張志強(qiáng)，馬海英，李運(yùn)霞，楊艷榮，趙欣

cRGD環(huán)肽修飾的脂質(zhì)體靶向肺癌細(xì)胞A549的體外研究

張志強(qiáng)，馬海英，李運(yùn)霞，楊艷榮，趙欣

目的構(gòu)建一種整合素cRGD環(huán)肽修飾的脂質(zhì)體（cRGD-LP）并用于靶向A549細(xì)胞的研究。方法采用薄膜分散法制備cRGD-LP，測(cè)定其粒徑和電位，用流式細(xì)胞儀考察A549細(xì)胞對(duì)其的攝取，激光共聚焦顯微鏡考察cRGD-LP的腫瘤球穿透能力。結(jié)果構(gòu)建的cRGD-LP粒徑為（112.3±7.8）nm，粒徑分散系數(shù)（PDI）為0.023±0.045，電位為（2.38±0.87）mV，且24 h內(nèi)有良好的血清穩(wěn)定性，粒徑保持在115 nm左右。A549細(xì)胞對(duì)cRGD-LP的攝取是PEG修飾脂質(zhì)體（PEG-LP）的1.7倍，且cRGD-LP對(duì)A549腫瘤球的穿透能力比PEG-LP高，能穿透至腫瘤球的深部。結(jié)論構(gòu)建的cRGD-LP具有良好的靶向A549細(xì)胞的能力，是一種潛在的新型給藥系統(tǒng)。

肺癌；整合素；cRGD；脂質(zhì)體

肺癌在中國(guó)的發(fā)病率和致死率近年來(lái)呈急劇上升的趨勢(shì)［1-2］。目前，針對(duì)肺癌主要包括化療和手術(shù)治療兩種方式。由于化療藥物的副作用和缺乏組織選擇性，使得肺癌的化療效果大大折扣。因此，如何克服化療藥物的這兩種局限性成為研究的重點(diǎn)。

在眾多給藥系統(tǒng)中，由于脂質(zhì)體既可以包載脂溶性藥物，又可以包載水溶性藥物，并具有高穩(wěn)定性，使得其在腫瘤治療中倍受青睞［3］。將藥物包裹在脂質(zhì)體中可以大大減少藥物的毒性，如將紫杉醇包裹在脂質(zhì)體中，可以大大減小其心臟毒性，從而減輕化療帶來(lái)的副作用［4］。聚乙二醇（PEG）修飾的脂質(zhì)體可以通過(guò)腫瘤增強(qiáng)滲透滯留效應(yīng)（EPR）靶向到達(dá)腫瘤部位。與沒(méi)有PEG修飾的脂質(zhì)體相比，PEG修飾的脂質(zhì)體可以使更多化療藥物蓄積在腫瘤部位，從而增加其療效［4-5］。但是，這種脂質(zhì)體由于缺乏組織選擇性，其治療效果仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到期望的效果。針對(duì)這一現(xiàn)象，構(gòu)建一種可以主動(dòng)靶向于肺部的脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)能夠顯著提高化療的效果，并且減少其副作用。在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549中，研究人員發(fā)現(xiàn)整合素αvβ3受體高表達(dá)［6］，因此利用cRGD序列可以與整合素受體αvβ3結(jié)合這一優(yōu)勢(shì)［7］，將cRGD修飾在脂質(zhì)體表面，構(gòu)建主動(dòng)靶向的脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)應(yīng)用在肺癌治療中，從而產(chǎn)生更好的治療效果。

基于上述研究背景，本研究構(gòu)建由精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp）修飾的cRGD環(huán)肽脂質(zhì)體（cRGD-LP），通過(guò)體外的脂質(zhì)體構(gòu)建、穩(wěn)定性考察、細(xì)胞攝取和腫瘤球穿透試驗(yàn)的考察，期望所構(gòu)建的cRGD-LP可以高效地主動(dòng)靶向肺癌細(xì)胞，增加其抗腫瘤效果。

