劉 娜，張抗懷*，董 新，王海濤

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，西安 710004；2. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，西安 710004)

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回顧性分析氯吡格雷弱代謝患者的抗血小板治療現(xiàn)狀

劉 娜1，張抗懷1*，董 新2，王海濤1

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，西安 710004；2. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，西安 710004)

目的 篩查氯吡格雷弱代謝型急性冠脈綜合征患者，回顧性分析其抗血小板治療現(xiàn)狀。方法 選取醫(yī)院收治的285例陜西漢族急性冠脈綜合征患者，通過焦磷酸測序技術(shù)檢測CYP2C19*2和CYP2C19*3基因多態(tài)性篩查氯吡格雷弱代謝患者，分析其抗血小板治療現(xiàn)狀。結(jié)果 在285例患者中，快代謝型占38.6%，中間代謝型占49.1%，慢代謝型占12.3%，后兩者為弱代謝型(61.4%)。中間代謝型患者，53.6%應(yīng)用氯吡格雷75 mg·d-1；46.4%調(diào)整治療方案，如氯吡格雷劑量加倍至150 mg·d-1，更換替格瑞洛或三聯(lián)療法(加用西洛他唑)。慢代謝型患者，54.3%應(yīng)用氯吡格雷75 mg·d-1，45.7%調(diào)整為上述治療方案，其中28.5%更換替格瑞洛。結(jié)論 在陜西漢族急性冠脈綜合征患者中，氯吡格雷弱代謝型發(fā)生率高，目前個體化抗血小板治療方案并無統(tǒng)一規(guī)范。

氯吡格雷；弱代謝型；急性冠脈綜合征；抗血小板治療

A.stract:Objective To identify the clopidogrel poor metabolizers with acute coronary syndrome (ACS) and to retrospectively analyze the antiplatelet therapy status. Methods 285 Shaanxi Han Chinese with (ACS) in the hospital were enrolled in this study. The pyrophosphate sequencing technology was used to detect CYP2C19*2 and CYP2C19*3 gene polymorphism. Antiplatelet therapy status of clopidogrel poor metabolizers with ACS was analyzed. Results The rapid，intermediate and slow metabolizers were respectively 38.6%， 49.1% and 12.3%. The intermediate and slow metabolizers were regarded as clopidogrel poor metabolizers(61.4%). About 53.6% clopidogrel intermediate metabolizers were given conventional dose of clopidogrel (75 mg·d-1) ，46.4% cases were applied the adjusted treatment plans including doubling dosage of clopidogrel (150 mg·d-1)，replacement drugs (such as ticagrelor) or triple antiplatelet therapy (adding cilostazol). For clopidogrel slow metabolizers，54.3% cases were still given conventional dose of clopidogrel (75 mg·d-1)，45.7% patients were administered the adjusted treatment plans as mentioned above，28.8% of patients with replacement of ticagrelor.Conclusion The incidence of clopidogrel poor metabolizers is high in Shaanxi Han Chinese population with ACS. There is no uniform standard that individualized antiplatelet treatment of clopidogrel poor metabolizers.

氯吡格雷是急性冠脈綜合征患者抗血小板治療的基礎(chǔ)用藥[1]，給予常規(guī)劑量氯吡格雷治療患者依從性良好，但部分患者血小板活性不能達到有效抑制或發(fā)生不良心血管事件，即氯吡格雷抵抗現(xiàn)象。臨床研究證實，氯吡格雷療效存在明顯個體差異，CYP2C19基因多態(tài)性是影響氯吡格雷療效的重要內(nèi)因[2-3]。CYP2C19功能缺失可能引起氯吡格雷活性代謝物生成減少、抗血小板作用減弱、心血管缺血事件發(fā)生風(fēng)險增加[4]。2010年美國FDA警告：提醒醫(yī)生通過CYP2C19基因檢測判斷CYP2C19功能；對氯吡格雷代謝不良者，建議增加氯吡格雷劑量或應(yīng)用其他抗血小板藥物。本研究擬根據(jù)CYP2C19基因型判斷急性冠脈綜合征患者的氯吡格雷代謝能力，回顧性分析氯吡格雷弱代謝患者的抗血小板治療現(xiàn)狀。

