武 超，許杜娟,2，楊 翠，夏 泉,2，張醫(yī)浩

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黃芪皂苷Ⅱ增加5-氟尿嘧啶對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2增殖抑制作用

武 超1，許杜娟1,2，楊 翠1，夏 泉1,2，張醫(yī)浩1

目的 探討黃芪皂苷Ⅱ增加5-氟尿嘧啶對(duì)人肝癌細(xì)胞株(HepG2)增殖抑制作用及其可能機(jī)制。方法 采用MTT方法檢測(cè)5-氟尿嘧啶單獨(dú)或聯(lián)合黃芪皂苷Ⅱ作用于細(xì)胞后，5-氟尿嘧啶對(duì)HepG2的抑制率；Hoechst33342染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡；Western blot檢測(cè)絲裂原活化蛋白激酶(ERK1/2)、磷酸化絲裂原活化蛋白激酶(p-ERK)以及凋亡蛋白多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)、活化凋亡蛋白多聚ADP-核糖聚合酶(Cleaved PARP)、活化半胱氨酸蛋白酶蛋白-3(Cleaved caspase 3)、活化半胱氨酸蛋白酶蛋白-9(Cleaved caspase 9)的表達(dá)。結(jié)果 MTT法結(jié)果顯示，5-氟尿嘧啶呈濃度和時(shí)間依賴性抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖，聯(lián)用黃芪皂苷Ⅱ可以顯著增加5-氟尿嘧啶對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制作用(P<0.05)；Western blot法結(jié)果顯示，聯(lián)合使用黃芪皂苷Ⅱ和5-氟尿嘧啶能增加Cleaved PARP表達(dá)(P<0.05)；Hoechst33342驗(yàn)證聯(lián)合用藥組較5-氟尿嘧啶組細(xì)胞凋亡水平升高；此外，Western blot結(jié)果還顯示，黃芪皂苷Ⅱ抑制p-ERK1/2蛋白表達(dá)； 聯(lián)用ERK1/2特異性抑制劑PD98059明顯增加5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率以及凋亡蛋白Cleaved caspase3、Cleaved caspase9表達(dá)(P<0.05)。阻斷ERK1/2后，黃芪皂苷Ⅱ促進(jìn)5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的凋亡蛋白Cleaved caspase3、Cleaved caspase9表達(dá)以及細(xì)胞凋亡水平并未明顯增加。結(jié)論 黃芪皂苷Ⅱ增加5-氟尿嘧啶對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2增殖抑制作用，其機(jī)制可能與抑制p-ERK1/2的表達(dá)有關(guān)。

黃芪皂苷Ⅱ；5-氟尿嘧啶；HepG2；細(xì)胞凋亡

肝癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，死亡率占我國(guó)惡性腫瘤的第2位，每年約有22萬(wàn)人死于原發(fā)性肝癌[1]。5-氟尿嘧啶常用于治療胃腸道惡性腫瘤，其對(duì)腫瘤抑制率降低是制約其療效的重要原因。黃芪作為傳統(tǒng)中草藥，有補(bǔ)氣升陽(yáng)、利尿托毒、排膿生肌等功效[2]。研究[3]顯示黃芪提取物有抗腫瘤活性，黃芪注射液、黃芪精口服液等藥物已被廣泛應(yīng)用于臨床參與聯(lián)合抗腫瘤治療[4]，但其具體抗腫瘤活性成分及機(jī)制仍不清楚。黃芪皂苷Ⅱ?yàn)辄S芪皂苷的主要成分[5]，是否能有效聯(lián)合抗腫瘤藥物5-氟尿嘧啶抑制肝癌細(xì)胞株HepG2增殖、增加其療效目前尚未見(jiàn)報(bào)道。該研究旨在探討黃芪皂苷Ⅱ增加5-氟尿嘧啶對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2增殖抑制作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、藥品與試劑 人肝癌細(xì)胞株HepG2(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone生物技術(shù)有限公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；黃芪皂苷Ⅱ(南京澤朗有限公司，純度98%)；5-氟尿嘧啶(天津金耀氨基酸有限公司)；Hoechst33342、甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、ERK1/2特異性抑制劑PD98059(美國(guó)Sigma公司)；山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗、β-actin 抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；絲裂原活化蛋白激酶(ERK1/2)、磷酸化絲裂原活化蛋白激酶(p-ERK1/2)、活化半胱氨酸蛋白酶蛋白-3(Cleaved caspase 3)、活化半胱氨酸蛋白酶蛋白-9(Cleaved caspase 9)、凋亡蛋白多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)抗體(美國(guó)Cell Signaling公司)。