1 材料與儀器

ZS90粒徑電位測(cè)定儀（英國(guó)，Malvern），流式細(xì)胞儀（美國(guó)，BD），激光共聚焦掃描顯微鏡（德國(guó)，Leica），A549細(xì)胞（ATCC），cRGD（上海吉爾多肽有限公司，純度95%），DSPE-PEG2000-NHS（西安瑞禧生物科技有限公司），DSPE-PEG2000-OMe（上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司），磷脂SPC和膽固醇Chole（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司），異硫氰酸熒光素標(biāo)記的磷脂（FITC-PE，美國(guó)Sigma），DAPI（碧云天生物技術(shù)有限公司），DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清（美國(guó)，Gbico），其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 DSPE-PEG2000-cRGD的合成［7］準(zhǔn)確定量稱量cRGD和DSPE-PEG2000-NHS（摩爾比為2∶1），分別溶解于無(wú)水二甲基甲酰胺（DMF）中，二者混合室溫避光反應(yīng)48 h；之后混合液加入透析袋中（截留分子量1000），超純水透析48 h后，取出透析袋中液體凍干，得純化后的DSPE-PEG2000-cRGD。

2.2 脂質(zhì)體的制備［4］本課題制備兩種脂質(zhì)體，其中PEG-LP通過(guò)SPC∶Chole∶DSPE-PEG2000-OMe摩爾質(zhì)量比為3∶2∶0.05比例制得，cRGD-LP通過(guò)SPC∶Chole∶DSPE-PEG2000-cRGD摩爾質(zhì)量比為3∶2∶0.05比例制得。兩種脂質(zhì)體制備方法如下：將所有脂質(zhì)體材料溶解于氯仿甲醇混合液（V/V=2∶1）中，室溫旋蒸抽干成薄膜，真空干燥過(guò)夜，用PBS室溫水化15 min，探頭超聲40 s制得。對(duì)于FITC標(biāo)記的脂質(zhì)體，將定量FIPE-PE加入脂質(zhì)體材料中，與脂質(zhì)材料一起抽膜制得。

2.3 粒徑和電位的測(cè)定所制得的兩種脂質(zhì)體均用超純水以1∶10稀釋至1 ml，用粒徑電位儀分別對(duì)其粒徑和電位進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如表1所示，兩種脂質(zhì)體PEG-LP和cRGD-LP的粒徑均在100 nm左右，PDI均＜0.3，說(shuō)明該兩種脂質(zhì)體顯示了良好的均一性。從電位測(cè)定結(jié)果看，PEG-LP略帶負(fù)電荷，cRGD-LP略帶正電荷，但均接近電中性，說(shuō)明兩種脂質(zhì)體都具有高穩(wěn)定性。

表1 不同脂質(zhì)體的粒徑與電位（n=3）

2.4 血清穩(wěn)定性測(cè)定分別吸取兩種制備的脂質(zhì)體1 ml，加入到過(guò)濾后的胎牛血清（FBS）1∶1混合，所得到的脂質(zhì)體血清混合物在37℃下孵育，分別于0、1、2、4、8、12和24 h各吸取100 μl，用超純水稀釋到1 ml，對(duì)其粒徑進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖1所示，此兩種脂質(zhì)體與FBS混合后，在24 h之內(nèi)，cRGD-LP粒徑維持在115 nm左右，PEG-LP粒徑保持在100 nm左右，表明在體外模擬條件下，此兩種脂質(zhì)體均具有較高的血清穩(wěn)定性，有利于脂質(zhì)體的體內(nèi)研究。