1 儀器與材料

1.1 儀器 HFsafe1200生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；TC-96/G/H(b)A PCR擴增儀(杭州博日科技有限公司)；PyroMark Q24焦磷酸測序儀(德國凱杰QIAGEN生物公司)。

1.2 材料 全血基因組DNA提取試劑盒(HiPure Blood DNA Mini Kit，Lot EE040100)和PCR反應(yīng)體系試劑[包括PCR Buffer(Lot AB7201A)和dNTP Mixture(Lot BK1201A)]及焦磷酸測序SNP通用試劑盒 (PyroMark Gold Q96 Reagents，Lot 154012213)均購于廣州美基生物科技有限公司?？股锼氐鞍祖溇卮胖?Streptavidin Sepharose Beads，Lot 10235656)，購自德國凱捷生物科技有限公司。

2 資料與方法

2.1 研究對象 選取2013年10月～2014年10月收住于醫(yī)院心內(nèi)科的285例急性冠脈綜合征患者，在醫(yī)院藥學(xué)部基因檢測室開展CYP2C19*2和CYP2C19*3的基因多態(tài)性檢測[5]。

入選標(biāo)準(zhǔn): 陜西漢族，年齡大于18歲，冠脈造影診斷為急性冠脈綜合征，具有使用阿司匹林和氯吡格雷進行抗血小板治療的指征，無其他心血管疾病的患者。入選患者均簽署書面知情同意書。試驗方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

排除標(biāo)準(zhǔn):抗血小板治療禁忌證患者；對阿司匹林及氯吡格雷過敏或不耐受者; 嚴(yán)重肝腎疾患者；凝血功能障礙者；半年內(nèi)有卒中或出血性疾病患者；近期擬行外科手術(shù)者以及其他介入治療禁忌證者。

2.2 研究方案 采用焦磷酸測序技術(shù)結(jié)合系統(tǒng)回顧法，對氯吡格雷弱代謝型急性冠脈綜合征患者的抗血小板治療方案進行分析與評價。編制調(diào)查表，內(nèi)容包括性別、年齡、CYP2C19基因型、氯吡格雷代謝型、抗血小板治療方案、吸煙、血小板計數(shù)和肝腎功能等。

2.3 焦磷酸測序法 檢測CYP2C19*2(G681A)和CYP2C19*3(G636A)基因型。

2.3.1 人血標(biāo)本DNA提取 采集患者外周靜脈血2 mL(EDTA-2Na抗凝管)，采用全血基因組DNA提取試劑盒提取DNA，提取結(jié)束后加入預(yù)熱65 ℃洗出液150 μL溶解DNA，放置過夜，待用。

2.3.2 聚合酶鏈反應(yīng) 設(shè)計并合成CYP2C19*2和CYP2C19*3擴增和測序的引物，按照如下條件進行PCR擴增：PCR體系50 μL。10×PCR反應(yīng)緩沖液5 μL，三磷酸脫氧核糖核酸(dNTP)4 μL (各10 mmol·L-1)，蒸餾水37.5 μL，正向引物和負向引物各0.5 μL (100 μmol·L-1)，rTaq DNA多聚酶0.5 μL (5 u·μL-1)，基因組 DNA 2.0 μL (20～30 μg·L-1)。PCR條件為94 ℃預(yù)變性10 min，變性、退火和延伸分別為 94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s和72 ℃ 45 s，共50個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min，在4 ℃保溫。取擴增產(chǎn)物5 μL和緩沖液1 μL混勻，在20 g·L-1瓊脂糖電泳，可獲得清晰的擴增產(chǎn)物。

2.3.3 焦磷酸測序 ①測序引物退火緩沖液的配制：將10 μmol·L-1測序引物工作液1 μL加入24 μL退火緩沖液中，得到0.4 μmol·L-1測序引物退火緩沖液。測序板上每個孔加入測序引物退火緩沖液25 μL。②配制單鏈DNA分離液：2 μL磁珠和40 μL結(jié)合緩沖液，加高純水18 μL配制成60 μL的單鏈DNA分離液。③PCR產(chǎn)物固定：每個PCR樣本20 μL加入60 μL單鏈DNA分離液，在常溫下劇烈振蕩10 min，使得親和素包被的磁珠與生物素標(biāo)記的單鏈充分結(jié)合。④單鏈DNA模板的制備：在真空工作站中，1號位加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇50 mL，2號位加入變性緩沖液40 mL，3號位加入洗液50 mL，4號位加入高純水50 mL，5號位加入高純水70 mL。將真空工具在6號位清洗15 s，移動到PCR板吸附磁珠15 s，依次在1，2和3號位清洗5，5 和10 s。⑤引物雜交：將真空工具真空閥關(guān)閉，放入含有測序引物的板中，充分搖動釋放磁珠，在80 ℃雜交2 min，室溫靜置5 min冷卻。⑥測序：使用焦磷酸測序儀和測序通用試劑盒，按照儀器和試劑說明書進行PCR產(chǎn)物的SNP位點的焦磷酸測序。

