魏曉愛 姚文靜 姜廷波 周博如

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

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擬南芥WRKY基因家族應(yīng)答非生物脅迫基因的鑒定1)

魏曉愛 姚文靜 姜廷波 周博如

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)答各種脅迫反應(yīng)過程中起重要作用。為篩選和鑒定植物抗逆關(guān)鍵基因，以擬南芥(Arabidopsisthaliana)WRKY家族基因?yàn)檠芯繉?duì)象，從數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到72個(gè)擬南芥WRKY基因，通過生物信息學(xué)分析，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可將其分為3大類：GroupI、GroupII和GroupIII。其中，GroupII又可分為5個(gè)亞類：IIa、IIb、IIc、IId和IIe。用實(shí)時(shí)定量RT-PCR篩選出30個(gè)應(yīng)答鹽脅迫的基因，其中上調(diào)表達(dá)的23個(gè)，下調(diào)表達(dá)的7個(gè)。

擬南芥；WRKY轉(zhuǎn)錄因子；非生物脅迫

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子[1]，1994年Ishiguro et al[2]從甘薯中克隆得到第一個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子SPF1，隨后相繼在野燕麥、擬南芥、煙草(NicotianatabacumL.)和水稻(OryzasativaL.)中克隆得到WRKY。最新研究表明:在原生生物、粘菌及綠藻中也有WRKY轉(zhuǎn)錄因子的存在,高等植物的WRKY基因源于早期的真核生物，并在進(jìn)化過程中經(jīng)歷的多次加倍和擴(kuò)張[3]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子具有1～2個(gè)包含標(biāo)志性WRKYGQK肽段的WRKY結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由大約60個(gè)高度保守的氨基酸殘基組成，能夠與DNA序列中W-box結(jié)合，在WRKY結(jié)構(gòu)域C末端還具有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)(CX4-5CX22-23HX1H型或CX7CX23HX1C型)，是決定WRKY蛋白是否能夠和相關(guān)基因順式作用元件W-box(TTGACT/C)結(jié)合的關(guān)鍵因素[4-5]。數(shù)量龐大的WRKY基因家族在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、物質(zhì)代謝和響應(yīng)各種逆境脅迫的應(yīng)答中具有重要作用[6]，目前在擬南芥中發(fā)現(xiàn)72個(gè)，水稻中105個(gè)，玉米(ZeamaysL.)119個(gè)，楊樹(Populus)104個(gè)，油菜(BrassicacampestrisL.)46個(gè)，胡蘿卜(DaucuscarotaL.)中有95個(gè)WRKY基因[7-11]。目前,人們主要基于轉(zhuǎn)錄組分析、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Northern雜交等技術(shù)分析WRKY基因在非生物脅迫下的表達(dá)模式，并初步預(yù)測(cè)WRKY基因的相關(guān)功能，有的WRKY基因通過進(jìn)一步的遺傳轉(zhuǎn)化驗(yàn)證了其在調(diào)控植物免疫反應(yīng)應(yīng)答中的具體功能[12]，現(xiàn)在普遍認(rèn)為植物耐鹽性是多種抗鹽生理性狀的綜合表現(xiàn)，由位于不同染色體上多個(gè)基因控制的數(shù)量性狀[13]。本研究以72個(gè)擬南芥WRKY基因?yàn)檠芯繉?duì)象，分析其在NaCl脅迫24 h下的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究WRKY轉(zhuǎn)錄因子的功能提供參考。

1 試驗(yàn)材料

本研究所用擬南芥(Arabidopsisthaliana)為Col-0(Columbia-0)。首先4 ℃春化2～3 d，播種于人工混合土中(V(黑土)∶V(蛭石)∶V(珍珠巖)=5∶3∶2，并121 ℃高溫滅菌40 min)，補(bǔ)足水分并蓋上保鮮膜，置于正常植物光照培養(yǎng)室培養(yǎng)，設(shè)置光照16 h，黑暗8 h，光照強(qiáng)度2 500～5 000 lx，溫度22～24 ℃，濕度為70%，3～4 d后揭下保鮮膜，確保水分供應(yīng)充足。將4周左右的擬南芥幼苗用150 mmol/L的NaCl處理24 h，用水處理作對(duì)照，采集葉片,用于RNA提取或于冰箱中-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 試驗(yàn)方法

