左濤 趙樹堂 盧孟柱 孫愛東 王延偉 賀偉

(北京林業(yè)大學(xué)，北京，100083) (中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所) (北京林業(yè)大學(xué))

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楊樹二氫黃酮醇-4-還原酶基因(DFR)的克隆及反義表達(dá)對(duì)兒茶素合成的影響1)

左濤 趙樹堂 盧孟柱 孫愛東 王延偉 賀偉

(北京林業(yè)大學(xué)，北京，100083) (中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所) (北京林業(yè)大學(xué))

為了驗(yàn)證二氫黃酮醇-4-還原酶基因(DFR)在楊樹上的功能,明確DFR對(duì)抗病物質(zhì)兒茶素合成的影響,利用抗病基因防治樹木潰瘍病提供候選基因。以接種歐美楊細(xì)菌性潰瘍病菌后6 d的一年生中林46楊樹苗干的樹皮為材料, 利用RT-PCR技術(shù)克隆DFR基因的ORF序列, 并構(gòu)建DFR的反義表達(dá)載體anti-pBI121-DFR。 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤法轉(zhuǎn)化84K楊, 獲得了轉(zhuǎn)反義DFR基因的84K楊4株。 用高效液相色譜法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株葉片中的兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果顯示, 4株轉(zhuǎn)反義DFR株其內(nèi)源兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.97、2.4、1.6和0.87 ng/g, 與84K野生型植株中兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)(8.9 ng/g)相比顯著降低。上述結(jié)果表明DFR基因參與了楊樹類黃酮生物合成途徑,該基因與兒茶素的合成有關(guān)。

類黃酮；二氫黃酮醇-4-還原酶基因；反義表達(dá)載體；兒茶素

類黃酮(flavonoids)是一類重要的次生代謝物，廣泛存在于整個(gè)植物界中。其功能涉及多種生物過程，如抵御紫外線、防御病原體和害蟲、保持花粉活力、調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)?。二氫黃酮醇-4-還原酶(DFR)是類黃酮物質(zhì)形成步驟中的一個(gè)關(guān)鍵酶，可將二氫黃酮醇還原為無色花色素，而無色花色素是兒茶素合成的前體。作為類黃酮代謝下游途徑的酶，DFR對(duì)植物體內(nèi)兒茶素合成積累起到重要作用[1]。Stafford et al[2]利用粗酶液中的DFR將二氫黃酮醇轉(zhuǎn)變成無色花色素，后者進(jìn)一步在無色花色素還原酶(LAR)的催化下轉(zhuǎn)變成兒茶素。在對(duì)茶樹的研究中發(fā)現(xiàn)DFR/LAR兩步反應(yīng)是催化兒茶酸和兒茶素形成的關(guān)鍵步驟，而DFR是限速步驟[2-3]。研究表明，不同茶樹品種葉片發(fā)育過程中，DFR基因的表達(dá)量與總兒茶素積累量顯著相關(guān)[4]。對(duì)不同茶樹品種間與兒茶素合成相關(guān)的多種酶差異表達(dá)的結(jié)果顯示，只有DFR和LAR基因的表達(dá)量與茶樹總兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈一定的相關(guān)性[5]。體外測(cè)試兒茶素對(duì)草生歐文氏桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌的抑制效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兒茶素對(duì)3種細(xì)菌均具有較強(qiáng)的抑制作用[6]。

84K楊是銀白楊和腺毛楊(Populusalba×Populusglandulosa)雜種無性系，其抗逆性強(qiáng)、木材材質(zhì)好、苗期生長(zhǎng)迅速且容易生根，現(xiàn)已逐漸成為楊樹基因工程中較為理想的受體樹種。轉(zhuǎn)化OsNHX1抗鹽基因的研究表明，轉(zhuǎn)基因84K楊能在高鹽條件下正常生長(zhǎng)[7]。李科友等[8]將CryIAc和API雙價(jià)抗蟲基因?qū)?4K楊中，飼喂結(jié)果表明楊扇舟蛾幼蟲的死亡率高達(dá)60%～80%。在轉(zhuǎn)化抗寒基因PtFAD2和PtFAD3的研究中，轉(zhuǎn)基因84K楊能在低溫條件下保持較高的存活率[9]。