1.2 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株HepG2采用10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素和100 g/L鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中貼壁生長(zhǎng)，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞株，0.25%胰酶消化后用DMEM培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，以5×103個(gè)/孔細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后吸棄上清液，加入預(yù)定藥物培養(yǎng)；每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每孔加入200 μl含藥培養(yǎng)基。培養(yǎng)預(yù)定時(shí)間后，加入20 μl濃度為5 g/L的MTT溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，吸棄上清液后每孔加入150 μl DMSO，微振蕩器振蕩10 min。以酶標(biāo)儀于550 nm波長(zhǎng)檢測(cè)相應(yīng)的吸光度，取各組均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 Hoechst33342法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量至3×105個(gè)/孔，以每孔2 ml接種于6孔板，分組為對(duì)照組、5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)組、5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(20 μmol/L)組、5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(40 μmol/L)組、5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(80 μmol/L)組，處理48 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，4%低聚甲醛固定15 min，每孔加入PBS溶解的2 mg/L Hoechst33342 1 ml，避光15 min后，吸棄溶液，用PBS洗滌2次，熒光顯微鏡觀察染色并拍照。

1.2.4 Western blot 檢測(cè)PARP、Cleaved PARP、ERK1/2、p-ERK1/2、Cleaved caspase3、Cleaved caspase9蛋白表達(dá) 收集各組HepG2細(xì)胞，4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌3次，加入400 μl蛋白裂解液(含100 mmol/L 的PMSF 4 μl)，置于冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取蛋白上清液，加入5×蛋白上樣緩沖液混合后煮沸10 min，收集總蛋白。SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(PVDF)上。用5%脫脂牛奶封閉3 h后，加入常規(guī)一抗，4 ℃搖床過(guò)夜。TBST洗滌3次，加入相應(yīng)二抗孵育1 h后，TBST洗滌3次，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，Bio-Rad照相系統(tǒng)進(jìn)行照相并用Image-J軟件進(jìn)行圖片分析。

2 結(jié)果

2.1 黃芪皂苷Ⅱ增加5-氟尿嘧啶對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制作用 5-氟尿嘧啶按相應(yīng)濃度(0、0.04、0.2、1、5、25、125、625 μmol/L)分別作用肝癌HepG2細(xì)胞24、48、72 h后，對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖呈濃度和時(shí)間依賴性抑制，見(jiàn)圖1。黃芪皂苷Ⅱ(20、40、80 μmol/L)聯(lián)用10 μmol/L 5-氟尿嘧啶作用48 h后，可以顯著增加5-氟尿嘧啶對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用(F=87.43,P<0.05,P<0.01)，見(jiàn)圖2。

2.2 黃芪皂苷Ⅱ增加5-氟尿嘧啶對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞促凋亡作用 Western blot結(jié)果顯示5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(20 μmol/L)組、5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(40 μmol/L)組、5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(80 μmol/L)組較5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)組凋亡相關(guān)蛋白PARP出現(xiàn)明顯裂解(F=517.3,P<0.05,P<0.01)，見(jiàn)圖3。Hoechst33342染色分析各組細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(20 μmol/L)組、5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(40 μmol/L)組、5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(80 μmol/L)組較5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)組細(xì)胞凋亡水平升高，見(jiàn)圖3。

圖1 5-氟尿嘧啶對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制作用與同一時(shí)間點(diǎn)0 μmol/L 5-氟尿嘧啶組比較：#P<0.05，##P<0.01

圖2 黃芪皂苷Ⅱ聯(lián)合5-氟尿嘧啶對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制作用

1：對(duì)照組；2：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)組；3：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(20 μmol/L)組；4：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(40 μmol/L)組；5：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(80 μmol/L)組；與5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.3 黃芪皂苷Ⅱ抑制p-ERK1/2的表達(dá) 40 μmol/L黃芪皂苷Ⅱ分別作用HepG2細(xì)胞3、6、12、24、48 h后，Western blot檢測(cè)各組p-ERK1/2、ERK1/2

圖3 黃芪皂苷Ⅱ聯(lián)合5-氟尿嘧啶對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞促凋亡作用

A：對(duì)照組；B：.5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)組；C：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(20 μmol/L)組；D：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(40 μmol/L)組；E：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(80 μmol/L)組；與5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)組比較：#P<0.05，##P<0.01

表達(dá)，結(jié)果顯示p-ERK1/2隨作用時(shí)間增加而減少(F=35.48,P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 黃芪皂苷Ⅱ抑制p-ERK1/2蛋白的表達(dá)與0 h比較：#P<0.05，##P<0.01

2.4 聯(lián)用PD98059增加5-氟尿嘧啶對(duì)HepG2細(xì)胞的促凋亡作用 20 μmol/L PD98059聯(lián)合10 μmol/L 5-氟尿嘧啶增加HepG2細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白Cleaved caspase3、Cleaved caspase9的表達(dá)(F=195.5,P<0.05)；PD98059阻斷ERK1/2通路后，黃芪皂苷Ⅱ?qū)leaved caspase3、Cleaved caspase9促進(jìn)作用并未明顯增加。Hoechst33342染色分析結(jié)果與上訴結(jié)果一致，見(jiàn)圖5。