3 研究結(jié)果

3.1 CYP2C19*2和CYP2C19*3基因多態(tài)性檢測結(jié)果 CYP2C19*2和CYP2C19*3 2個功能缺失突變位點具有重要意義，幾乎能解釋全部東亞人群氯吡格雷弱代謝型。研究檢測結(jié)果見圖1。測序結(jié)果：CYP2C19*2(GG，野生型)、CYP2C19*2(GA，突變雜合子型)、CYP2C19*2(AA，突變純合子型)、CYP2C19*3(GG，野生型)、CYP2C19*3(GA，突變雜合子型)。

圖1A.CYP2C19*2，G681A (測序結(jié)果：GG野生型)

Sequence of standard wild type target:TTCCCGGGAAC

Sequence of mutant type:TTCCCAGGAAC

Sequence of detection result:TTCCCGG

C2:CC/TGGGAAATAATCAATGA

圖1B.CYP2C19*2，G681A (測序結(jié)果：GA突變雜合子型)

Sequence of standard wild type target：TTCCCGGGAAC

Sequence of mutant type：TTCCCAGGAAC

Sequence of detection result: TTCCCG/AG

C1:CC/TGGGAAATAATCAATGA

圖1C.CYP2C19*2，G681A (測序結(jié)果：AA突變純合子型)

Sequence of standard wild type target：TTCCCGGGAAC

Sequence of mutant type：TTCCCAGGAAC

Sequence of detection result: TTCCCAG

B2:CC/TGGGAAATAATCAATGA

圖1D.CYP2C19*3，G636A (測序結(jié)果：GG野生型)

Sequence of standard wild type target：CCCTGGATCCA

Sequence of mutant type：CCCTGAATCCA

Sequence of detection result:GGATCCA

C5: GG/AATCCAGGTAA

圖1E.CYP2C19*3，G636A (測序結(jié)果：GA突變雜合子型)

Sequence of standard wild type target：CCCTGGATCCA

Sequence of mutant type：CCCTGAATCCA

Sequence of detection result:GG/AATCCA

A7:GG/AATCCAGGTAA

圖1 CYP2C19*2和CYP2C19*3基因多態(tài)性檢測結(jié)果

Fig.1 The detection results of CYP2C19*2 and CYP2C19*3 gene polymorphism

3.2 CYP2C19基因型及代謝型分布情況 CYP2C19基因型及代謝型之間存在對應(yīng)關(guān)系，即野生型CYP2C19*1/CYP2C19*1(快代謝型)、突變雜合子CYP2C19*1/CYP2C19*2或CYP2C19*1/CYP2C19*3(中間代謝型)和突變純合子CYP2C19*2/CYP2C19*2，CYP2C19*3/CYP2C19*3，CYP2C19*2/CYP2C19*3(慢代謝型)。CYP2C19基因多態(tài)性分布如圖2A所示，CYP2C19*2突變最為常見，為51.2%，CYP2C19*3突變率為10.2%。如圖2B所示，氯吡格雷弱代謝型(包括中間代謝型和慢代謝型)所占比例高達61.4%。3.3 氯吡格雷不同代謝型患者基線特征 在285例急性冠脈綜合征患者中，男225例，女60例；最高年齡95歲，最低年齡33歲，平均年齡63歲。各組之間ALT、ALT、尿素氮、肌酐及血小板計數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

圖2 CYP2C19基因多態(tài)性(A)及氯吡格雷代謝型(B)的分布特點

Fig.2 Distribution characteristics of CYP2C19 gene polymorphism (A) and clopidogrel metabolism (B)