隨著基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)的快速發(fā)展，反義基因的轉(zhuǎn)化在植物的研究中取得了顯著進(jìn)展。有報(bào)道將反義基因ACS導(dǎo)入番茄中，成功抑制了ACC合成酶的活性，使蕃茄果實(shí)中乙烯的含量被抑制了99.5%[10]。將反義的3—羥基—黃烷酮基因?qū)肟的塑昂?，其轉(zhuǎn)基因植株花色逐漸變淡[11]。向毛白楊中轉(zhuǎn)入反義的抗壞血酸過氧化物酶基因后，其體內(nèi)的過氧化物積累量大幅升高，同時(shí)抗氧化物質(zhì)的含量均低于野生型對(duì)照[12]。研究結(jié)果表明，反義基因轉(zhuǎn)入植物后，會(huì)抑制相應(yīng)基因的表達(dá)，使植物的生理、表型等發(fā)生變化[11]。

歐美楊細(xì)菌性潰瘍病是2006年在河南濮陽、山東兗州等地的林地中觀察到的一種侵害歐美楊的新型病害，其病原菌為L(zhǎng)onsdaleaquercinasubsp.populi[13]，對(duì)多數(shù)歐美楊品種均能致病，包括目前生產(chǎn)上廣泛栽培的中林46楊(Populus×euramericanacv.‘Zhonglin 46’)和107楊(P.×euramericanacv.‘74/76’)。感病樹木受害后樹皮開裂，從裂縫中流出大量汁液，枝干局部皮層壞死，耗損樹木養(yǎng)分，嚴(yán)重影響到樹木的生長(zhǎng)，甚至引起楊樹整株死亡[14]。對(duì)于該楊樹病害，目前生產(chǎn)上尚無有效的防治方法。培育抗病品種是防治樹木細(xì)菌性病害最根本、有效的途徑之一，因而開展抗病相關(guān)基因的功能研究以加速林木抗病育種尤為重要。

在本課題組前期的研究中，發(fā)現(xiàn)中林46楊在受歐美楊潰瘍病病原細(xì)菌侵染后的前6天楊樹DFR基因表達(dá)上調(diào)[15]。這一結(jié)果表明DFR基因受到病原菌的誘導(dǎo)，且可能與抗病性有關(guān)，但其在抗病中的功能未經(jīng)驗(yàn)證。先前楊樹中的研究表明，DFR基因是兒茶素合成途徑的上游基因[16]。若能利用轉(zhuǎn)基因的方法，證明楊樹中DFR基因與兒茶素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有關(guān)，可為利用抗病基因進(jìn)行抗病分子育種提供候選基因。為此，本研究克隆了易感楊樹中林46楊DFR基因并構(gòu)建其反義表達(dá)載體，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)化84K楊，在驗(yàn)證反義的DFR基因插入到84K楊的基因組后，用HPLC法測(cè)定其相應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物兒茶素的量，確定反義轉(zhuǎn)基因植株的生理變化，為研究DFR基因在兒茶素合成中的功能提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

從107楊病樹組織中分離得到歐美楊細(xì)菌性潰瘍病致病菌株L.quercinaN-5-1，保存于北京林業(yè)大學(xué)森林病理實(shí)驗(yàn)室。采集生長(zhǎng)于河南濮陽的經(jīng)此潰瘍病菌菌株接種后第6天的一年生中林46楊樹樹干接種點(diǎn)的樹皮組織，共3株，每株取4個(gè)接種點(diǎn)，接種點(diǎn)距地面高度分別約為170、140、110、80 cm，樹皮大小為長(zhǎng)2 cm、寬1 cm，取下的樹皮用液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?4K楊組培苗由中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。pBI121質(zhì)粒和根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404由北京林業(yè)大學(xué)樹木生長(zhǎng)發(fā)育生化機(jī)理研究室提供。

1.1 RNA提取和cDNA合成

提取接種后第6天的中林46楊樹樹皮，采用RNA試劑盒改良法提取總RNA[17]。cDNA第一鏈合成按照Invitrogen公司生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒Superscript III Reverse Transcriptase合成cDNA的說明書進(jìn)行，RNA取2 μg，反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL。

1.2 DFR基因的克隆

根據(jù) Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.phytozome.net/)中公布的毛果楊二氫黃酮醇-4-還原酶基因(DFR)(登錄號(hào)：Potri.005G229500)序列，用特異引物[18]：

PrDFR-F：5’-GCGAGCTCGATGGGAACAGAAGCTGAAAC-3’