2.1 RNA的提取

用柱式植物RNAout(TIANDZ Corp,Beijing,China)試劑盒法提取擬南芥總RNA，具體步驟參照附帶的說明書，用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000c的分光光度計(jì)(NanoDrop Technologies,WilmingtonDE,USA)檢測(cè)總RNA的質(zhì)量與濃度，用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa Corp.,Dalian,China)合成cDNA，稀釋5倍作為RT-qPCR的模板，用于檢測(cè)基因的表達(dá)水平。

2.2 應(yīng)答鹽脅迫基因的篩選

從PlantTFDB數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得72個(gè)擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因信息，用RT-qPCR分析其在150 mmol/L NaCl處理24 h的表達(dá)情況。實(shí)時(shí)定量PCR在7500 real-time PCR system(Applied Biosystems)上進(jìn)行，以ACT作為內(nèi)參[14]。RT-qPCR的20 μL體系包含10 μL的SYBR Premix Ex Taq II(TaKaRa)，0.4 μL的ROX ReferenceDye II(TaKaRa)，正向引物(10 μmol/L)和反向引物(10 μmol/L)各0.8 μL(引物終濃度為0.4 μmol/L)，2 μL的cDNA模板(100 ng以下)和6 μL的無(wú)菌水。RT-qPCR的反應(yīng)程序如下：預(yù)變性(95 ℃ 30 s)，變性(95 ℃ 5 s)，退火(60 ℃ 34 s)，25個(gè)循環(huán)，然后進(jìn)行熔解曲線分析[15]。用-ΔΔCt值來計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)水平[14]，用F值(2-ΔΔCt)來計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

2.3 生物信息學(xué)分析

利用NCBI在線搜索程序確定擬南芥轉(zhuǎn)錄因子家族基因的開放閱讀框(ORF)[16]，預(yù)測(cè)編碼的氨基酸序列及蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)；用MEGA6.0來繪制鄰接(Neighbor-joining，N-J)系統(tǒng)進(jìn)化樹[17];用NCBI的Conserved Domains(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)程序預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。

3 結(jié)果與分析

3.1 擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA6.0構(gòu)建擬南芥72個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹，可將其分成3大類：12個(gè)屬于GroupI，45個(gè)屬于GroupII，14個(gè)屬于GroupIII，還有一個(gè)獨(dú)立的基因AtWRKY59。其中，GroupII又可分為5個(gè)亞類：IIa、IIb、IIc、IId和IIe，分別包含8、8、14、7、8個(gè)基因(圖1，表1)。WRKY家族蛋白最重要的特征是具有高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域。用Conserved Domains程序分析擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白的氨基酸序列，表明WRKY結(jié)構(gòu)域在WRKY家族蛋白中高度保守，但其結(jié)構(gòu)域數(shù)量在不同類型中有所不同，有些WRKY蛋白還有不同的鋅指結(jié)構(gòu)，有的是C2H2(CX4-5CX22-23HXH)型，有的是C2HC(CX7CX23HXC)型。結(jié)構(gòu)域的數(shù)量及類型和鋅指結(jié)構(gòu)類型是WRKY家族蛋白分類的重要依據(jù)。GroupI中的轉(zhuǎn)錄因子含有兩個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，GroupII中的轉(zhuǎn)錄因子含有一個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，GroupIII中的轉(zhuǎn)錄因子含有一個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和C2HC型鋅指結(jié)構(gòu)。

圖1 擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白的進(jìn)化樹

3.2 擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

不同WRKY蛋白的氨基酸數(shù)目變化明顯，理化性質(zhì)不同，分子質(zhì)量范圍在12.95～200.00 ku，理論等電點(diǎn)的范圍在4.01～10.41，并且不同酸堿性蛋白在不同類別中的分布差異較大。在GroupI的12個(gè)蛋白中有7個(gè)屬于堿性，3個(gè)酸性，2個(gè)中性。在GroupIIa的8個(gè)蛋白中有5個(gè)屬于堿性，3個(gè)酸性。在GroupIIb的8個(gè)蛋白中有1個(gè)屬于堿性，3個(gè)酸性，4個(gè)中性。在GroupIIc的14個(gè)蛋白中有11個(gè)屬于堿性，2個(gè)酸性，1個(gè)中性。GroupIId的7個(gè)蛋白均屬堿性。在GroupIIe的8個(gè)蛋白中有1個(gè)屬于堿性，6個(gè)酸性，1個(gè)中性。在GroupIII的14個(gè)蛋白中有2個(gè)屬于堿性，12個(gè)酸性。不同類型WRKY蛋白間的差異可能與其具有不同的生物功能和參與的不同生理過程密切相關(guān)(表1)。

