宋 楊，王曉飛，王宇光，董 凡，呂培軍

(北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院,口腔醫(yī)學(xué)數(shù)字化研究中心,口腔修復(fù)教研室 口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國家工程實(shí)驗(yàn)室 口腔數(shù)字醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，衛(wèi)生部口腔醫(yī)學(xué)計(jì)算機(jī)應(yīng)用工程技術(shù)研究中心， 北京 100081)

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·論著·

納米羥基磷灰石對人脂肪干細(xì)胞共混物三維生物打印影響的初步研究

宋 楊，王曉飛，王宇光，董 凡，呂培軍△

(北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院,口腔醫(yī)學(xué)數(shù)字化研究中心,口腔修復(fù)教研室 口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國家工程實(shí)驗(yàn)室 口腔數(shù)字醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，衛(wèi)生部口腔醫(yī)學(xué)計(jì)算機(jī)應(yīng)用工程技術(shù)研究中心， 北京 100081)

目的：初步研究納米羥基磷灰石對人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells，hASCs)共混物三維生物打印體細(xì)胞增殖和成骨分化的影響。方法：以P5代hASCs作為種子細(xì)胞，將10 g/L納米羥基磷灰石加入細(xì)胞-海藻酸鈉-明膠共混物(20 g/L海藻酸鈉，80 g/L明膠，細(xì)胞密度約為1×106個(gè)/mL)混合后進(jìn)行三維生物打印，作為實(shí)驗(yàn)組；另將細(xì)胞-海藻酸鈉-明膠共混物直接進(jìn)行三維生物打印，作為對照組。在打印后的既定時(shí)間點(diǎn)上，對實(shí)驗(yàn)組和對照組分別進(jìn)行顯微鏡觀察、CCK-8檢測、Western blot檢測和PCR檢測，分析打印體細(xì)胞增殖能力和成骨分化能力。結(jié)果：顯微鏡觀察和CCK-8檢測結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和對照組打印體內(nèi)細(xì)胞在打印完成后24 h和7 d均呈現(xiàn)良好的增殖能力。Western blot結(jié)果顯示，在打印完成后14 d，實(shí)驗(yàn)組和對照組的Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Runt-related transcription factor 2，RUNX2)蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PCR結(jié)果顯示，在打印完成后14 d，實(shí)驗(yàn)組的成骨相關(guān)基因RUNX2、osterix(OSX)和骨鈣素(osteocalcin，OCN)表達(dá)明顯高于對照組。結(jié)論：納米羥基磷灰石加入后，打印體內(nèi)細(xì)胞仍具有良好的增殖性，且打印體的體外成骨分化能力得到了增強(qiáng)。

打印，三維；納米羥基磷灰石；間充質(zhì)干細(xì)胞；脂肪組織

人脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells，hASCs)是成體間充質(zhì)干細(xì)胞的一種，具有自我更新和多向分化潛能，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)相比，具有來源廣泛、采集容易、經(jīng)濟(jì)便捷、易于臨床推廣等優(yōu)點(diǎn)，已成為骨組織工程學(xué)研究中的熱點(diǎn)[1]。傳統(tǒng)的組織工程技術(shù)的基本原理是將體外培養(yǎng)擴(kuò)增的種子細(xì)胞復(fù)合到支架材料上，構(gòu)成細(xì)胞-支架復(fù)合體，再進(jìn)行體外培養(yǎng)或植入體內(nèi)相應(yīng)的病損部位，對支架材料內(nèi)部的細(xì)胞分布和密度難以精確控制，而三維生物打印作為一種新型的組織工程手段，可將細(xì)胞和打印基質(zhì)混合，在計(jì)算機(jī)輔助下，按照預(yù)先設(shè)計(jì)的特定的三維結(jié)構(gòu)，對活細(xì)胞、生物活性組織及相關(guān)生物材料等構(gòu)成的共混物直接進(jìn)行逐層堆積[2]，具有良好的發(fā)展前景。

在細(xì)胞共混物三維生物打印研究中，由于明膠-海藻酸鈉具有良好的生物相容性和可塑形性，為目前該類研究中最常采用的共混物組分[3]，但其強(qiáng)度較差，易導(dǎo)致三維打印結(jié)構(gòu)的解體和破壞[4-5]，不利于細(xì)胞共混物三維生物打印技術(shù)的更進(jìn)一步研究，尤其是體內(nèi)應(yīng)用的研究。另一方面，在傳統(tǒng)組織工程學(xué)的支架材料研究中，納米羥基磷灰石因其納米尺寸下較普通羥基磷灰石更優(yōu)的生物相容性、生物活性以及力學(xué)性能成為研究熱點(diǎn)，各種納米羥基磷灰石復(fù)合材料得到廣泛的研究[6]。