SacI

PrDFR-R：5’-GCGGATCCGTGGAACAATCAGGACGCAG-3’

BamHI

以中林46楊樹皮cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μL，包括Prime STAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，5×Prime STAR Buffer(Mg2+)10 μL，dNTP Mixture 4 μL，cDNA 1 μL(稀釋100倍)，上游、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 32.5 μL。DFR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；56 ℃退火30 s；72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后，取全部反應(yīng)產(chǎn)物于0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，并按照天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，將回收后的目的片段DFR與pGEM-T(Progema)載體進(jìn)行連接。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化由天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，在含100 mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑選陽性單克隆菌落振蕩培養(yǎng)至渾濁，將菌液做PCR擴(kuò)增鑒定陽性克隆后，送于上海英濰捷基生物公司測(cè)序。利用DNAMAN軟件對(duì)克隆得到的DFR基因序列和Phytozome中公布的毛果楊DFR基因序列進(jìn)行比對(duì)。

1.3 DFR反義序列載體構(gòu)建

用SacI和BamHI內(nèi)切酶酶切pBI121載體和pGEM-T載體上的DFR片段，將DFR片段和pBI121載體連接，16 ℃反應(yīng)12 h，構(gòu)建植物反義表達(dá)載體，并經(jīng)菌落PCR和測(cè)序鑒定。

1.4 植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌

先制備農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)[19]，用凍融法[20]將反義表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，在含有利福平50 mg/L、鏈霉素100 mg/L、卡那霉素50 mg/L的YEB培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)48 h，菌落PCR驗(yàn)證后，得到轉(zhuǎn)基因工程菌。

1.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的84K楊轉(zhuǎn)化及抗性植株的獲得

將組培4～5周的84K楊幼嫩葉片剪下并劃出傷口，在預(yù)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)12～16 h。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染84K楊葉片[21-22]，侵染后的植物葉盤暗培養(yǎng)3 d，之后將葉盤放入篩選培養(yǎng)基，用質(zhì)量濃度為200 mg/L的特美汀抑菌、50 mg/L的卡那霉素篩選，在25 ℃、光周期為15.5/8.5 h的組培室培養(yǎng)。25～30 d后分化出不定芽，待不定芽長(zhǎng)到2 cm左右時(shí)剪下不定芽，放入含有特美汀質(zhì)量濃度為200 mg/L、卡那霉素質(zhì)量濃度為50 mg/L的生根培養(yǎng)基中，在25 ℃、光周期為15.5/8.5 h的組培室中培養(yǎng)，直到不定芽長(zhǎng)出根，形成完整的抗性植株。

1.6 轉(zhuǎn)基因植株的普通PCR檢測(cè)

按照天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)植物基因組DNA提取試劑盒的說明書，對(duì)轉(zhuǎn)基因84K楊葉片的基因組DNA進(jìn)行提取，以CaMV 35S和目的片段設(shè)計(jì)引物(dfrF：5’-TGACGCACAATCCCACTATC-3’和dfrR：5’-GCAATCAATGCCACCAAGTC-3’)。

反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min；35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)體系為25 μL，包括模板1 μL，上游、下游引物各1 μL(10 μmol/L)，2×PCR Taq Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.7 轉(zhuǎn)基因植株的qRT-PCR檢測(cè)

分別提取轉(zhuǎn)基因和野生型84K楊葉片中的總RNA。以84K轉(zhuǎn)基因植株DFR的3’UTR和ORF序列設(shè)計(jì)引物，qRT-PCR引物(qDFRF：5’-GCAAAGAAAATGAAGTGGTCCC-3’和qDFRR：5’-GGCCATTAAGTGGGCAATAAT-3’)。

采用寶生物工程(大連)有限公司的SYBR Premix Ex Taq實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒進(jìn)行表達(dá)分析，以Ubiquitin作為內(nèi)參基因，熒光染料為SYBR Green I，以轉(zhuǎn)基因84K楊和野生型84K楊的cDNA為模板，檢測(cè)DFR的相對(duì)表達(dá)量變化。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系含SYBR Premix Ex Taq酶10 μL、ROX dyeII 0.4 μL、10 μmol/L的上、下游引物各0.4 μL、cDNA模板2 μL，用ddH2O補(bǔ)充體積至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性15 min、95 ℃變性10 s、60 ℃退火32 s并采集熒光數(shù)據(jù)，共45個(gè)循環(huán)。

