軍第302醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100039； 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137)

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黃連解毒湯治療肝炎和肝纖維化的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究Δ

魏士長1*，吳明權(quán)1，2，王 歡1，黃銀秋1，2，周厚琴1，2，張 璐1，2，趙艷玲1#

(1.解放軍第302醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100039； 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137)

目的：通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討黃連解毒湯治療肝炎和肝纖維化的作用機制。方法：結(jié)合TDT數(shù)據(jù)庫和PharmMapper Server數(shù)據(jù)庫，篩選出黃連解毒湯的作用靶點；利用OMIM數(shù)據(jù)庫，分別篩選出肝炎和肝纖維化的疾病作用靶點；將以上數(shù)據(jù)導(dǎo)入PPI數(shù)據(jù)庫進行綜合分析，進一步得出黃連解毒湯治療肝炎和肝纖維化的“化學(xué)成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)，再將該交互網(wǎng)絡(luò)Xgmml文件導(dǎo)入Cytoscapy 3.0軟件進行網(wǎng)絡(luò)可視化和各節(jié)點的拓撲參數(shù)分析，得出黃連解毒湯抗肝炎和肝纖維化相應(yīng)的作用機制。結(jié)果：黃連解毒湯對肝炎的治療作用可能是通過干預(yù)機體半乳糖凝集素3、表皮生長因子受體、磷脂酰肌醇3-激酶p85α亞基相關(guān)信號通路來實現(xiàn)的；而其治療肝纖維化的作用可能是通過干預(yù)半乳糖凝集素3相關(guān)信號通路來實現(xiàn)的。結(jié)論：黃連解毒湯可以通過干預(yù)機體半乳糖凝集素3相關(guān)通路達到治療肝炎的目的，并阻止肝炎向肝纖維化發(fā)展。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法可作為藥物治療特定疾病的生物機制的計算機預(yù)測方法，對藥物的發(fā)現(xiàn)和研究具有很好的輔助作用。

黃連解毒湯； 肝炎； 肝纖維化； 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

黃連解毒湯由黃連、黃芩、黃柏和梔子4味藥組成，具有清熱、瀉火、解毒等功效，主治實熱火毒、三焦熱盛之證，為清熱解毒的代表方劑。現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明，黃連解毒湯也具有較好的抗菌、抗內(nèi)毒素、抗氧化、抗動脈粥樣硬化等作用。但目前為止，對黃連解毒湯治療急、慢性肝病的研究相對較少，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為新興的技術(shù)方法可以對中藥作用于機體后的多成分、多途徑和多靶點進行較為全面地揭示。故本研究擬應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法，分析、預(yù)測黃連解毒湯治療肝炎和肝纖維化的作用機制。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)的構(gòu)建、藥物和疾病靶點的篩選

通過中草藥綜合數(shù)據(jù)庫TD@T(http://tcm.cmu.edu.tw/zh-tw/review-result.php?herbid=3496)，查找黃連解毒湯中4味藥物的化學(xué)成分，并下載相應(yīng)的MOL2分子結(jié)構(gòu)，再登錄PharmMapper數(shù)據(jù)庫(http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/)，上傳黃連解毒湯中4味藥物中相應(yīng)的化合物分子MOL2結(jié)構(gòu)，采用“反向藥效團匹配方法”篩選人類相關(guān)藥物靶點。通過人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫OMIM(http://www.omim.org/)搜集肝炎和肝纖維化相關(guān)的疾病靶點。其他的人類交互蛋白靶點由交互蛋白數(shù)據(jù)庫DIP(http://dip.doe-mbi.ucla.edu)獲得。

1.2 “化合物-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析

將搜集到的黃連解毒湯中4味藥中的化合物成分、藥物作用靶點、疾病作用靶點通過“蛋白-蛋白”交互信息數(shù)據(jù)庫PPI進行分析，將分析出來的結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.0軟件中進行可視化并進行各靶點的相關(guān)參數(shù)分析。有效作用靶點用點度中心性、中介中心性和接近中心性3個拓撲參數(shù)進行篩選，同時將點度中心性≥2倍中位數(shù)、中介中心性和接近中心性≥1倍中位數(shù)的靶點作為本研究得到的重要靶點。

2 結(jié)果

2.1 黃連解毒湯、肝炎和肝纖維化的靶點篩選

本研究共篩選出黃柏中20個成分、721個靶點，黃連中35個、995個靶點，黃芩中20個、450個靶點，梔子中35個、1 109個靶點，以上獲得的藥物靶點被用來進一步構(gòu)建“成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)。肝炎和肝纖維化對應(yīng)的疾病靶點分別為203和26個。