本研究嘗試對現(xiàn)階段常用的三維生物打印基質(zhì)成分進(jìn)行初步改良，將納米羥基磷灰石加入hASCs-海藻酸鈉-明膠共混物后進(jìn)行三維生物打印，研究其對打印后細(xì)胞的增殖性以及成骨分化能力的影響，以期獲得更優(yōu)的hASCs共混物三維生物打印基質(zhì)組分構(gòu)成，為今后進(jìn)一步的體內(nèi)研究提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

主要儀器：Bioplotter三維生物打印機(jī)購自德國Envision公司。

主要試劑：hASCs細(xì)胞株購自美國Scien Cell公司，海藻酸鈉、明膠、無水CaCl2、納米羥基磷灰石粉末(粉末直徑約100 μm)、CCK-8(cell counting kit-8)試劑盒、成骨誘導(dǎo)因子β-磷酸甘油、抗壞血酸、地塞米松均購自美國Sigma公司，DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)培養(yǎng)基、胎牛血清、100×細(xì)胞培養(yǎng)用青鏈霉素混合液均購自美國Gibco公司，Western blot試劑均購自美國AMRESCO公司，PCR提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Transcript RT Kit)購自中國天根生化公司，qPCR試劑盒購自美國KAPA Biosystems公司，細(xì)胞培養(yǎng)皿等耗材購自美國Corning公司。

1.2 hASCs共混物的三維生物打印

1.2.1 hASCs的培養(yǎng)和傳代 將P2代hASCs加入增殖培養(yǎng)基(proliferation medium, PM)，成分DMEM+10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清+1%(體積分?jǐn)?shù))青鏈霉素，置于5%(體積分?jǐn)?shù))CO2，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)至7 d左右，細(xì)胞生長至70%～80%匯合狀態(tài)后進(jìn)行細(xì)胞傳代，每個(gè)培養(yǎng)皿中的細(xì)胞經(jīng)過胰酶消化、中和、離心和重懸后，接種至3個(gè)培養(yǎng)皿中，每6～7 d匯合度達(dá)到80%～90%后，再次進(jìn)行傳代；傳代3次后的hASCs標(biāo)記為P5作為實(shí)驗(yàn)用種子細(xì)胞。

1.2.2 hASCs共混物的制備 用生理鹽水分別溶解海藻酸鈉、明膠干粉，配置海藻酸鈉-明膠混合溶膠，其中海藻酸為20 g/L，明膠為80 g/L。收集1.2.1小節(jié)中培養(yǎng)的P5代hASCs細(xì)胞，離心、重懸、計(jì)數(shù)，確認(rèn)細(xì)胞存活率大于90%后，將細(xì)胞懸液與海藻酸鈉-明膠水溶膠混合，并以10 g/L濃度加入納米羥基磷灰石粉末，輕柔攪拌，制備細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL的hASCs共混物，作為實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞共混物。另按上述方法制備不含納米羥基磷灰石的hASCs-海藻酸鈉-明膠水溶膠共混物，作為對照組細(xì)胞共混物。

1.2.3 hASCs共混物三維生物打印 將1.2.2小節(jié)中制備獲得的實(shí)驗(yàn)組共混物置于Bioplotter三維生物打印機(jī)的料盒中，并與打印噴頭相連，進(jìn)行打印。打印過程中主要參數(shù)如下：打印溫度15 ℃，打印噴頭直徑250 μm，打印微絲直徑200 μm，微絲中心間距400 μm，打印設(shè)備配套軟件系統(tǒng)根據(jù)上述設(shè)定參數(shù)，自動(dòng)生成打印結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。打印機(jī)基于微流連續(xù)擠出的生物繪圖技術(shù)，由預(yù)先設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)(computer aided design，CAD )數(shù)字模型及掃描速度驅(qū)動(dòng)打印機(jī)的噴頭運(yùn)動(dòng)，將噴出的共混物拉成絲狀，沉積到載有無菌細(xì)胞培養(yǎng)皿的平臺(tái)上，擠出的共混物因明膠的溫度敏感性發(fā)生物理交聯(lián)，由溶膠轉(zhuǎn)變?yōu)槟z；打印為逐層進(jìn)行，不同的打印層面之間交錯(cuò)疊加形成具有三維結(jié)構(gòu)的打印體(圖2)。打印完成即刻，使用 100 mmol/L CaCl2和50 mmol/L KCl2的混合溶液對三維打印體進(jìn)行交聯(lián)，交聯(lián)5 min后獲得最終的實(shí)驗(yàn)組打印體(Gexp)。另將對照組共混物按照上述同樣方法和參數(shù)進(jìn)行三維生物打印，獲得對照組打印體(G0)。