1.8 HPLC法測(cè)量植株中兒茶素

用HPLC法測(cè)量樣品中的兒茶素[23]。稱取轉(zhuǎn)基因84K楊和野生型84K楊的干質(zhì)量葉片粉末100 mg，加入10 mL 70%的乙醇[24]，超聲破碎30 min，12 000 r/min離心2 min，取出上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60 ℃旋蒸后轉(zhuǎn)移到10 mL茶色容量瓶中，加入乙醇定容至刻度，然后搖勻，通過0.45 μm的微孔膜過濾后，備用，在色譜條件下進(jìn)行分離測(cè)定。用甲醇溶解兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，定容到10 mL的棕色容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為0.1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，通過0.45 μm的微孔膜過濾后，在色譜條件下進(jìn)行分離測(cè)定。色譜條件：檢測(cè)波長(zhǎng)λ=280 nm；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸[25]；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA的提取和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

利用RNA試劑盒改良法分離得到接種后第6天的中林46楊樹皮總RNA。電泳檢測(cè)結(jié)果表明得到的總RNA沒有發(fā)生降解，也沒有DNA和蛋白質(zhì)污染，質(zhì)量和純度較高。

2.2 DFR基因的擴(kuò)增及克隆

以提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，分別以PrDFR-F和PrDFR-R為引物，PCR擴(kuò)增得到DFR約1 000 bp左右的片段(圖1)，片段大小與引物設(shè)計(jì)的預(yù)期結(jié)果一致。

圖1 中林46楊DFR基因RT-PCR擴(kuò)增電泳圖

2.3 測(cè)序結(jié)果及序列分析

利用DNAMAN軟件對(duì)克隆得到的DFR基因序列，與Phytozome中公布的毛果楊DFR基因序列(Potri.005G229500)進(jìn)行比對(duì)(圖2)。中林46中的DFR基因(GenBank登錄號(hào)：KU508460)與毛果楊中的DFR基因具有98.31%的相似性，保守性較高。

圖2 克隆的中林46楊DFR基因與毛果楊DFR基因序列比對(duì)結(jié)果

2.4 反義表達(dá)載體的構(gòu)建

用SacI和BamHI雙酶切克隆載體和pBI121載體，用T4 DNA Ligase連接目的片段和酶切后的pBI121載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)后檢測(cè)陽性克隆(圖3)，并測(cè)序驗(yàn)證DFR序列正確插入pBI121載體CaMV 35S啟動(dòng)子的下游(圖4)，驗(yàn)證正確的反義表達(dá)載體，并命名為anti-pBI121-DFR。

圖3 DFR陽性克隆的菌落PCR

圖4 anti-pBI121-DFR表達(dá)載體簡(jiǎn)圖

2.5 轉(zhuǎn)基因植株的普通PCR檢測(cè)

農(nóng)桿菌侵染后的84K楊葉片在篩選培養(yǎng)基上篩選，將篩選得到的抗性植株置于生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根，從而得到完整的84K楊抗性苗。提取84K楊抗性植株的基因組DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到特異的擴(kuò)增片段，長(zhǎng)度為597 bp，與預(yù)期大小一致(圖5)?？梢猿醪阶C明DFR基因已整合到84K楊的基因組中。共檢測(cè)轉(zhuǎn)反義DFR基因的植株4株，得到陽性植株4株。

1-4.抗性植株；5.野生型植株。

2.6 轉(zhuǎn)基因植株的qRT-PCR分析

分別提取4株轉(zhuǎn)基因84K楊葉片和野生型84K楊葉片的總RNA，將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA作為模板進(jìn)行qRT-PCR的表達(dá)量分析，用2-ΔΔCT方法來進(jìn)行相對(duì)定量計(jì)算。結(jié)果顯示，反義表達(dá)載體anti-pBI121-DFR轉(zhuǎn)入84K楊后，與野生型相比，在4株轉(zhuǎn)基因植株中，84K楊的DFR基因表達(dá)量均顯著上調(diào)。表明，反義DFR基因并沒有對(duì)DFR基因的mRNA在轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行抑制。