2.2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和通路分析

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為新興的系統(tǒng)生物學(xué)分析方法，可以通過計算機方法從蛋白、分子、基因?qū)用娣治稣铣鏊幬镒饔糜跈C體后的分子生物學(xué)信息，較為全面地客觀揭示藥物作用的方式和途徑。本方法通過建立可視化的“成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)(見圖1—2)，使黃連解毒湯治療肝炎和肝纖維化的復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)呈現(xiàn)出來，并進一步分析。圖1—2中三角形代表黃連解毒湯中可能的有效活性成分，正五邊形代表藥物的間接作用靶點，圓點代表肝炎相關(guān)的疾病靶點，正方形代表藥物和疾病都直接作用的靶點，斜正方形代表藥物和疾病靶點連接的交互蛋白。

圖1 黃連解毒湯治療肝炎的“成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)Fig 1 Interactive network of “compound-target-disease” of Huanglianjiedu decoction in treatment of hepatitis

圖2 黃連解毒湯治療肝炎的直接作用靶點一級“成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)Fig 2 Direct targets of first class interactive network of “compound-target-disease” of Huanglianjiedu decoction in treatment of hepatitis

黃連解毒湯治療肝炎的“成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)中直接作用靶點的拓撲參數(shù)分析結(jié)果見表1。從表1可見，黃連解毒湯治療肝炎的直接作用靶點共14個，分別為葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、周期蛋白A2、雄激素受體、5色氨酸羥化酶1、乙型肝炎病毒激活蛋白、肝細胞生長因子受體、半乳糖凝集素3、生長因子受體結(jié)合蛋白2、CYP2C9、表皮生長因子受體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1-α/β、肝配蛋白A受體2、磷脂酰肌醇3-激酶α亞基和葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶。同時，本研究對黃連解毒湯治療肝炎的“成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)中所有的蛋白靶點都進行了拓撲參數(shù)(點度中心性、中介中心性和接近中心性)分析，3個拓撲參數(shù)的中位數(shù)值分別為1、0和0.254 028。最后，本研究選擇各靶點中點度中心性≥2、中介中心性≥0、接近中心性≥0.254 028的直接作用靶點作為黃連解毒湯治療肝炎的較為重要的靶點，即葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、周期蛋白A2、雄激素受體、乙型肝炎病毒激活蛋白、肝細胞生長因子受體、半乳糖凝集素3、生長因子受體結(jié)合蛋白2、CYP2C9、表皮生長因子受體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1-α/β、肝配蛋白A受體2和磷脂酰肌醇3-激酶α亞基?；谝陨嫌嬎銠C分析結(jié)果的不確定性，本研究繼續(xù)通過查閱文獻進一步確認以上靶點是否都是有效靶點。結(jié)果顯示，在肝臟受損時肝細胞生長因子的合成與分泌增強，血清肝細胞生長因子含量檢測可能對急、慢性肝炎的鑒別具有重要意義，對不同因素導(dǎo)致的大鼠肝損傷具有保護作用[1-2]。因此，肝細胞生長因子受體對肝臟的保護也起著重要作用。半乳糖凝集素3蛋白對急性肝損傷具有一定的保護作用，其可能的保護機制為上調(diào)Mic和Mt中的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78表達[3]。磷脂酰肌醇3-激酶p85α亞基是IA型磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylcholine 3-kinase，PI3K)調(diào)節(jié)亞基的1種，是IA型PI3K中含量最豐富的亞基，能夠通過調(diào)節(jié)PI3K的活性，影響IA型PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)通路的信號傳導(dǎo)，而PI3K/Akt信號通路是調(diào)節(jié)血小板衍生因子促肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)增殖與分泌膠原的重要通道，抑制該信號通路可以抑制HSC增殖和肝內(nèi)細胞外基質(zhì)的表達，具有抗肝纖維化的作用。阻斷黏著斑激酶或PI3K可以抑制HSC的黏附和遷移，PI3K的活化對HSC I型膠原mRNA和蛋白的表達非常重要[4]。

表1 黃連解毒湯治療肝炎的“成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)中直接作用靶點的拓撲參數(shù)分析

由黃連解毒湯治療肝纖維化的網(wǎng)絡(luò)中各靶點的拓撲參數(shù)(點度中心性、中介中心性和接近中心性)分析可知，3個拓撲參數(shù)的中位數(shù)值分別為1、0和0.276 383 22。本研究選擇各靶點中≥2倍中位數(shù)值的直接作用靶點作為黃連解毒湯治療肝炎的較為重要的靶點，而該網(wǎng)絡(luò)中的唯一的直接作用靶點符合拓撲參數(shù)篩選要求，見圖3—4、表2。

圖3 黃連解毒湯治療肝纖維化的“成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)Fig 3 Interactive network of “compound-target-disease” of Huanglianjiedu decoction in treatment of liver fibrosis

圖4 黃連解毒湯治療肝纖維化直接作用靶點的一級“成分-靶點-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)Fig 4 Direct targets of first class interactive network of “compound-target-disease” of Huanglianjiedu decoction in treatment of liver fibrosis