表1 擬南芥WRKY家族蛋白理化性質(zhì)和相對(duì)表達(dá)量

3.3 擬南芥應(yīng)答鹽脅迫WRKY基因的篩選

用實(shí)時(shí)定量RT-qPCR檢測(cè)NaCl脅迫24 h擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)模式，將基因相對(duì)表達(dá)量大于2倍定義為上調(diào)表達(dá)，小于0.5倍定義為下調(diào)表達(dá)，介于上述兩者之間的定義為沒發(fā)生明顯變化。結(jié)果表明：在72個(gè)基因中有30個(gè)(40.5%)鹽脅迫應(yīng)答基因，23個(gè)為上調(diào)表達(dá)基因，7個(gè)為基因下調(diào)表達(dá)。結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)表達(dá)基因有4個(gè)分布在GroupI，14個(gè)分布在GroupII(GroupIIa中2個(gè)，GroupIIb中3個(gè)，GroupIIc中8個(gè)，GroupIIe中1個(gè))，4個(gè)分布在GroupIII，1個(gè)單獨(dú)存在。而7個(gè)下調(diào)表達(dá)的基因中有1個(gè)分布在GroupIIb，1個(gè)分布GroupIId，2個(gè)分布在GroupIIe，3個(gè)分布在GroupIII(表1)?？梢姡险{(diào)表達(dá)的基因在GroupIIc中比例最高，占57.1%；其次是GroupIIb，占37.5%。下調(diào)表達(dá)的基因在GroupIIe和GroupIII中比例較高，分別占25%和21.4%(表2)。

表2 應(yīng)答鹽脅迫WRKY基因在不同組中的分布

3.4 應(yīng)答鹽脅迫基因與其編碼蛋白酸堿性的關(guān)系

擬南芥72個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子等電點(diǎn)范圍在4.01～10.41，而30個(gè)應(yīng)答鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄因子等電點(diǎn)范圍在4.68～10.30(表3)。在23上調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子中有19個(gè)等電點(diǎn)的范圍在5.89～8.47，占總數(shù)的82.6%。在7個(gè)下調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子中有3個(gè)等電點(diǎn)在5.12～5.47，有2個(gè)等電點(diǎn)分別為6.36和7.03?？梢姡邴}脅迫條件下，上調(diào)表達(dá)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因編碼蛋白的pH值多在5.89～8.47，多數(shù)屬中性蛋白；上調(diào)表達(dá)基因編碼蛋白的pH值多在5.12～7.03，多數(shù)屬酸性蛋白。

表3 應(yīng)答鹽脅迫WRKY蛋白的酸堿性及分布

4 結(jié)論與討論

植物在逆境條件下，其體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列的生理生化變化以適應(yīng)逆境，一些抗逆相關(guān)基因也會(huì)大量表達(dá)，以感應(yīng)傳導(dǎo)逆境脅迫的信號(hào)和適應(yīng)脅迫環(huán)境，如蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子蛋白和抗逆相關(guān)蛋白等[18-20]，WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因在植物響應(yīng)逆境脅迫和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著非常重要的調(diào)控作用[21]。本研究為了解擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)及其與應(yīng)答鹽脅迫的關(guān)系，對(duì)72個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，根據(jù)其WRKY結(jié)構(gòu)域數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分為3大類GroupI、GroupII和GroupIII，其中GroupII又可分為IIa、IIb、IIc、IId和IIe 5個(gè)亞類；WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物中廣泛參與抗病反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成等過程[22-26]。不同擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白的理化性質(zhì)差異很大，其氨基酸數(shù)目在109～1 798，分子質(zhì)量在12.95～200.00 ku，理論等電點(diǎn)介于4.01～10.41。這是不同擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子具有不同生物功能的分子基礎(chǔ)，預(yù)示著WRKY基因可能參與不同的生理過程。在72個(gè)擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因中，有42個(gè)基因?qū)}脅迫反應(yīng)不明顯，在30個(gè)應(yīng)答鹽脅迫的基因中有23個(gè)上調(diào)表達(dá)基因，7個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。

