高朝賢，朱玉蘭，陳鈺婷，李麗梅，張 文，劉征宇，楊學(xué)琴，惠長(zhǎng)野△

(1.廣東省深圳市職業(yè)病防治院病理毒理科 518020；2.廣東省深圳國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室 518033)

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·論 著·

微板速率法檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的研究

高朝賢1，朱玉蘭2，陳鈺婷1，李麗梅1，張 文1，劉征宇1，楊學(xué)琴1，惠長(zhǎng)野1△

(1.廣東省深圳市職業(yè)病防治院病理毒理科 518020；2.廣東省深圳國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室 518033)

目的 探討全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)微板速率法檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)的方法評(píng)價(jià)和臨床應(yīng)用。方法 參照國(guó)際臨床化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IFCC)的推薦方法，結(jié)合分析系統(tǒng)建立微板速率法，通過方法學(xué)試驗(yàn)，評(píng)價(jià)其線性、批內(nèi)和批間重復(fù)性；比較823例體檢者血清標(biāo)本采用微板速率法與常規(guī)生化分析儀法檢測(cè)ALT的結(jié)果，并評(píng)價(jià)方法的臨床應(yīng)用。結(jié)果 微板速率法檢測(cè)ALT，在活性303 U/L以下具有良好的線性；批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于1/5TEa，其檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)生化分析儀的相關(guān)性良好。結(jié)論 全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)微板速率法檢測(cè)ALT，為大批量標(biāo)本同時(shí)檢測(cè)ALT和ELISA項(xiàng)目提供了很好的選擇，值得臨床推廣使用。

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶； 微板速率法； 酶聯(lián)免疫分析

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)檢測(cè)是采供血機(jī)構(gòu)獻(xiàn)血者和出入境檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)法定的體檢者必查項(xiàng)目之一[1-4]。ALT檢測(cè)方法較多[5-6]。國(guó)際臨床化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IFCC)和國(guó)家衛(wèi)計(jì)委推薦速率法[7-8]。本研究基于速率法原理，結(jié)合全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)的特點(diǎn)建立一種快速檢測(cè)方法(微板速率法)，并對(duì)該方法的線性、精密度、準(zhǔn)確度等進(jìn)行評(píng)價(jià)。為采供血機(jī)構(gòu)和檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)篩查ALT提供一種更高效的檢測(cè)方法。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 由深圳國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心提供的823例出入境者血清標(biāo)本，標(biāo)準(zhǔn)品由美國(guó)貝克曼公司提供，質(zhì)控品購(gòu)自RANDOX公司。

1.2 儀器與試劑 Genesis RSP 150/8全自動(dòng)加樣儀(瑞士Tecan 公司)，F(xiàn)AME 24/20全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)(瑞士Hamilton公司)，AU2700全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)貝克曼公司)；96孔微量反應(yīng)板(北京萬泰藥業(yè)有限公司)，ALT速率法試劑(上?？迫A生物科技股份有限公司)，標(biāo)準(zhǔn)血清(美國(guó)貝克曼公司，批號(hào)：66300/0117，定值：85.6 U/L)，質(zhì)控血清[英國(guó)RANDOX，批號(hào)：HN1530/740UN、HN1532/539UE，參考值：(38±9)、(133±27)U/L]。

1.3 方法 微板速率法檢測(cè)ALT：96孔平底酶標(biāo)板，設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔3孔，質(zhì)控孔2孔(低值和高值各1孔)，留1孔空白，其他為待檢標(biāo)本孔，采用Genesis RSP 150/8全自動(dòng)加樣儀分別加標(biāo)準(zhǔn)血清、質(zhì)控血清，標(biāo)本血清各40 μL，試劑1加入200 μL。試劑2裝入FAME 24/20全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)，設(shè)定第1次讀板程序。試劑2加樣量50 μL，加樣速度為最快，試劑加完后立即讀板，測(cè)定主波長(zhǎng)340 nm， 參考波長(zhǎng)620 nm。設(shè)定第2次讀板的主波長(zhǎng)和參考波長(zhǎng)同第1次讀板程序，不需加試劑。第1次讀板完成后，取出酶標(biāo)板，37 ℃孵育600 s后，進(jìn)行第2次讀板。導(dǎo)出檢測(cè)數(shù)據(jù)，Excel處理算出標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果。