圖1 三維打印結(jié)構(gòu)示意圖 圖2 具有三維結(jié)構(gòu)的細(xì)胞共混物打印體
Figure 1 3D structure diagram of bio-printing Figure 2 Cells mixture with 3D structure after bio-printing

1.3 hASCs共混物三維生物打印體的檢測

1.3.1 hASCs共混物三維生物打印體結(jié)構(gòu)觀測 將實(shí)驗(yàn)組和對照組hASCs共混物打印體均置于PM中進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，于打印完成即刻、24 h和7 d采用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.3.2 hASCs共混物三維生物打印體細(xì)胞增殖情況檢測 將實(shí)驗(yàn)組和對照組hASCs共混物打印體均置于PM中進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，于打印完成即刻、24 h和7 d，將各組打印體加入24孔板后分別對其進(jìn)行CCK-8檢測，記錄450 nm各孔光密度值， 檢測打印體內(nèi)細(xì)胞增殖情況。

1.3.3 hASCs共混物三維生物打印體細(xì)胞成骨分化情況檢測 將實(shí)驗(yàn)組和對照組hASCs共混物打印體均分別置于PM和成骨培養(yǎng)基(osteogenic medium，OM)中進(jìn)行培養(yǎng)，成骨培養(yǎng)基成分DMEM+10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清+1%(體積分?jǐn)?shù))青鏈霉素+10 mmol/L β-磷酸甘油+200 mmol/L抗壞血酸+100 nmol/L地塞米松，體外培養(yǎng)14 d后，獲得PM實(shí)驗(yàn)組、PM對照組、OM實(shí)驗(yàn)組以及OM對照組(PM-Gexp、PM-G0、OM-Gexp以及OM-G0)打印體樣本，進(jìn)行如下檢測：(1)Western blot檢測：對各組打印體樣本內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行蛋白提取、收集、濃度調(diào)整、配膠、蛋白上樣(每孔蛋白樣本量為6 μg)、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2，RUNX2)一抗(Cell Signaling Technology，Danvers，MA，美國)孵育、洗膜，二抗孵育、洗膜，反應(yīng)、曝光、定影，并對結(jié)果進(jìn)行灰度分析；(2)qRT-PCR檢測：對各組打印體樣本內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行RNA提取，反轉(zhuǎn)錄步驟按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根生化，中國)商品說明書進(jìn)行，qRT-PCR檢測步驟按照qPCR試劑盒(KAPA Biosystems，美國)商品說明書進(jìn)行，對RUNX2、osterix(OSX)和骨鈣素(osteocalcin，OCN)的基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測,其中RUNX2、OSX和OCN引物序列如表1所示。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列Table 1 Sequences of the primers used for real-time PCR

RUNX2, Runt-related transcription factor 2;OCN, osteocalcin;OSX, osterix.

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 17.0軟件，對1.3.3小節(jié)中各組別的qRT-PCR結(jié)果采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差方式描述，并進(jìn)行方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 hASCs共混物三維生物打印后顯微鏡觀察結(jié)果

在打印完成即刻、24 h和7 d，倒置顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)組和對照組打印體發(fā)現(xiàn)：三維打印體內(nèi)細(xì)胞分布均勻，實(shí)驗(yàn)組打印體內(nèi)可見散在分布的納米羥基磷灰石顆粒；打印后7 d實(shí)驗(yàn)組和對照組打印體內(nèi)細(xì)胞均呈現(xiàn)顯著增殖，對照組打印體內(nèi)局部出現(xiàn)了結(jié)構(gòu)解體現(xiàn)象(圖3)。

A,G after printed immediately; A’, G after printed immediately; B, G 24 h after printed; B’, G 24 h after printed; C, G 7 d after printed; C’, G 7 d after printed. Red arrow indicates nano hydroxyapatite particle, white arrow indicates porous structure, and blue arrow indicates disintegration of structure.