3 討論

化療作為治療腫瘤的重要手段被廣泛運(yùn)用于臨床，而腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物抵抗是造成療效降低的重要原因。聯(lián)合給藥是解決臨床化療藥物抵抗的重要方法之一，有較好的運(yùn)用前景。黃芪作為傳統(tǒng)中草藥，其抗腫瘤的作用受到學(xué)者的廣泛重視。黃芪多糖、黃芪皂苷等黃芪提取物的抗腫瘤特性已經(jīng)成為目前抗腫瘤治療的研究熱點(diǎn)之一。

ERK1/2屬于有絲分裂原激活蛋白激酶家族，作為腫瘤治療的新靶點(diǎn)被廣泛認(rèn)知[6-7]。研究[7]表明ERK1/2可以通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡等一系列生理活動(dòng)。馮丹 等[8]發(fā)現(xiàn)抑制ERK1/2表達(dá)可以增加5-氟尿嘧啶抗人胃癌細(xì)胞增殖作用，譚雪梅 等[9]發(fā)現(xiàn)5-氟尿嘧啶聯(lián)用ERK1/2特異性抑制劑PD98059可以增加5-氟尿嘧啶對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞的促凋亡作用。

本研究結(jié)果顯示黃芪皂苷Ⅱ通過(guò)下調(diào)p-ERK1/2的表達(dá)增加5-氟尿嘧啶對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2增殖抑制作用。合用ERK1/2特異性抑制劑PD98059后，黃芪皂苷Ⅱ?qū)Φ蛲龅鞍證leaved caspase 3、Cleaved caspase 9的表達(dá)促進(jìn)作用并未顯著增加，Hoechst33342染色結(jié)果也表明阻斷ERK1/2可以增加5-氟尿嘧啶對(duì)HepG2的促凋亡作用。而PD98059作用后，黃芪皂苷Ⅱ?qū)epG2促凋亡作用并未顯著增加。綜上所述，黃芪皂苷Ⅱ增加5-氟尿嘧啶對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2增殖抑制作用，其機(jī)制可能與抑制p-ERK1/2的表達(dá)有關(guān)。

圖5 聯(lián)用PD98059 增加5-氟尿嘧啶對(duì)HepG2細(xì)胞的促凋亡作用 A：對(duì)照組；B：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)組；C：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(40 μmol/L)組；D：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+PD98059(20 μmol/L)組；E：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(40 μmol/L)+PD98059(20 μmol/L)組；與5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)組比較，##P<0.01

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Increasing inhibition of human hepatic cancer HepG2 cells to 5-fluorouracil by AstragalosideⅡ

Wu Chao1，Xu Dujuan1,2，Yang Cui1，et al

(1College of Pharmacy,Anhui Medical University,Hefei 230032;2Dept of Pharmacy,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022)

Objective To investigate the Astragaloside II increasing inhibition of human hepatic cancer (HepG2)cells by 5-fluorouracil and its possible mechanism. Methods The HepG2 inhibiting rate by 5-fluorouracil after alone or jointly acting on cells was detected by MTT method; cells apoptosis was detected by Hoechst33342 staining. The expressions of ERK1/2，p-ERK1/2，PARP,Cleaved PARP,Cleaved caspase 3 and Cleaved caspase 9 proteins were measured by Western blot. Results MTT staining showed that 5-fluorouracil inhibited the proliferation of HepG2 cells and presented dose and time-dependence. Furthermore, combining the Astragaloside II with 5-fluorouracil could further significantly enhance the effect of 5-fluorouracil on cancer cells inhibition (P<0.05). Western blot result proved that combining the Astragaloside II with 5-fluorouracil could increase the expression of Cleaved PARP (P<0.05). Hoechst33342 staining result further validated the level of apoptosis cells was far more increased in the combination group than the 5-fluorouracil group. Moreover, Western blot result also showed that Astragaloside II inhibited the phosphorylation of ERK1/2. Combining the inhibitor of ERK1/2 (PD98059) with 5-fluorouracil may increase apoptosis rate and the expressions of apoptosis related proteins like Cleaved caspase3, Cleaved caspase 9 in HepG2 cells. Astragaloside II showed negative increasing trend of apoptosis rate and the expressions of apoptosis related proteins like Cleaved caspase 3, Cleaved caspase 9 by 5-fluorouracil after blocking ERK1/2 in HepG2 cells. Conclusion Astragaloside II could increase inhibition of human hepatic cancer HepG2 cells by 5-fluorouracil, and the mechanism may be related to inhibiting p-ERK1/2 pathway.

Astragaloside II; 5-fluorouracil ; HepG2 cells; cell apoptosis

時(shí)間：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.036.html

安徽省自然科學(xué)基金(編號(hào):11040606M222)

1安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230032

2安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，合肥 230022

武 超，男，碩士研究生；

許杜娟，女，博士，主任藥師，責(zé)任作者，E-mail:1465102325@qq.com

R 735.7

A

1000-1492(2016)01-0078-05

2015-09-30接收