圖1 不同脂質(zhì)體的血清穩(wěn)定性（n=3）

2.5 體外細(xì)胞攝取［8］將A549細(xì)胞以10萬(wàn)/孔接種在6孔板中，等細(xì)胞完全貼壁后，繼續(xù)生長(zhǎng)24 h，直到每孔細(xì)胞匯合度達(dá)到約80%。將所制得到的FITC標(biāo)記的兩種脂質(zhì)體各100 μl加入到6孔板中，再加入900 μl DMEM培養(yǎng)基，使得每孔FITC含量為3 μg/ml。37℃繼續(xù)孵育4 h，將細(xì)胞用PBS洗3次，胰酶消化，將每孔細(xì)胞重懸在300 μl PBS中，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，A549細(xì)胞對(duì)cRGD-LP攝取的熒光強(qiáng)度是PEG-LP的1.7倍（P＜0.05，圖2），說(shuō)明cRGD-LP有利于A549細(xì)胞的攝取，更易靶向至腫瘤細(xì)胞，因此可以使得腫瘤治療效果顯著增加。

圖2 A549細(xì)胞對(duì)不同脂質(zhì)體攝取結(jié)果（n=3）

細(xì)胞攝取定性實(shí)驗(yàn)：將A549細(xì)胞如上述方法與兩種脂質(zhì)體孵育4 h后，PBS清洗3次，加入1 μg/ml的DAPI染色10 min，再用4%的多聚甲醛固定，激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞攝取情況。結(jié)果表明（圖3），F(xiàn)ITC標(biāo)記的cRGD-LP組的熒光強(qiáng)度顯著高于PEG-LP組。該結(jié)果與流式細(xì)胞儀定量攝取的結(jié)果一致，兩者均表明與PEG-LP相比，cRGD-LP可以更好的靶向A549細(xì)胞。

圖3 激光共聚焦顯微鏡觀察A549細(xì)胞對(duì)不同脂質(zhì)體的攝?。╪=3）

2.6 腫瘤球穿透性實(shí)驗(yàn)［9］用無(wú)血清的DMEM配置2%的瓊脂糖凝膠，將此凝膠80℃下加熱至融化，以每孔100 μl接種在96孔板中。待其冷卻至室溫形成固體后，消化A549細(xì)胞，以每孔8000個(gè)接種在96孔板中。待腫瘤球成形長(zhǎng)至直徑為200～300 μm后，將FITC標(biāo)記的兩種脂質(zhì)體加入到96孔板中，使得每孔FITC含量為3 μg/ml。繼續(xù)37℃孵育4 h后，將腫瘤球吸出，用PBS洗3次，4%多聚甲醛室溫固定30 min后，在激光共聚焦顯微鏡下考察兩種脂質(zhì)體腫瘤球穿透能力。結(jié)果表明（圖4），F(xiàn)TIC標(biāo)記的cRGD-LP組的熒光強(qiáng)度高于PEG-LP組，并且在腫瘤球的深部，cRGD-LP組的熒光強(qiáng)度高于PEG-LP組，說(shuō)明cRGD-LP對(duì)A549腫瘤球的穿透能力強(qiáng)于PEG-LP，cRGD-LP比PEG-LP穿透進(jìn)入腫瘤球深部，更能靶向至深處的腫瘤細(xì)胞。

圖4 不同脂質(zhì)體對(duì)A549腫瘤球穿透能力（n=3）

3 討論

在化療中，盡管PEG修飾的脂質(zhì)體可以被動(dòng)靶向到腫瘤細(xì)胞，但缺乏對(duì)癌癥細(xì)胞的主動(dòng)識(shí)別能力。整合素作為真核細(xì)胞的特異性表達(dá)受體，高表達(dá)在A549肺癌細(xì)胞中。構(gòu)建整合素修飾的給藥系統(tǒng)，可以比傳統(tǒng)PEG修飾的給藥系統(tǒng)更好的靶向癌癥病灶。盡管有研究證實(shí)RGD修飾的脂質(zhì)體可以主動(dòng)靶向到整合素高αvβ3表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中［10］，但其與腫瘤細(xì)胞之間具有受體飽和效應(yīng)。最新研究表明，二硫鍵修飾的環(huán)肽RGD（cRGD）與線性RGD相比，對(duì)整合素αvβ3具有更高的親和力，所以構(gòu)建cRGD修飾的給藥系統(tǒng)可以更好的主動(dòng)靶向于腫瘤細(xì)胞［11］。