1.3.1 線性試驗(yàn) 抽取ALT活性683 U/L(AU2700 全自動(dòng)生化分析儀)的血清標(biāo)本，使用生理鹽水做2/3比例稀釋成活度梯度683、455、303、202、135、90、60、40、27、18、12 U/L的11例標(biāo)本，應(yīng)用微板速率法檢測(cè)ALT結(jié)果。

1.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) RANDOX質(zhì)控血清2例，正常值和高值血清各1例，應(yīng)用微板速率法連續(xù)重復(fù)檢測(cè)20 次，評(píng)價(jià)該方法的批內(nèi)重復(fù)性；每天檢測(cè)1次，重復(fù)20 d，評(píng)價(jià)該方法的批間重復(fù)性。

1.3.3 對(duì)比試驗(yàn) 823例血清標(biāo)本分別采用微板速率法和AU2700全自動(dòng)生化分析儀的傳統(tǒng)檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，分析2種方法的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。繪制吸光度變化與ALT活性散點(diǎn)圖，擬合ALT≤303 U/L的直線方程；描述批內(nèi)、批間重復(fù)性試驗(yàn)的均值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)；比較2種方法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 線性試驗(yàn) ALT 活性在303 U/L 以下具有良好的線性， ALT與測(cè)得吸光度變化的擬合曲線為Y=0.003X+0.005 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 3。超過303 U/L，吸光度變化偏離曲線，隨ALT活性升高但吸光度升高不明顯。見圖1。

圖1 微板速率法檢測(cè)ALT線性試驗(yàn)

2.2 重復(fù)性試驗(yàn) 美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)法案修正案(CLIA′88)規(guī)定ALT允許總誤差(TEa)為靶值的±20%，微板速率法檢測(cè)ALT批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于4%，小于1/5TEa。見表1。

表1 微板速率法檢測(cè)ALT重復(fù)性試驗(yàn)

圖2 微板速率法與生化分析儀法的對(duì)比試驗(yàn)

2.3 對(duì)比試驗(yàn) 2種方法檢測(cè)823 例血清標(biāo)本的結(jié)果具有良好的相關(guān)性，擬合線性回歸方程為Y=0.989X+0.289，R2=0.993。2種方法檢測(cè)823 例陽性結(jié)果顯示，大于40 U/L陽性結(jié)果的符合率為99.88%。見圖2和表2。

表2 2種方法檢測(cè)ALT的結(jié)果比較[n(%)]

3 討 論

IFCC推薦的ALT檢測(cè)方法是速率法，其原理是L-丙氨酸和α-酮戊二酸在ALT的作用下生成丙酮酸和L-谷氨酸，丙酮酸在乳酸脫氫酶(LDH)的作用下生成L-乳酸，同時(shí)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)被氧化成為NAD+，NADH吸光度的下降速率和ALT的活力呈正比，NADH在340 nm處有特異吸收峰，測(cè)定其下降速率，即可測(cè)出ALT活性。該方法具有準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好的特點(diǎn)，在臨床檢測(cè)中應(yīng)用廣泛，但必須在生化分析儀上完成。與ALT一樣，HBsAg和HIV等ELISA項(xiàng)目也是獻(xiàn)血者和法定體檢者的必檢項(xiàng)目，采供血機(jī)構(gòu)和出入境檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)通常需先用酶標(biāo)儀完成ELISA檢測(cè)再用生化分析儀完成ALT檢測(cè)。本研究建立的微板速率法可使ALT與ELISA檢測(cè)項(xiàng)目同時(shí)加樣，并可同時(shí)利用全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)檢測(cè)，1次可檢測(cè)90例標(biāo)本，10 min內(nèi)完成，免除繁瑣步驟，減少差錯(cuò)發(fā)生，同時(shí)也可避免不同儀器間多次檢測(cè)的攜帶污染問題。

