于麗娟，張艷花，徐新明，吳偉偉，阿米尼古麗，瑪爾孜婭，拉扎提，田可川

（新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，烏魯木齊 830011）

利用PCR技術(shù)鑒定常見肉類來源

于麗娟，張艷花，徐新明，吳偉偉，阿米尼古麗，瑪爾孜婭，拉扎提，田可川

（新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，烏魯木齊 830011）

在提取送檢的未知肌肉組織樣品以及市購的豬肉、牛肉、羊肉樣品基因組DNA的基礎(chǔ)上，分別選用1對通用引物與3對特異性引物進行擴增，用來檢測未知樣品的畜種來源。結(jié)果顯示：通用引物擴增4種樣品均出現(xiàn)陽性條帶；分別用羊、豬、牛的特異性引物擴增樣品DNA，送檢未知樣品只在牛特異性引物擴增時出現(xiàn)了特異性目的條帶。經(jīng)PCR產(chǎn)物直接測序及同源性比對進行驗證確認(rèn)，該未知樣品與牛的同源性為100%，從而驗證了該方法的準(zhǔn)確性。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)；鑒定；常見肉類；線粒體DNA

隨著人們生活水平的不斷提高，人們對肉類的需求量越來越大。近年來，在國內(nèi)及國際貿(mào)易中，許多不法個體商人為了牟取高額利潤，用低價格的肉冒充高價格的肉，比如用豬肉冒充牛羊肉等造假行為最為常見，這不僅影響了消費者的健康，而且還會涉及到宗教信仰等問題，致使人們越來越關(guān)注肉類食品的動物來源［1］。由于許多制假及摻假肉食品，在宏觀形態(tài)學(xué)方面不易辨別，為此，執(zhí)法機關(guān)對市面上的樣品進行鑒定時需要一種科學(xué)準(zhǔn)確的方法，為打假摻雜提供證據(jù)。因此，對未知的動物組織進行畜種源性鑒定，一直是科研人員致力解決的問題。

近年來，PCR技術(shù)因其靈敏、快速、操作簡便等優(yōu)點，在肉類和物種鑒定應(yīng)用中得到了快速發(fā)展，成為肉類鑒別及肉類摻假檢驗的主要技術(shù)［2］。mtDNA由于穩(wěn)定性好、拷貝數(shù)多、無組織特異性等優(yōu)點，常作為目標(biāo)基因被用于物種鑒定。其中，經(jīng)常被用于擴增線粒體DNA的區(qū)域包括細(xì)胞色素 b、D-loop、12S rRNA、16S rRNA、ATP6和ATP8等［3］。本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)，利用PCR方法對有關(guān)部門送檢的肌肉組織樣品進行種屬鑒定，為相關(guān)執(zhí)法部門打擊不法商販、維護消費者合法利益提供有力科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗樣品 1份樣品來自有關(guān)部門送檢的未知動物肌肉組織樣本，另外3份分別為生鮮羊肉、生鮮牛肉和生鮮豬肉，均購于市場。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備 瓊脂糖、Taq酶、dNTPs、Marker（DL2000）、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒等均購自大連寶生物有限公司；ABI 9700PCR儀（美國ABI公司）、DYY-Ⅲ32型平板電泳槽（北京市六一儀器廠）、UV-1000凝膠成像系統(tǒng)（北京賓達(dá)英創(chuàng)科技有限公司）、BECKMAN ND-1000 Spectrophotometer分光光度計（美國）、3－16K型低溫離心機（Sigma，德國）等。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 每個樣品稱取30 mg，按照天根生化科技有限公司生產(chǎn)的產(chǎn)品DP304-血液、組織、細(xì)胞基因組提取試劑盒的說明書的操作步驟對樣品進行全基因組提取。

1.2.2 PCR擴增 引物序列及擴增片段長度見表1，引物由上海生工生物工程公司合成。

PCR擴增反應(yīng)體系25 μL：10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTPs 2.0 μL（2.5 mmol/L），引物各1 μL（2.5 pmol/μL），Taq酶0.5 μL（5 U/μL），模板DNA 1.5 μL（空白對照加ddH2O），ddH2O補至25μL。