2.7 轉(zhuǎn)基因植株中兒茶素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

HPLC條件為：從0～40 min，流動(dòng)相為10%，40 min以后流動(dòng)相為100%。流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量為2 μL，樣品進(jìn)樣量為10 μL(WT為對(duì)照組，TS為轉(zhuǎn)基因材料)。由圖6可知，兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品出峰的時(shí)間為9.6 min，而WT和TS在9.6 min時(shí)均有單峰(圖7、圖8)。標(biāo)準(zhǔn)品的峰高為540.4 mV·s-1，WT的峰高平均值為24.048 8 mV·s-1，TS的峰高平均值分別為2.632 01、6.582 68、4.524 62和2.359 85 mV·s-1。在轉(zhuǎn)反義DFR的84K楊植株中，其內(nèi)源兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.97、2.40、1.60、0.87 ng/g，與84K野生型植株中兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.9 ng/g相比，轉(zhuǎn)基因植株兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低，下降比例分別為89.10%、73.03%、82.02%、90.22%。用單因素方差分析和多重t檢驗(yàn)做多重比較可知(表1，表2)，4株轉(zhuǎn)基因植株中兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別與野生型植株中兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)相比，均呈顯著差異，說明反義DFR基因的導(dǎo)入阻礙了兒茶素的合成。

圖6 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC分析圖譜

圖7 84K野生型楊樹對(duì)兒茶素的檢測(cè)結(jié)果

方差來源自由度平方和均方F值p值因素4142.0235.418832.45×10-14誤差100.190.02總和14142.21

表2 多重t檢驗(yàn)

3 結(jié)論與討論

本研究用轉(zhuǎn)基因的方法驗(yàn)證了楊樹中DFR基因參與了楊樹類黃酮生物合成途徑，且該基因與兒茶素的合成有關(guān)。

反義基因技術(shù)作為一種遺傳改良的重要工具，已經(jīng)廣泛的應(yīng)用在植物基因工程中。反義基因可從復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯3個(gè)途徑調(diào)控基因的表達(dá)[26]。在本研究中，4株轉(zhuǎn)基因84K楊中DFR基因的表達(dá)量均未降低，而DFR調(diào)控的兒茶素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)則全部降低。推測(cè)反義基因的表達(dá)并未在轉(zhuǎn)錄后水平切割正義基因的mRNA。根據(jù)反義基因的調(diào)控原理，推測(cè)反義基因的導(dǎo)入可能抑制了正義基因的翻譯，即反義DFR與84K楊中特定的mRNA結(jié)合，從而抑制mRNA的翻譯。在后續(xù)研究中，可采用Western雜交的方法確定DFR在蛋白水平是否降低，以做進(jìn)一步研究。

值得注意的是，在先前轉(zhuǎn)DFR正義基因的毛白楊中顯示，DFR超量表達(dá)引起毛白楊花青素及原花色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高[27]。在煙草中，DFR正義轉(zhuǎn)基因煙草花瓣顏色明顯偏紅，而反義轉(zhuǎn)基因煙草中花瓣顏色趨于白色[28]。為了進(jìn)一步說明DFR基因?qū)翰杷睾铣傻挠绊?，在之后的研究中可考慮轉(zhuǎn)入正義的DFR基因，根據(jù)它在類黃酮合成途徑中的位置和產(chǎn)物，可能會(huì)使兒茶素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所升高和積累。而根據(jù)前人的研究結(jié)果可知，兒茶素在對(duì)病原物質(zhì)的防御和抵抗中也發(fā)揮著重要作用。在枯萎病菌侵染后棉苗組織中兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)也明顯升高，在抗病品種棉苗組織中，兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高[29]。研究顯示，棉花體內(nèi)的兒茶素可抑制枯萎病菌的菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢及孢子的萌發(fā)[30]。轉(zhuǎn)入正義的DFR基因后，84K楊可能增加對(duì)潰瘍病菌的抑制作用，從而可全面揭示DFR基因在抗病中的作用。

圖8 轉(zhuǎn)基因植株對(duì)兒茶素的檢測(cè)結(jié)果

植物中類黃酮的合成涉及多種調(diào)控過程，從合成途徑上看，有多種酶和基因參與其中。經(jīng)前人研究發(fā)現(xiàn)，茶樹存在DFR/LAR的酶促反應(yīng)，且兒茶素和沒食子酸兒茶素是DFR/LAR反應(yīng)的產(chǎn)物[1]。DFR和LAR兩步反應(yīng)是催化兒茶素形成的關(guān)鍵步驟，而DFR和LAR都處在合成途徑中的中下游，對(duì)兒茶素的合成有比較直接的作用，但兒茶素的前體物質(zhì)對(duì)相應(yīng)的基因和產(chǎn)物是否有影響還未知。所以，為了從更多前體物質(zhì)中了解其對(duì)兒茶素合成的影響，在今后的研究中，可選擇合成途徑中的上游基因，以便驗(yàn)證類黃酮合成途徑中更多相關(guān)基因的抗病性，從分子層面加速楊樹抗病性的研究與轉(zhuǎn)基因改造。

[1] 夏濤,高麗萍.類黃酮及茶兒茶素生物合成途徑及其調(diào)控研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,42(8)：2899-2908.