目前，有關(guān)WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因提高植物抗逆能力的研究較多，但主要集中在抗病反應(yīng)上。Dong et al[27]研究72個(gè)擬南芥的WRKY轉(zhuǎn)錄因子與抗病的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)有49個(gè)受病原菌Pseudomonas syringae pvtomato(Pst)和SA誘導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)抗病基因的表達(dá)。如擬南芥過量表AtWRKY70基因會(huì)增加其對(duì)Pst的抗性，反之，如果抑制AtWRKY70的表達(dá)，就會(huì)增加擬南芥對(duì)E.c.carotovora的敏感性[28]。擬南芥中的AtWRKY38、AtWRKY62、AtWRKY11、AtWRKY17對(duì)病原菌抗性具有負(fù)調(diào)控作用，插入突變沉默這些基因的擬南芥對(duì)病原菌的抗性增強(qiáng)，而過量表達(dá)AtWRKY38、AtWRKY62擬南芥對(duì)病原菌的抗性減弱[29]。歐美雜交楊Pnd-WRKY3基因在銹菌侵染后表現(xiàn)出抗病反應(yīng)[30]。

植物WRKY基因廣泛參與植物的鹽脅迫。用150 mM NaCl處理擬南芥根系，有18個(gè)AtWRKY基因被誘導(dǎo)表達(dá)[31]。干旱和NaCl處理使擬南芥AtWRKY25和AtWRKY33的表達(dá)量提高，并且AtWRKY33缺失突變體和AtWRKY25、AtWRKY33雙缺失突變體會(huì)增加植株對(duì)NaCl脅迫的敏感性，而超表達(dá)其中任何一個(gè)基因則會(huì)提高對(duì)NaCl脅迫的抗性[32]。NaCl脅迫可強(qiáng)烈誘導(dǎo)TcWRKY53的表達(dá)[33]。小麥TaWRKY10通過調(diào)節(jié)滲透平衡，活性氧清除和逆境相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄在鹽脅迫的過程中起作用[34]。過表達(dá)GmWRKY5的轉(zhuǎn)基因擬南芥可通過轉(zhuǎn)錄因子STZ/Zat10的調(diào)控增強(qiáng)耐鹽性，但過表達(dá)GmWRKY13的轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)鹽脅迫的敏感性提高[21]。在煙草中過表達(dá)棉花GhWRKY39-1可提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)鹽脅迫的耐性[35]。胡蘿卜DcWRKY27和DcWRKY30基因可響應(yīng)鹽脅迫[11]。本研究對(duì)擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并利用RT-qPCR篩選出30個(gè)應(yīng)答鹽脅迫的基因，可為進(jìn)一步分析這些基因的功能提供參考依據(jù)。

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[34] WANG C, DENG P Y, CHEN L L, et al. A wheat WRKY transcription factor TaWRKY10 confers tolerance to multiple abiotic stresses in transgenic tobacco[J]. PloS ONE,2013,8(6):e65120.

[35] SHI W N, HAO L L, LI J, et al. The Gossypium hirsutum WRKY gene GhWRKY39-1 promotes pathogen infection defense responses and mediates salt stress tolerance in transgenicNicotianabenthamiana[J]. Plant Cell Reports，2014,33(3):483-498.

Identification ofWRKYGene in Response to Abiotic Stress from WRKY Transcription Factor Gene Family ofArabidopsisthaliana//

Wei Xiaoai, Yao Wenjing, Jiang Tingbo, Zhou Boru

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(10)：45-48,55.

For screening and identifying stress-related genes inArabidopsisthaliana, theWRKYgene families were as study object, and 72WRKYgenes were explored from the database ofA.thaliana, and the structure characteristics were analyzed by bioinformatics. WRKY family was further divided into three groups: GroupI， GroupII and GroupIII. The gene members in GroupII were further divided into five sub-groups: IIa, IIb, IIc, IId, IIe. The differential expression of WRKY genes were determined by real-time RT-PCR. There were 30 genes response to salt stress, of which 23 were up-regulated genes, and 7 were down-regulated genes.

Arabidopsisthaliana; WRKY transcription factor; Abiotic stress

魏曉愛，女，1990年2月生，林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，碩士研究生。E-mail：15244689083@163.com。

周博如，林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，副教授。E-mail:boruzhou@yahoo.com。

2016年2月19日。

Q78;S332.1

1)卓越農(nóng)林人才教育培養(yǎng)計(jì)劃改革試點(diǎn)項(xiàng)目。

責(zé)任編輯：潘 華。