解潤芳，張秀峰，李慧方潔，王 蕊

(昆明醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，昆明 650500)

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·論 著·

生物檢材中苯巴比妥的測(cè)定*

解潤芳，張秀峰，李慧方潔，王 蕊

(昆明醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，昆明 650500)

目的 建立一種簡便、快速、準(zhǔn)確、可靠的方法檢測(cè)生物檢材中的苯巴比妥。方法 丙酮∶水(8∶2)對(duì)生物檢材進(jìn)行浸泡，然后在pH值為3～4條件下，采用乙酸乙酯進(jìn)行提取分離，氣相-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，使用總離子流圖(TIC圖)中苯巴比妥保留時(shí)間及質(zhì)譜圖中苯巴比妥的特征離子碎片定性，應(yīng)用外標(biāo)法進(jìn)行定量。 結(jié)果 該方法簡單易操作，背景干擾小，分離效果好，分析速度快，用于苯巴比妥定性的保留時(shí)間為8.385 min，苯巴比妥的特征離子碎片為m/z 204和m/z 232；以m/z 204為定量離子碎片，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量，回收率為87.35%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為5.43%，最低檢出限(LLOD)為0.005 mg/mL。 結(jié)論 該方法可用于法醫(yī)毒物分析生物檢材中苯巴比妥的檢驗(yàn)，效果良好。

法醫(yī)毒物分析； 外標(biāo)法； 氣相-質(zhì)譜聯(lián)用； 生物檢材； 苯巴比妥

苯巴比妥又稱魯米那，在空氣中穩(wěn)定，微溶于水，溶于熱水和乙醇，顯酸性、易溶于堿性溶液[1-3]。苯巴比妥作為長效巴比妥類藥物，具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥、抗癲癇作用。臨床上常用于兒童抗癲癇治療，隨著苯巴比妥的廣泛使用，涉及苯巴比妥中毒的案(事)件越來越多，因此建立一種簡單、可靠，滿足法醫(yī)毒物分析對(duì)生物檢材中的苯巴比妥進(jìn)行檢驗(yàn)的方法具有較好的現(xiàn)實(shí)意義?，F(xiàn)根據(jù)苯巴比妥的理化性質(zhì)及參考文獻(xiàn)[4-8]，采用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)外標(biāo)法檢測(cè)生物檢材中的苯巴比妥，生物檢材經(jīng)過簡單的樣品前處理，使用GC-MS對(duì)樣品進(jìn)行定性定量分析。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 GC/MS：Agilent7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；配有電子轟擊離子源(EI)及Nest11.0化學(xué)圖譜庫。苯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 mg/mL)購自司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所；甲醇(色譜純)；二次蒸餾水。

1.2 溶液配制 苯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確移取一定量苯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)溶液置于10 mL容量瓶中，應(yīng)用色譜純甲醇稀釋至刻度，使其濃度為0.01 mg/mL。待測(cè)樣品：沙某心血、肝臟、胃及胃內(nèi)容物。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 GC/MS儀器條件 離子源：EI源；離子化能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；4極桿溫度：150 ℃；色譜柱：HP-5ms 30 m×0.25 mm×0.25 μm。進(jìn)樣口溫度：280 ℃；傳輸線溫度：250 ℃；程序升溫：初溫80 ℃保持3 min，以30 ℃/min的速率升溫至300 ℃，保持8 min；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣；分流比：10∶1；載氣:氦氣；純度：>99.99%；流速：1.0 mL/min。

1.3.2 樣品前處理 分別取送檢沙某心血5 mL，肝臟10 g(剪碎)，胃及胃內(nèi)容物10 g(剪碎)，置于50 mL具塞塑料離心管中，均加入20 mL丙酮∶水(8∶2)浸泡約30 min，然后3 000 r/min離心機(jī)離心3 min，取出上清液分別放置于3個(gè)瓷坩堝中，殘?jiān)匀挥?0 mL丙酮∶水浸提2次，并把后2次的上清液合并于同一個(gè)瓷坩堝中，把瓷坩堝放在85 ℃水浴鍋上揮干，取下瓷坩堝，冷卻至室溫。采用15 mL pH值為3～4的鹽酸水溶液少量多次地洗滌瓷坩堝上的揮干物，并轉(zhuǎn)移至50 mL具塞塑料離心管，使用50 mL乙酸乙酯萃取3次，3次萃取液都置于同一瓷坩堝中，把瓷坩堝置85 ℃水浴鍋上揮干，取下瓷坩堝，冷卻至室溫，應(yīng)用色譜純甲醇少量多次地洗滌瓷坩堝中的物質(zhì)，并定容在1 mL色譜純甲醇中，置于進(jìn)樣瓶中，分別得到沙某待測(cè)心血、肝臟、胃及胃內(nèi)容物。