本研究微板速率法在ALT活性303 U/L以下時(shí)具有良好的線性，檢測(cè)上限約300 U/L，檢測(cè)ALT具有良好的批內(nèi)和批間重復(fù)性，與傳統(tǒng)生化分析儀法的結(jié)果比較，兩者相關(guān)性很好，陽性結(jié)果符合率達(dá)99.88%。相關(guān)研究報(bào)道，微板ALT檢測(cè)方法多數(shù)以賴氏法和丙酮酸氧化酶法為主，這2種方法由于檢測(cè)的重復(fù)性差，特別是對(duì)高值標(biāo)本的檢測(cè)存在嚴(yán)重的偏離現(xiàn)象，目前已基本淘汰[9-11]。與其他改良的微板速率法比較，本研究只需檢測(cè)2個(gè)點(diǎn)吸光度，操作更加簡(jiǎn)便[12]。

本研究微板速率法不同于連續(xù)監(jiān)測(cè)的速率法，是加入試劑后吸光度與反應(yīng)10 min后吸光度變化的2點(diǎn)速率，對(duì)該方法的深入研究結(jié)果表明，反應(yīng)時(shí)間影響檢測(cè)的重復(fù)性和線性范圍。在實(shí)際操作中，很難做到每批標(biāo)本的反應(yīng)時(shí)間完全一致，因此需在每塊微孔板上都設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算K值。本研究在儀器、試劑等條件下，10 min反應(yīng)時(shí)間的線性上限約300 U/L，超過300 U/L的結(jié)果檢測(cè)會(huì)偏低，應(yīng)當(dāng)稀釋后重新復(fù)查，不同實(shí)驗(yàn)室由于檢測(cè)體系不同，檢測(cè)的線性范圍可能存在差異。微板在大批量標(biāo)本檢測(cè)中具有一定的優(yōu)勢(shì)，對(duì)單個(gè)或少量標(biāo)本的檢測(cè)并不是理想的選擇。

綜上所述，本研究建立的微板速率法具有操作性強(qiáng)、結(jié)果穩(wěn)定可靠的優(yōu)點(diǎn)，與傳統(tǒng)生化分析儀法有較好的可比性。該方法可采用全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)使ALT與ELISA其他項(xiàng)目同時(shí)檢測(cè)，值得臨床推廣應(yīng)用。

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Study on microtiter plate kinetic method to detection ALT

GAOChaoxian1,ZHUYulan2,CHENYuting1,LILimei1,ZHANGWen1,LIUZhengyu1,YANGXueqin1,HUIChangye1△

(1.DepartmentofPathologyandToxicology,ShenzhenPreventionandTreatmentCenterforOccupationalDiseases,Shenzhen,Guangdong518020,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,ShenzhenInternationalTravelHealthcareCenter,Shenzhen,Guangdong518033,China)

Objective To investigate the clinical application of ALT detection based on microtiter plate kinetic method in the automatic enzyme immunoassay system.Methods By beference to the IFCC recommended kinetic method,microtiter plate kinetic method was established in the automatic enzyme immunoassay system of ALT detection.The linear,intro-batch and inter-batch duplicability of the method were evaluated.ALT test results of 823 samples with microtiter plate kinetic method and automatic biochemistry analyzer method were compared.Results Microtiter plate kinetic method had good linearity where ALT activity <303 U/L,the intra batch and inter batch variation coefficients < 1/5TEa.The detection results of the clinical samples were correlated with the biochemical analyzer.Conclusion Microtiter plate kinetic method to detection ALT in the automatic enzyme immunoassay system is an ideal method for simultaneous detection of ALT and ELISA in large batch samples,which is worth popularizing.

ALT; microtiter plate kinetic method; enzyme linked immunosorbent assay

高朝賢，男，主管技師，主要從事醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)研究?！?/p>

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.20.015

A

1673-4130(2016)20-2841-03

2016-05-11

2016-08-11)