[2] STAFFORD H A, LESTER H H. Flavan-3-ol biosynthesis: the conversion of (L)-dihydromyricetin to its flavan--,4-diol(leucodelphinidin) and to (L)-gallocatechin by reductase extracted from tissue cultures ofGinkgobilobaandPseudotsugamenziesii[J]. Plant Physiological,1984,76(1)：184-186.

[3] PUNYASINPA, ABEEYSINGHE I S, KUMAR V, et al. Flavonoid biosynthesis in the tea plantCamelliasinensis: properties of enzymes of the prominent epicatechin and catechin pathways[J]. Archives of Biochemistry Biophysics,2004,431(1)：22-30.

[4] MAMATI G E, LIANG Y, LU J. Expression of basic genes involved in tea polyphenol synthesis in relation to accumulation of catechins and total tea polyphenols[J]. Journal Science of Food Agriculture,2006,86(3)：459-464.

[5] 馬春雷,喬小燕,陳亮.茶樹無色花色素還原酶基因克隆及表達(dá)分析[J].茶葉科學(xué),2010,30(1)：27-36.

[6] 孫昊,郝再彬.茶多酚中兒茶素的抑菌效果探究[J].湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào),2013,36(6)：62-65.

[7] 王樹耀,田宗城,王云,等.OsNHX1基因轉(zhuǎn)化84K楊的研究[J].湖南文理學(xué)院學(xué)報(bào),2005,17(1)：60-63.

[8] 李科友,樊軍鋒,趙忠,等.銀腺楊轉(zhuǎn)Cry I Ac和API雙價(jià)抗蟲基因的研究[J].林業(yè)科學(xué)研究,2007,20(5)：699-704.

[9] 周洲.轉(zhuǎn)脂肪酸去飽和酶基因PtFAD2和PtFAD3銀腺楊84K的抗寒性研究[D].北京：中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院,2007.

[10] OELLER P W, LU M W, TANLOR M L, et al. Reversible inhibition of tomoto fruit senescence by antisense RNA[J]. Science,1991,254：437-439.

[11] ZUKER A, TZFIRA T, BEN-MEIR H, et al. Modification of flower color and fragrance by antisense suppression of the flavanone 3-hydroxylase gene[J]. Molecular Breeding,2002,9(1)：33-41.

[12] 申曉潔.轉(zhuǎn)反義APX基因楊樹的獲得及其抗逆性研究[D].濟(jì)南：山東師范大學(xué),2015.

[13] LI Y, HE W, REN F J, et al. A canker disease ofPopulus×euramericanain China caused byLonsdaleaquercinasubsp.populi[J]. Plant Disease,2014,98(3)：368-378.

[14] 郭利民,常聚普,賀偉,等.歐美楊潰瘍病田間發(fā)生規(guī)律研究初報(bào)[J].林業(yè)實(shí)用技術(shù),2012(10)：38-40.

[15] HOU J, WU Q M, ZUO T, et al. Genome-wide transcriptomic profiles reveal multiple regulatory responses of poplar to Lonsdalea quercina infection[J]. Trees Structure and Function,2016,30(1):1-14.

[16] MIRANDA M, RALPH S G, MELLWAY R, et al. The Transcriptional response of hybrid poplar (Populustrichocarpa×P.deltoids) to infection by Melampsora medusae leaf rust involves induction of flavonoid pathway genes leading to the accumulation of proanthocyanidins[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions,2007,20：816-831.

[17] 侯佳,孫豐碩,吳秋明,等.一種高效提取楊樹發(fā)病樹皮總RNA的方法及應(yīng)用[J].植物生理學(xué)報(bào),2014,50(2)：223-228.

[18] HUANG Y, GOU J Q, JIA Z H, et al. Molecular cloning and characterization of two genes encodinDihydroflavonol-4-Reductasefrom Populus trichocarpa[J]. PLoS One,2012,7(2)：1-8.