表1 氯吡格雷不同代謝型患者的基線特征比較

Tab.1 Comparison of baseline characteristics in the different clopidogrel metabolism

項目快代謝型(n=110)中間代謝型(n=140)慢代謝型(n=35)P年齡/歲20～406(5.5%)4(3.0%)1(3.6%)>40～6056(50.7%)58(41.4%)19(53.5%)>6048(43.8%)78(55.6%)15(42.9%)性別男(225)95(86.3%)98(69.7%)31(89.3%)女(60)15(13.7%)42(30.3%)4(10.7%)吸煙是70(63.5%)95(68.1%)22(64.0%)否40(36.5%)45(31.9%)13(36.0%)ALT/U·L-128.4±7.227.7±6.029.3±7.5>0.05ALT/U·L-129.6±5.126.7±7.128.2±4.7>0.05尿素氮/mmol·L-15.8±1.06.2±0.85.9±0.5>0.05肌酐/μmol·L-195.8±9.689.3±6.691.3±6.5>0.05血小板計數(shù)/109·L-1177.2±18.5168.8±14.3172.8±14.5>0.05

3.4 氯吡格雷弱代謝型患者抗血小板治療方案分析 見圖3，在140例中間代謝型患者中，約53.6% (75例)的患者未調(diào)整方案，可能存在抗血小板效果不理想或潛在心血管風(fēng)險； 46.4%的患者采取氯吡格雷劑量加倍(23.6%)、更換替格瑞洛(12.8%)或三聯(lián)療法(10.0%)的調(diào)整方案。針對中間代謝型患者究竟采取哪種治療方案治療效果更優(yōu)仍需進一步探討。

由圖3可知，在35例慢代謝型患者中，約54.3%(19例)仍采取常規(guī)治療方案，預(yù)期心血管栓塞風(fēng)險較高；約45.7%調(diào)整治療方案包括氯吡格雷劑量加倍(8.6%)、更換替格瑞洛(28.5%)或三聯(lián)療法(8.6%)。目前認為更換替格瑞洛是慢代謝型患者的理想治療方案，但僅有28.5%慢代謝型患者采取此方案。

圖3 氯吡格雷不同代謝型患者的抗血小板治療現(xiàn)狀

Fig.3 The present antiplatelet treatment situation of three different clopidogrel metabolism

A.阿司匹林+氯吡格雷(75 mg·d-1);B.阿司匹林+氯吡格雷(150 mg·d-1);C.阿司匹林+替格瑞洛(90 mg，bid);D.阿司匹林+氯吡格雷(75 mg·d-1)+西洛他唑(100 mg，bid)

4 討論

CYP2C19基因型檢測有助于篩查氯吡格雷弱代謝患者，并據(jù)此制定個體化抗血小板治療方案。2010年ACCF/AHA專家共識提出氯吡格雷弱代謝型的應(yīng)對策略[6]：可以考慮氯吡格雷劑量加倍，或換用普拉格雷、替格瑞洛等，或聯(lián)合其他機制抗血小板藥物如西洛他唑，并密切監(jiān)測血小板抑制率。2011年一項針對心肌梗死和PCI術(shù)后1～4月患者研究表明[7]，氯吡格雷加量3倍(225 mg)可有效提高CYP2C19*2雜合子患者的血小板抑制率，提示150 mg維持劑量是不夠的。對于CYP2C19*2純合子，即使氯吡格雷加量4倍(300 mg)也不能達到理想的血小板抑制水平，故在權(quán)衡出血風(fēng)險后考慮換用新藥普拉格雷、替格瑞洛等。普拉格雷是前體藥物，需在肝臟代謝轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚援a(chǎn)物發(fā)揮抗血小板效應(yīng)，起效快，抗血小板作用強，但其出血風(fēng)險高于氯吡格雷[8]。對于年齡大于75 歲、體質(zhì)量小于60 kg、發(fā)生過中風(fēng)、短暫性腦出血等患者，普拉格雷是相對或絕對禁忌的[9]。