1.3.3 分析檢測(cè) 將空白對(duì)照樣品(色譜純甲醇)，0.01 mg/mL苯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)工作液，沙某待測(cè)心血、肝臟、胃及胃內(nèi)容物，分別進(jìn)樣1 μL，應(yīng)用GC/MS在1.3.1條件下進(jìn)行分離分析。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)照樣品結(jié)果 空白對(duì)照樣品在TIC圖中8.385 min處未出峰，說明色譜純甲醇可作為空白試劑使用，不影響測(cè)定，可排除假陽性干擾的可能。苯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)工作液的TIC圖表明，8.385 min出現(xiàn)苯巴比妥的色譜峰，且峰形很好基本呈正態(tài)分布，說明所建立的分離分析方法適用于苯巴比妥的檢測(cè)。苯巴比妥TIC圖中色譜峰所對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖(MS圖)顯示苯巴比妥的特征離子碎片為m/z 204和m/z 232，與Nest11.0化學(xué)圖譜庫中苯巴比妥的匹配度較高(>95%)，進(jìn)一步確證為苯巴比妥，且GC/MS分離分析方法還提供苯巴比妥的分子結(jié)構(gòu)，使定性更加準(zhǔn)確、可靠。

2.2 待測(cè)樣品結(jié)果 沙某待測(cè)心血TIC圖中8.385 min未出現(xiàn)苯巴比妥的色譜峰，提示待測(cè)心血中未檢出苯巴比妥。沙某待測(cè)肝臟、胃及胃內(nèi)容物的TIC圖和所對(duì)應(yīng)的MS圖表明，8.472 min處出現(xiàn)苯巴比妥的色譜峰，但在8.462 min處出現(xiàn)苯巴比妥的色譜峰，與苯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)工作液中苯巴比妥的保留時(shí)間(8.385 min)比較,兩者均存在微小差異，其中相對(duì)誤差最大的為1.03%，在定性過程中誤差小于3%，不影響定性的準(zhǔn)確性。MS圖顯示待測(cè)肝臟、胃及胃內(nèi)容物均說明苯巴比妥的特征離子碎片為m/z 204和m/z 232，與Nest11.0化學(xué)圖譜庫中苯巴比妥的匹配度較高(>95%)，將成為待測(cè)肝臟、胃及胃內(nèi)容物中檢出苯巴比妥的直接依據(jù)。見圖1。

圖1 沙某待測(cè)心血的TIC圖

2.3 定量結(jié)果

2.3.1 定量待測(cè)肝臟的制備 準(zhǔn)確稱取沙某肝臟10.304 50 g(剪碎)，按1.3.2的方法進(jìn)行樣品前處理后，得到沙某定量待測(cè)肝臟(CX)；將定量待測(cè)肝臟用GC/MS在1.3.1條件下進(jìn)樣1 μL，得到以m/z 204的特征離子碎片為定量離子的峰面積(AX)。將0.01 mg/mL苯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)工作液(CS)，用GC/MS在1.3.1條件下進(jìn)樣1 μL，得到以m/z 204的特征離子碎片為定量離子的峰面積(AS)。

2.3.2 肝臟中苯巴比妥含量 按以下2個(gè)公式計(jì)算沙某肝臟中苯巴比妥含量(WX)，式中V表示定容體積(mL)；W表示稱取檢材的含量(g)。

(1)

(2)

由公式計(jì)算獲得肝臟中苯巴比妥含量為0.006 7 mg/g，未超出臨床用藥的劑量，證實(shí)沙某不是死于苯巴比妥中毒。沙某出生3個(gè)月后家屬發(fā)現(xiàn)其出現(xiàn)無誘因抽搐，確診為癲癇。2015年某日突發(fā)抽搐，急送醫(yī)院救治，入院第2天9:00注射抗癲癇藥后出現(xiàn)面色青紫，呼吸不暢，經(jīng)搶救無效死亡。其生前使用過苯巴比妥，但用量未超出臨床用藥劑量，因?yàn)樯衬承难形礄z出苯巴比妥，雖肝臟中檢出但含量不高，符合臨床用藥規(guī)范；胃及胃內(nèi)容物中檢出，可能是因?yàn)樗篮笤俜植妓稹?/p>