[19] 朱錦,權(quán)軍利,何玉科.根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備以及質(zhì)粒ProkⅡ?qū)ζ滢D(zhuǎn)化的研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2006,34(7)：91-95.

[20] RHODES C A, PIERCE D A, METLLER I J. Genetically transformed maize plants from protoplasts[J]. Science,1988,240：204-207.

[21] BEVAN M W, FLAVELL R B, CHILTON M D. A chimaeric antibiotic resistance gene as a selectable marker for plant cell transformation[J]. Biotechnology,1992,24:184-187.

[22] HORSCH R B. Asimple and general method for transferring genes into plant[J]. Science,1985,227：1229-1231.

[23] HU B, WANG L, ZHOU B, et al. Efficient procedure for isolating methylated catechins from green tea and effective simultaneous analysis of ten catechins, three purine alkaloids, and gallic acid in tea by highperformance liquid chromatography with diode array detection[J]. Journal of Chromatography A,2009,1216(15)：3223-3231.

[24] 姚姝鳳,唐克華,劉小攀.多花勾兒茶中兒茶素的提取分離與HPLC測(cè)定[J].吉首大學(xué)學(xué)報(bào),2015,36(3)：82-93.

[25] 張戎睿,王舒雅,王富濟(jì),等.HPLC法同時(shí)檢測(cè)茶葉中八種兒茶素[J].黑龍江醫(yī)藥,2011,24(5)：681-683.

[26] 李祥,易自立,蔡能,等.反義RNA及其在植物基因工程領(lǐng)域的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通訊,2003,14(2)：162-164.

[27] 孫一銘.PtrDFR基因的克隆與其在毛白楊中功能鑒定研究[D].重慶：西南大學(xué),2011.

[28] 宋鋒.毛白楊二氫黃酮醇-4-還原酶(DFR)基因在煙草中的功能驗(yàn)證[D].重慶：西南大學(xué),2010.

[29] 宋鳳鳴,鄭重,童賢明,等.兒茶素對(duì)棉枯萎病菌胞壁降解酶的抑制及在棉花抗病性中的作用[J].真菌學(xué)報(bào),1996,15(4)：297-303.

[30] 宋鳳鳴,鄭重,葛秀春,等.兒茶素在棉苗對(duì)枯萎病抗性中的作用[J].植物病理學(xué)報(bào),1998,28(2)：139-143.

Cloning Dihydroflavonol-4-Reductase Gene (DFR) of Poplar and Its Antisense Expression Effects on Catechin Synthesis//

Zuo Tao

(Beijing Forestry University, Beijing 100083, P. R. China);

Zhao Shutang, Lu Mengzhu

(Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry);

Sun Aidong, Wang Yanwei, He Wei

(Beijing Forestry University)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(10)：49-55.

The experiment was conducted to verify the function of Dihydro flavonol-4-reductase gene (DFR), and analyze the influence on the synthesis of disease-resistant substances catechins for the use of resistance genes resistant canker providing candidate genes. Total RNA was isolated from the infected bark ofPopulus×euramericana‘Zhonglin 46’ after inoculating 6 days withLonsdaleaquercinasubsp.populi. A specificDFRfragment of the expected size was amplified by RT-PCR and sequenced, and then successfully constructed into an expression vector with antisense-orientation driven by CaMV 35S promoter (anti-pBI121-DFR). Subsequently, anti-pBI121-DFRwas transformed intoPopulusalba×P.glandulosausingAgrobacteriumtumefaciensmediated method. Four transgenic lines was finally obtained and confirmed by PCR. High performance liquid chromatography (HPLC) was further used to detect catechin in transgenic plants and wild type plants. The contents of catechin in transgenic plants were 0.97, 2.4, 1.6, and 0.87 ng/g, respectively, significantly lower than that of wild type plants (8.9 ng/g). Therefore, DFR ofPopulus×euramericana‘Zhonglin 46’ was involved in flavonoids biosynthesis pathway, and associated with the synthesis of catechin.

Flavonoids； Dihydroflavonol-4-reductase gene； Antisense expression vector； Catechin

1)國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31470668、31200511、J1103516)；國(guó)家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201104054)。

左濤，女，1989年2月生，北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，碩士研究生。E-mail:zuotaot@126.com。

王延偉，北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，副教授。E-mail:wangyanw321@126.com。

2016年3月20日。

S722.3+6

責(zé)任編輯：潘 華。