基于上述情況，本研究構(gòu)建了cRGD修飾的脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體粒徑在110 nm左右，且具有較高的血清穩(wěn)定性，說(shuō)明將構(gòu)建的脂質(zhì)體cRGD-LP應(yīng)用在體內(nèi)研究中時(shí)，cRGD-LP在體內(nèi)循環(huán)中可以保持較高的穩(wěn)定性，可以減少與血漿蛋白的結(jié)合，從而有更多的cRGD-LP蓄積在腫瘤部位，可以使得化療效果增加的可能性大大提高。由于A549細(xì)胞高表達(dá)整合素受體αvβ3，而cRGD可以與αvβ3高度結(jié)合，因此，從流式細(xì)胞儀檢測(cè)和激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果來(lái)看，A549細(xì)胞對(duì)cRGD-LP的攝取能力更高。正是由于cRGD可以與αvβ3高度結(jié)合，從A549腫瘤球穿透試驗(yàn)表明，cRGD-LP的腫瘤球穿透能力高于PEG-LP，且可以穿透至腫瘤球深部。細(xì)胞攝取和腫瘤球穿透試驗(yàn)均說(shuō)明cRGD修飾的脂質(zhì)體可以更好的與A549細(xì)胞結(jié)合，進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用。如果將所構(gòu)建的cRGD-LP載入化療藥物，應(yīng)用到肺癌治療時(shí)，會(huì)有更多的化療藥物靶向分布到腫瘤病灶中，從而使得化療的療效大大提高。因此，cRGD-LP展示出其將來(lái)在肺癌治療中的良好的前景。

綜上所述，cRGD修飾的脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)，不僅有較高的穩(wěn)定性，而且與PEG修飾的脂質(zhì)體相比，更容易被A549細(xì)胞攝取，說(shuō)明cRGD修飾的脂質(zhì)體有潛力應(yīng)用在肺癌的治療中，為進(jìn)一步針對(duì)肺癌的化療研究奠定了基礎(chǔ)。

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Study on liposomes modified by cRGD targeting to lung cancer cell A549 in vitro

Zhang Zhiqiang1，Ma Haiying2，Li Yunxia1，Yang Yanrong1，Zhao Xin11.Department of Respiration；2.Department of Cardiovascular Surgery，the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College，Xinxiang，Henan，453100，China

ObjectiveTo construct a research on liposomes modified by cRGD（cRGD-LP）and its targeting ability to A549 cells in vitro.MethodsThe cRGD-LP was prepared by film-ultrasonic method.The size and zeta potential of cRGD-LP were detected.The cellular uptake of cRGD-LP to A549 cells was evaluated by flow cytometry.The penetration ability of cRGD-LP into the tumor spheroid was inspected by laser confocal microscopy.ResultsThe size of cRGD-LP was around（112.3±7.8）nm；the polydispersity index（PDI）of cRGD-LP was 0.023±0.045；the zeta potential was（2.38±0.87）mV.The cRGD-LP was stable within 24 h and kept the particle diameter at the level of 115 nm.The cellular uptake ability of A549 to cRGD-LP was 1.7-fold as PEG-LP（liposomes modified by PEG）.The tumor spheroid penetration ability of cRGD-LP was higher than that of PEG-LP.ConclusioncRGD-LP has high tumor targeting ability to A549 cells，and it is a potential drug delivery system.

lung cancer；integrin；cRGD；liposomes

R 734.2

A

1004-0188（2016）05-0482-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.05.007

2015-05-28）

453100河南新鄉(xiāng)，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸科（張志強(qiáng)，李運(yùn)霞，楊艷榮，趙欣），心外科（馬海英）