2.4 回收率 采用移液器精確吸取空白全血0.99 mL 4份，分別加入0.01 mL濃度為1 mg/mL的苯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)溶液，使空白全血中苯巴比妥的添加濃度均為0.01 mg/mL。再按1.3.2 的方法對(duì)4份樣品進(jìn)行處理后，分別進(jìn)樣1 μL，用GC/MS在1.3.1條件進(jìn)行分離分析，以m/z 204的特征離子碎片作為定量離子碎片，可得到4份樣品的峰面積。由公式(1)可計(jì)算得到4份樣品的實(shí)際濃度，從而獲得4份樣品的平均濃度。因此4份樣品的平均濃度除以添加濃度0.01 mg/mL，再乘以100%可計(jì)算得出回收率，所建方法的回收率為87.35%。雖然回收率不高，但是所建方法簡單，易操作，完全能夠滿足法醫(yī)毒物分析快速測(cè)定生物檢材中苯巴比妥的要求。

2.5 精密度 將0.01 mg/mL苯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)工作液，用GC/MS在1.3.1條件下，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣1 μL，可得到5次進(jìn)樣m/z 204的特征離子碎片的峰面積，由此可計(jì)算精密度，所建方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.43%，RSD小于10%說明所建方法的精密度良好，能滿足實(shí)際工作的檢測(cè)需要。

2.6 穩(wěn)定性 按2.4方法配制的空白血添加樣品，分別在樣品處理前、后室溫放置1、3、6、12、24 h后，采用1.3.2 方法進(jìn)行樣品處理，用GC/MS在1.3.1色譜條件下進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定，分析結(jié)果相對(duì)誤差均小于10%。結(jié)果顯示，所建方法穩(wěn)定性良好。

2.7 最低檢測(cè)限(LLOD) 分別將0.01 mg/mL苯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)工作液，用色譜純甲醇梯度稀釋配制成苯巴比妥含量為0.005、0.001 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。用GC/MS在1.3.1色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。苯巴比妥含量為0.005 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液S/N>3，苯巴比妥含量為0.001 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液S/N<3，因此，所建方法的最低檢出限為0.005 mg/mL，說明所建方法靈敏度良好。

3 討 論

采用GC-MS測(cè)定生物檢材中的苯巴比妥是一種簡便、快速、準(zhǔn)確、可靠的方法，具有許多優(yōu)點(diǎn)。方法簡單、易操作、生物樣品僅經(jīng)過簡單的樣品前處理，檢測(cè)結(jié)果顯示基質(zhì)干擾小，分離效果好，特別適用于臨床及司法鑒定中快速測(cè)定的要求。所建方法以總離子流圖苯巴比妥的保留時(shí)間初步定性，并將質(zhì)譜圖與Nest11.0化學(xué)圖譜庫比較進(jìn)行確證，用單點(diǎn)外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，方法定性定量準(zhǔn)確。所建方法經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證，分離度、回收率、RSD、LLOD等指標(biāo)都符合測(cè)定要求。

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Determination of phenobarbital in biomaterial*

XIERunfang,ZHANGXiufeng,LIHuifangjie,WANGRui

(SchoolofForensicMedicine,KunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650500，China)

Objective To establish a kind of simple,rapid,accurate and reliable method to determine the phenobarbital in the biomaterial.Methods We pre-treated biomaterial by the method that the reagent of acetone∶water (v/v 8∶2) was firstly used to soak the biomaterial,and then we took use of ethyl acetate as reagent to extract the phenobarbital of the biomaterial in the present of pH=3-4.We finally employed GC-MS to determine these samples.On the one hand,we not only took advantage of the retention time of the phenobarbital in total ion current (TIC) but also took advantage of the characteristic fragment ions of phenobarbital in mass spectrogram as qualitative basis.On the other hand,we took advantage of the external standard method as quantitative basis.Results The method had the characteristics of the simple and easy operation.There was hardly background interference and there was good separation effect in the method.The method also had the characteristics of fast analytical speed such as the retention time of the phenobarbital was 8.385 min.The characteristic fragment ions of phenobarbital was m/z 204 and m/z 232.The characteristic fragment ions of m/z 204 was served as quantitative ion fragments and we employed the external standard method to quantify in the method.In short,the average recovery rate of the method was 87.35%.Relative standard deviation (RSD) was 5.43% in the method.The lowest limit of detection (LLOD) was 0.005 mg/mL.Conclusion The method showes satisfactory result that it could be applied to determine the phenobarbital of the biomaterial of forensic toxicological analysis.

forensic toxicology analysis; the external standard method; GC-MS; biomaterial; phenobarbital

云南省科技廳/昆明醫(yī)科大學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2014FB013;2016FZ007)。

解潤芳，女，講師，主要從事毒藥物分析研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.20.004

A

1673-4130(2016)20-2813-03

2016-04-16

2016-07-28)