與氯吡格雷和普拉格雷相比，替格瑞洛具有顯著優(yōu)勢，如無需代謝激活，起效迅速，不受P450代謝酶影響，與P2Y12受體呈可逆性結(jié)合，停藥后血小板功能恢復(fù)較快。替格瑞洛抗血小板療效強于氯吡格雷，但出血風(fēng)險略有升高，其他不良反應(yīng)如呼吸困難、室性心律失常等[10]。從藥物經(jīng)濟學(xué)考慮，氯吡格雷150 mg·d-1(約每日38元)，氯吡格雷225 mg·d-1(約每日59元)，普拉格雷10 mg·d-1(約每日20元)，替格瑞洛90 mg/次，bid(約每日26元)，可見普拉格雷和替格瑞洛更優(yōu)。

加入西洛他唑的三聯(lián)療法是解決氯吡格雷弱代謝型的另一方法。研究表明，對于攜帶至少1個CYP2C19*2或CYP2C19*3功能缺失等位基因的患者，與雙聯(lián)療法比較，采用三聯(lián)療法可降低治療后血小板的高反應(yīng)性；而對于沒有功能缺失等位基因的患者，不能降低治療后血小板的高反應(yīng)性[11]。

本研究將氯吡格雷弱代謝型應(yīng)對策略作為抗血小板治療合理性的評價標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示，僅有少數(shù)氯吡格雷弱代謝患者采取氯吡格雷劑量加倍、更換替格瑞洛或三聯(lián)療法的方案，其余仍給予常規(guī)劑量氯吡格雷。這將可能造成氯吡格雷弱代謝患者抗血小板治療效果不佳。

①本研究中有16例快代謝型患者采用氯吡格雷劑量加倍(150 mg·d-1)進行短期治療，是考慮急性冠脈綜合征急性期或冠脈支架術(shù)后初期血小板處于激活狀態(tài)[12]，發(fā)生氯吡格雷抵抗的可能性更大。

②約23.6%的中間代謝型患者采用氯吡格雷150 mg·d-1的劑量是不夠的[7]，與普拉格雷和替格瑞洛比較，此方案雖無經(jīng)濟學(xué)優(yōu)勢，卻是研究中間代謝型患者采用的主流方案。原因是醫(yī)生擔(dān)憂氯吡格雷225 mg或更換新藥會增加出血風(fēng)險，特別是對于高危出血風(fēng)險的患者。我們今后擬進一步探討中間代謝型患者選擇氯吡格雷150 mg·d-1、氯吡格雷225 mg·d-1或替格瑞洛90 mg/次，bid，哪種方案臨床獲益更佳。

③目前認為更換新型P2Y12受體拮抗劑是慢代謝型患者的理想方案，氯吡格雷加量或三聯(lián)療法不能有效解決慢代謝型患者的治療問題。本研究約28.5%慢代謝型患者采取更換替格瑞洛的方案。多數(shù)醫(yī)院尚未購進新藥普拉格雷和替格瑞洛(該醫(yī)院僅購進替格瑞洛)，也是臨床醫(yī)生選擇其他方案的原因之一。

④三聯(lián)療法中的西洛他唑尚未獲得推薦用于治療冠心病，臨床應(yīng)用存在爭議。

⑤醫(yī)生和患者對基因檢測技術(shù)的接受及重視，也是影響氯吡格雷抵抗實現(xiàn)個體化抗血小板治療的重要因素。

綜上所述，陜西漢族人群氯吡格雷弱代謝型發(fā)生率較高，氯吡格雷弱代謝型急性冠脈綜合征患者的個體化抗血小板治療方案并無統(tǒng)一規(guī)范?；驒z測技術(shù)可作為早期篩查氯吡格雷弱代謝型的有效手段，為臨床制定個體化抗血小板治療方案提供依據(jù)。

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Retrospective analysis on antiplatelet therapy status in patients with clopidogrel poor metabolizers

LIU Na1，ZHANG Kanghuai1*，DONG Xin2，WANG Haitao1

(1.Department of Pharmacy， the Second Affiliated Hospital of Xi′an Jiaotong University，Xi′an 710004，China；2.Department of Cardiology，the Second Affiliated Hospital of Xi′an Jiaotong University，Xi′an 710004，China)

clopidogrel；poor metabolism；acute coronary syndrome；antiplatelet therapy

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院新技術(shù)新療法項目(編號：201519)；西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院2016年重大醫(yī)療技術(shù)項目(編號：201605)

劉娜，女，博士，主管藥師

*通信作者：張抗懷，男，博士，主任藥師

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.06.021

R972

A

1004-2407(2016)06-0622-06

2016-07-12)