圖3 細(xì)胞共混物打印后的顯微鏡觀察結(jié)果
Figure 3 Microscope observation results of hASCs mixture after bio-printing

2.2 hASCs共混物三維生物打印后細(xì)胞增殖情況檢測

通過CCK-8檢測，在打印完成即刻、24 h和7 d分別對實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞增殖進(jìn)行觀測，并繪制細(xì)胞增殖曲線，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與對照組打印體內(nèi)細(xì)胞在打印完成后24 h和7 d兩個(gè)觀察點(diǎn)均呈現(xiàn)增殖趨勢(圖4)，表明納米羥基磷灰石的加入對hASCs共混物三維生物打印體內(nèi)的細(xì)胞增殖能力無不良影響。

2.3 hASCs共混物三維生物打印后成骨分化情況

2.3.1 Western blot檢測結(jié)果 Western blot及灰度分析結(jié)果如圖5和表2所示，體外培養(yǎng)14 d后，OM組打印體的RUNX2蛋白水平高于PM組，而OM實(shí)驗(yàn)組和OM對照組之間以及PM 實(shí)驗(yàn)組和PM對照組之間均無明顯差異。

圖4 打印后細(xì)胞增殖曲線
Figure 4 Proliferation curves for cells after bio-printing

2.3.2 qRT-PCR檢測結(jié)果 體外培養(yǎng)14 d后，各組hASCs共混物打印體基因表達(dá)水平的qRT-PCR結(jié)果如圖6所示。RUNX2、OSX、OCN在各組間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，OM組明顯高于PM組，OM實(shí)驗(yàn)組明顯高于OM對照組，PM實(shí)驗(yàn)組明顯高于PM對照組。

圖5 RUNX2蛋白印跡法結(jié)果
Figure 5 Western blot results of RUNX2

3 討論

現(xiàn)階段三維生物打印研究中所用的打印墨水多為水凝膠類材料[7-8]，一般滿足以下條件：(1)具有良好的生物相容性；(2)具有可塑型，可通過擠出方式成形；(3)可通過調(diào)節(jié)材料的溫度和交聯(lián)劑等交

聯(lián)條件，對材料交聯(lián)過程進(jìn)行控制，實(shí)現(xiàn)打印體結(jié)構(gòu)的成形穩(wěn)定；(4)可以為細(xì)胞提供相應(yīng)的生長微環(huán)境，利于細(xì)胞的生長擴(kuò)增以及營養(yǎng)物質(zhì)的滲透擴(kuò)散。海藻酸鈉-明膠混合物較好的滿足了上述特性，且海藻酸鈉可通過交聯(lián)劑CaCl2的化學(xué)作用發(fā)生離子置換而形成降解速度較慢的海藻酸鈣，可以在一定時(shí)間內(nèi)維持結(jié)構(gòu)體在三維方向上的穩(wěn)定性，有研究表明該混合物中的明膠在打印后24 h就有部分流失降解，在海藻酸鈣中形成不規(guī)則孔隙，利于細(xì)胞在打印體中的附著與遷移，因此，海藻酸鈉-明膠共混物是目前三維生物打印研究中最為常用的材料之一[9-11]。但是，海藻酸鈉-明膠也受水凝膠本身性質(zhì)限制，強(qiáng)度較低，當(dāng)進(jìn)行多層打印或者構(gòu)建尺寸較大的打印體時(shí)，易出現(xiàn)結(jié)構(gòu)塌陷以及結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定。另外，本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞共混物三維生物打印體在體外培養(yǎng)7～14 d時(shí)，海藻酸鈉-明膠構(gòu)成的打印結(jié)構(gòu)即出現(xiàn)解體現(xiàn)象。

表2 蛋白印跡積分光密度值分析Table 2 Integrated option density results of Western blot

圖6 成骨基因表達(dá)的qRT-PCR檢測結(jié)果
Figure 6 qRT-PCR results for osteogenic genes expression

羥基磷灰石作為人和動(dòng)物骨骼的主要無機(jī)物組成成分，具有良好的生物活性和生物相容性[12-13]。研究表明，當(dāng)羥基磷灰石的尺寸達(dá)到納米級(jí)時(shí)，該材料會(huì)表現(xiàn)出一些新的特殊性能，具有更強(qiáng)的力學(xué)性能和生物活性。目前，在組織工程學(xué)研究應(yīng)用中多采用納米羥基磷灰石與天然高分子或人工高分子材料構(gòu)成的復(fù)合材料，如：納米羥基磷灰石/膠原蛋白復(fù)合材料作為骨組織工程支架材料有利于成骨細(xì)胞的早期附著[14]，可提高其分化能力[15]；納米羥基磷灰石/殼聚糖-硫酸軟骨素復(fù)合材料具有良好的礦化能力和力學(xué)性能[16]等。