通用引物擴增條件：95℃預(yù)變性4 min，94℃45 s，69℃90 s，72℃60 s，35個循環(huán)，72℃延伸7 min。牛特異性引物擴增條件：95℃預(yù)變性4 min，94℃45 s，63℃30 s，72℃60 s，30個循環(huán)，72℃延伸7 min。羊特異性引物擴增條件：95℃預(yù)變性4 min，94℃45 s，59℃30 s，72℃60 s，30個循環(huán)，72℃延伸7 min。豬特異性引物擴增條件：95℃預(yù)變性3 min，94℃30 s，60℃20 s，72℃20 s，35個循環(huán)，72℃延伸5 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物純化和測序 利用膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行回收純化，送上海生工生物工程公司進行序列測定。

表1 引物序列及擴增片段長度

2 結(jié)果與分析

2.1 通用引物擴增結(jié)果

圖1 通用引物檢測不同樣品PCR電泳圖

采用通用引物對送檢樣品、豬、牛、羊肌肉組織樣品所提取的DNA進行PCR擴增，均檢測出陽性條帶，其中牛和羊的目的片段均為234 bp，豬的目的片段為239 bp，如圖1。

圖2 羊特異性引物PCR擴增不同樣品電泳圖

2.2 特異性引物擴增結(jié)果

用羊特異性引物擴增樣品DNA時，只有4號市購羊肉樣品中檢測出了特異性條帶，其他樣品未檢測出特異性條帶，如圖2；用豬特異性引物擴增樣品DNA時，只有2號市購豬肉樣品中檢測出了特異性條帶，其他樣品均未檢測出特異性條帶，如圖3；用牛特異性引物擴增樣品DNA時，1號送檢樣品與3號市購牛肉樣品均檢測出特異性條帶，其余樣品未檢測出特異性條帶，如圖4。

圖3 豬特異性引物PCR擴增不同樣品電泳圖

圖4 牛特異性引物PCR擴增不同樣品電泳圖

2.3 PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果

將牛特異性引物擴增送檢樣品的PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果用BLAST2.2.9進行匹配查詢基因庫比對，此序列與牛（Bos taurus）線粒體DNA D-loop區(qū)序列同源性達(dá)到100%，如圖5。

圖5 送檢樣品線粒體DNAD-loop區(qū)部分片段測序結(jié)果

3 討論

近年來，由于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)具有較高的靈敏度和特異性，使得以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測方法被廣泛應(yīng)用于肉類食品的種屬鑒定。許多研究者根據(jù)不同物種基因序列設(shè)計特異性引物，然后利用特異性引物擴增目的片段，通過電泳檢測鑒別肉類食品中可能的物種來源［8］。

在靶基因選擇方面，線粒體基因組DNA由于具有結(jié)構(gòu)簡單、母系遺傳、高度的物種特異性、拷貝數(shù)多、加熱時不容易被徹底破壞，存活機率大，更容易被擴增，不會發(fā)生基因重組等優(yōu)點成為肉類食品種屬鑒定的首選靶標(biāo)［9］。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)分析總結(jié)，Cytb基因、D-Loop區(qū)、12S rRNA、16S rRNA、ATP6和ATP8等線粒體基因常被選用作為肉種類鑒定的PCR擴增區(qū)域。馬伊薩蘭等［10］利用Cytb基因序列分析鑒定肉制品摻假；張全芳等［11］據(jù)山羊、綿羊和狐貍線粒體16S rRNA基因間序列差異，設(shè)計特異性引物，建立了3種肉類成分快速檢測的多重PCR方法。王蘭萍等［12］通過擴增黃牛肉、牦牛肉和水牛肉的12S rRNA序列并結(jié)合測序結(jié)果來鑒別牛肉的種源。本研究中，首先利用幾種動物的通用引物，分別擴增豬肉、牛肉、羊肉及送檢未知樣品的16S rRNA序列，4個樣品均為陽性。然后分別用豬肉、牛肉、羊肉的特異性引物分別擴增4個樣品的mtDNA中的保守序列，結(jié)果顯示，送檢未知樣品只在牛特異性引物擴增時出現(xiàn)了特異性條帶。經(jīng)PCR產(chǎn)物直接測序及同源性比對進行驗證確認(rèn)，該未知樣品與牛的同源性為100%，從而驗證了該方法的準(zhǔn)確性。因此，結(jié)合運用PCR擴增和DNA測序技術(shù)是一種精確可靠的方法，能夠有效地運用于常見肉類的種源鑒別。該方法可為相關(guān)食品監(jiān)管部門鑒別肉制品摻假造假提供技術(shù)支持。