序號UniProt數(shù)據(jù)庫識別碼靶點蛋白接近中心性點度中心性中介中心性1P17931半乳糖凝集素30290932537000596164

3 討論

黃連解毒湯作為清熱解毒的代表名方，除了具有抗炎作用之外，還具有保護心血管系統(tǒng)、腦神經(jīng)、肝臟和抗氧化、抗血栓、降血糖、降血脂、降血壓和抗腫瘤等藥理活性。隨著現(xiàn)代藥理學(xué)研究相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，人們對黃連解毒湯的研究越來越深入。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法通過圖形理論、數(shù)據(jù)挖掘以及信息可視化等方法，可以全面揭示藥物作用于疾病的相互作用機制。同時隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，越來越多的疾病被證明為復(fù)雜性疾病，如冠心病、糖尿病等，但針對復(fù)雜疾病僅選用單一成分、單一靶點的西藥進行治療，往往達不到理想的治療效果。故多成分、多靶點、多層次治療疾病的藥物的發(fā)現(xiàn)和研究日趨重要。中藥復(fù)方制劑作為傳統(tǒng)治療藥物，能夠滿足人們對復(fù)雜疾病的治療需求。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以從藥物、靶點與疾病間相互作用的整體性和系統(tǒng)性出發(fā)，通過網(wǎng)絡(luò)分析藥物、靶點與疾病間的相互關(guān)系，反應(yīng)和揭示中藥的多成分-多靶點作用關(guān)系[5]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析黃連解毒湯治療肝炎和肝纖維化的分子生物學(xué)機制，發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯可以通過調(diào)節(jié)肝細胞生長因子受體、半乳糖凝集素3和磷脂酰肌醇3-激酶p85α亞基相關(guān)信號通路治療肝炎，通過干預(yù)半乳糖凝集素3信號治療肝纖維化。由此可見，黃連解毒湯可以通過干預(yù)半乳糖凝集素3相關(guān)信號通路達到治療肝炎和肝纖維化的效果，提示半乳糖凝集素3信號通路可能是黃連解毒湯治療肝炎并阻止肝炎向肝纖維化發(fā)展的關(guān)鍵信號通路。

網(wǎng)路藥理學(xué)方法作為中藥復(fù)方制劑研發(fā)的新策略、新思路，對中醫(yī)藥理論的科學(xué)性以及對中藥新適應(yīng)證的挖掘都具有很重要的作用。但該方法仍處于發(fā)展階段，還存在許多技術(shù)難點和不足，不過，隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法的完善和發(fā)展，定會為中醫(yī)藥的現(xiàn)代化發(fā)展做出很大貢獻。

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Network Pharmacology Study on Huanglianjiedu Decoction in Treatment of Hepatitis and Liver FibrosisΔ

WEI Shizhang1，2, WU Mingquan1，2, WANG Huan1， HUANG Yinqiu1，2, ZHOU Houqin1, ZHANG Lu1，2, ZHAO Yanling1

(1.Dept.of Pharmacy, 302 Military Hospital of PLA, Beijing 100039, China; 2.College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Sichuan Chengdu 611137, China)

OBJECTIVE：To probe into the mechanism of therapeutic action of Huanglianjiedu decoction in treatment of hepatitis and liver fibrosis through network pharmacology. METHODS: To select the targets of Huanglianjiedu decoction through TDT database and PharmMapper Server data base; and to select the targets of hepatitis and liver fibrosis through OMIM database. The targets of the data were analyzed with PPI database, and then the interactive network of “compound-target-disease” could be obtained; in addition, and the interactive network Xgmml was analyzed with Cytoscapy 3.0 software for network visualization and the topology parameter value of the dots, and the mechanism of therapeutic action of Huanglianjiedu decoction was obtained. RESULTS: The therapeutic effects of Huanglianjiedu decoction in treatment of hepatitis might concentrate on intervening the related signaling pathways of the Galectin-3, epidermal growth factor receptor, PI3-kinase subunit p85-alpha; while the liver fibrosis might concentrate on intervening the related signaling pathways of the Galectin-3. CONCLUSIONS: Huanglianjiedu decoction can in treatment of hepatitis through intervening the related signaling pathways of the Galectin-3, and prevent the development of hepatitis to liver fibrosis. Meanwhile, network pharmacology method can be regarded as the prediction method of computer in biological mechanism of medication treatment for the specific diseases, which can be regarded as a good method for the discovery and research of medicine.

Huanglianjiedu decoction; Hepatitis; Liver fibrosis; Network pharmacology

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81330090、No.81173571)

R96

A

1672-2124(2016)10-1308-03

2016-08-29)

*碩士研究生。研究方向：中藥理論與應(yīng)用。E-mail：shizhangw88@163.com

#通信作者：主任藥師，博士，研究員。研究方向：中藥藥理學(xué)。E-mail：zhaoyl2855@126.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2016.10.004