因此，本研究嘗試對現(xiàn)有三維生物打印的常用打印基質(zhì)進(jìn)行改良，在海藻酸鈉-明膠水凝膠中加入納米羥基磷灰石。所采用的納米羥基磷灰石顆粒直徑小于200 nm，以合適的濃度加入海藻酸鈉-明膠水溶膠后得到的混合物可以滿足細(xì)胞共混物三維生物打印過程中對于打印基質(zhì)材料流動(dòng)性和塑形性質(zhì)的要求；另一方面，基于以往傳統(tǒng)組織工程學(xué)研究中納米羥基磷灰石材料所表現(xiàn)出的生物學(xué)和力學(xué)特性，納米羥基磷灰石顆粒對于細(xì)胞共混物三維生物打印體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、力學(xué)性能以及生物性能等可能都將產(chǎn)生積極的作用。本實(shí)驗(yàn)成功獲取了具有高細(xì)胞活性的含有納米羥基磷灰石的三維生物打印結(jié)構(gòu)體，證實(shí)了將納米羥基磷灰石加入細(xì)胞共混物三維打印基質(zhì)的可行性，并獲得了納米羥基磷灰石對打印體內(nèi)細(xì)胞增殖情況和成骨分化情況影響的初步結(jié)果。在后續(xù)研究中，課題組將就其對于細(xì)胞共混物三維生物打印體的力學(xué)性能、生物學(xué)性能以及動(dòng)物體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)的影響展開進(jìn)一步的研究。

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(2015-06-08收稿)

(本文編輯：趙 波)

A preliminary study for the effect of nano hydroxyapatite on human adipose-derived mesenchymal stem cells mixture 3D bio-printing

SONG Yang, WANG Xiao-fei, WANG Yu-guang, DONG Fan, LU Pei-jun△

(Center of Digital Dentistry, Department of Prosthodontics, Peking University School and Hospital of Stomatology & Na-tional Engineering Laboratory for Digital and Material Technology of Stomatology & Beijing Key Laboratory of Digital Stomatology, Research Center of Engineering and Technology for Digital Dentistry of Ministry of Health, Beijing 100081, China)

Objective：To study the effect of nano hydroxyapatite on human adipose-derived mesenchymal stem cells(hASCs) mixture 3D bio-printing for cells’ proliferation and osteogenesis. Methods: P5hASCs were used as seed cells, 10 g/L nano hydroxyapatite was added into the cell-sodium alginate-gelatin mixture (concentration: 20 g/L sodium alginate, 80 g/L gelatin; cell density: 1×106/mL), then the mixture was printed by 3D bio-printer as the experimental group. And the cell-sodium alginate-gelatin mixture without nano hydroxyapatite was printed as the control group. Respectively, both the experimental and control groups were detected by microscope, CCK-8, Western blot and PCR at certain time pointsafter being printed, whose cells’ proliferation and osteogenic differentiation were analyzed. Results: The microscopic observation and CCK-8 results showed that the cells of the experimental group and the control group both had a good proliferation 24 h and 7 d after being printed. The Western blot results showed that 14 d after printing, the expression of Runt-related transcription factor 2 (RUNX2) had no statistical difference between the experimental group and control group. The PCR results showed that 14 d after printing, the expression of osteogenesis-related genes (RUNX2, osterix, and osteocalcin) was significantly higher in the experimental group than in the control group. Conclusion: Nano hydroxyapatite can increase osteogenic differentiation of the hASCs mixture after bio-printing, in which the cells still have a good proliferation.

Printing, three-dimensional; Nano-hydroxyapatite; Mesenchymal stromal cells; Adipose tissue

教育部科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(113002A)資助Supported by Science and Technology Research Project of Chinese Ministry of Education, China (113002A)

時(shí)間：2016-9-5 9：44：51

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20160905.0944.034.html

R329.4

A

1671-167X(2016)05-0894-06

10.3969/j.issn.1671-167X.2016.05.027

△ Corresponding author’s e-mail, kqlpj@bjmu.edu.cn