4 結(jié)論

本實驗通過利用通用引物與特異性引物PCR擴增的方法來檢測送檢樣品的畜種來源，并通過直接測序驗證其結(jié)果的可靠性，最終確定送檢樣品為牛肉，進一步證明該方法用于豬肉、牛肉、羊肉等常見肉類種屬鑒定的可信性。

［1］ 熊蕊，郭鳳柳，劉曉慧，等.牛羊肉中摻雜豬肉的PCR方法的建立和初步應(yīng)用［J］.食品工業(yè)，2014，35（8）：199-202.

［2］ 薛超波，王萍亞，李素芳，等.基于PCR多物種鑒定技術(shù)及其在肉類鑒定中的應(yīng)用［J］.食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2016，7（2）：562-566.

［3］ 高敬，魏迪，張癸榮，等.常見肉類鑒別技術(shù)研究進展［J］.食品科學(xué)，2014，35（11）：356-360.

［4］ Bottero MT，Civera T，Nucera T，et al.Design of universal primers for the detection of animal tissues in feedstuff［J］.ProQuest Agriculture Journal，2003，27：667-669.

［5］ Tartaglia M，Saulle E，Pestalozza S，et al.Detection of bovine mitochondrial DNA in ruminant feeds：a molecular approach to test for the presence of bovine-derived materials［J］.Journal of Food Protection，1998，61：513-518.

［6］ Bottero M T，Dalmasso I A，Nucera T，et al.Development of a PCR assayfor the detection of animal tissues in ruminant feeds［J］.Journal ofFood Protection，2003，66：2307-2312.

［7］ Dooley J B，Kelly E P，Stephen D G，et al.Detection of meat species using Taqman real-time PCR assays［J］.Meat Science，2004，68：431-438.

［8］ 何瑋玲，張馳，楊靜，等.食品中4種肉類成分多重PCR的快速鑒別方法［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（9）：1873-1880.

［9］ 任君安，黃文勝，葛毅強，等.肉制品真?zhèn)舞b別技術(shù)研究進展［J］.食品科學(xué)，2016，37（1）：247-256.

［10］馬伊薩蘭，呂明星，唐俊妮，等.用Cytb基因序列分析鑒定肉制品摻假［J］.中國食品衛(wèi)生雜志，2016，28（1）：48-51.

［11］張全芳，馬德源，劉艷艷，等.利用多重PCR技術(shù)檢測羊肉中摻雜狐貍?cè)獾姆椒ㄑ芯浚跩］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，46（12）：4-6.

［12］王蘭萍，耿榮慶，王偉，等.基于線粒體12S rRNA基因序列鑒別牛肉的種源［J］.家畜生態(tài)學(xué)報，2013，34（2）：19-21.

Application of PCR Technique in the Identification of Species Origin of Common Meat

Yu Lijuan，ZhangYanhua，Tian Kechuan，et al
（Institude ofAnimal Science，XinjiangAcademyofAnimal Science，Urumqi 830011，China）

The DNA samples were extracted from unknown muscle tissue sample，pork，beef and mutton for PCR amplification using one pair ofuniversal primers and three pairs of specific primers，in order to detect the species of the unknown muscle tissue sample.The result showed that both positive bands appeared when four samples were amplified by universal primers；When DNA samples were amplified by specific primers，the unknown samples appeared specific target band under using bovine specific primers.The PCR products were sequenced and homology alignment was verified，the result showed that the homology between unknown sample and cattle was 100%，toverifythe accuracyofthe method.

polymerase chain reaction（PCR）technique；identification；common meat；mitochondrial DNA

S826.2

A

2095-3887（2016）05-0007-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.05.002

2016-08-01

新疆維吾爾自治區(qū)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費資助項目“細(xì)毛羊毛品質(zhì)性狀相關(guān)基因功能鑒定及生物信息學(xué)分析”；新疆絨毛用羊遺傳育種與繁殖重點實驗室（XJYS1105）

于麗娟（1986-），女，助理研究員，碩士。研究方向：動物分子遺傳。

田可川（1963-），男，研究員，博士。研究方向：動物遺傳育種。