程 瑤，金玉玲， 秦麗紅，王 辰，劉 蕾

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科，黑龍江 佳木斯 154003)

?

鋰—匹魯卡品致癇大鼠海馬神經(jīng)元的Caspase-3的變化及靈芝酸的干預(yù)①

程 瑤，金玉玲， 秦麗紅，王 辰，劉 蕾

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：觀察靈芝酸對(duì)氯化鋰-匹魯卡品致癇鼠海馬神經(jīng)元Caspase-3蛋白的表達(dá)情況，探討靈芝酸是否具有抗癇作用及機(jī)制。方法：選取雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為4組(n=15)，A組：生理鹽水對(duì)照組，B組：癲癇模型組，C組：靈芝酸干預(yù)組，D組：二甲基亞砜(DMSO)對(duì)照組。每組給予相應(yīng)藥后，對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)觀察、HE染色法檢測(cè)海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，免疫組化法檢測(cè)各組大鼠海馬區(qū)Caspase-3蛋白表達(dá)。結(jié)果：與A組相比，B、C、D組Caspase-3的表達(dá)量相對(duì)較高(P<0.01)；靈芝酸干預(yù)后，C、D組Caspase-3的表達(dá)量明顯低于B組表達(dá)(P < 0.05)。結(jié)論：靈芝酸可通過影響 Caspase-3 的表達(dá)量抑制凋亡的發(fā)生，對(duì)癲癇大鼠海馬神經(jīng)元起到保護(hù)作用。

靈芝酸；癲癇；Caspase-3

癲癇是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂性疾病，主要是由于大腦一過性放電引起的發(fā)作性意識(shí)喪失[1，2]，海馬、大腦皮質(zhì)等邊緣神經(jīng)元的損傷是其病理基礎(chǔ)。靈芝酸是由Kubota[3]在上世紀(jì)80年代首次從靈芝中分離并提純，并具有多樣性生物學(xué)活性，在臨床上可以防治多種疾病。目前靈芝酸干預(yù)癲癇疾病方面研究的相關(guān)報(bào)道少見。本實(shí)驗(yàn)主要通過向致癇大鼠腹腔注射靈芝酸干預(yù)后，觀察大鼠海馬區(qū)表達(dá)的Caspase-3蛋白，通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果推測(cè)靈芝酸對(duì)癲癇保護(hù)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SD大鼠來(lái)源佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；靈芝酸購(gòu)買于大連美侖生物技術(shù)有限公司；免疫組化試劑盒、DAB顯色劑(武漢博士德公司)；Caspase-3抗體(美國(guó)Santa Cruz生物技術(shù)公司)；BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟生物科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與給藥

60只體重(180±20)g健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分為4組(n=15)，A組：生理鹽水對(duì)照組，腹腔注射生理鹽水(與氯化鋰等量)，20h后腹腔注射生理鹽水(與靈芝酸等量)，30min后腹腔注射生理鹽水(與硫酸阿托品等量)，30min后腹腔注射生理鹽水(與匹魯卡品等量)。B：癲癇模型組，氯化鋰(3mmol/kg)腹腔注射，20h后予以與靈芝酸等量的生理鹽水腹腔注射，60min后予以匹魯卡品(80mg/kg)腹腔注射，C：靈芝酸干預(yù)組，腹腔注射氯化鋰(3mmol/kg)，20h后予以靈芝酸(10mg/kg)腹腔注射，60min后予以匹魯卡品(80mg/kg)腹腔注射； D組：二甲基亞砜(DMSO)對(duì)照組，首先予以氯化鋰(3mmol/kg)腹腔注射，20h后予以靈芝酸(10mg/kg)腹腔注射，60min后予以匹魯卡品(30mg/kg)腹腔注射。靈芝酸注射前60min予以腹腔注射DMSO(0.5mg/kg)。為了對(duì)抗匹魯卡品導(dǎo)致的外周膽堿能反應(yīng)，除A組外其他各組在匹魯卡品腹腔注射前30min均給予皮下注射硫酸阿托品(1mg/kg)。

造模成功標(biāo)準(zhǔn)：大鼠在注射匹魯卡品后如出現(xiàn)Ⅳ級(jí)以上發(fā)作同時(shí)伴有全身性驚厥者持續(xù)30min以上。癲癇發(fā)作1h后腹腔注射10%水合氯醛(350mg/kg)終止發(fā)作。取材時(shí)間為癲癇發(fā)作終止后6h。

1.2.2 海馬組織病理學(xué)觀察

(1)HE染色：取海馬組織蠟塊標(biāo)本切片經(jīng)常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、蘇木素-伊紅染色，高倍鏡視野觀察(隨機(jī)選取5個(gè))。(2) 免疫組織化學(xué)染色：海馬組織蠟塊標(biāo)本切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水、抗原熱修復(fù)處理后滴加5%BSA封閉液，在37℃環(huán)境下，孵育20min，在4℃環(huán)境下加入Caspase-3一抗過夜，于第二天加入二抗、SABC、DAB顯色劑，蘇木素輕度復(fù)染，陰性對(duì)照用PBS代替一抗。觀察海馬神經(jīng)細(xì)胞中Caspase-3蛋白于光鏡下。隨機(jī)從每個(gè)標(biāo)本中取3張切片，后隨機(jī)取5個(gè)不重復(fù)的視野于每張切片中，分別記數(shù)染色的陽(yáng)性細(xì)胞，標(biāo)本結(jié)果以這3張切片陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的平均值表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以每組5例樣本觀察結(jié)果的平均值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)觀察

癲癇發(fā)作情況基本均達(dá)到Ⅳ～V級(jí)。表現(xiàn)為四肢及面部震攣，節(jié)律性點(diǎn)頭、甩尾，繼之全身強(qiáng)直陣攣抽搐或站立不能和跌倒，實(shí)驗(yàn)過程中死亡大鼠15只，隨機(jī)替換補(bǔ)充。

2.2 HE染色結(jié)果

可見A組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)正常，分布呈多層樣，排列緊密，胞體呈圓形或橢圓形，細(xì)胞樹突稠密；B組大鼠海馬CA1區(qū)及CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目較A組明顯減少，核固縮，排列紊亂，胞體變小甚至破裂。B組海馬神經(jīng)元損傷程度較C、D組重。見圖1。

圖1 海馬CA1區(qū)神經(jīng)元(HE，200×)

2.3 免疫組化結(jié)果

在胞漿中有蛋白的表達(dá)，很少量的表達(dá)在胞膜與胞核。A組胞漿中可見很少量的棕黃色顆粒(圖2)。由表1可見，其余三組中Caspase-3的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著多于A組，胞核中偶見棕黃色顆粒，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。C組、D組中兩種蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯比B組減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C組中蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)雖少于D組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 海馬CA1區(qū)Caspase-3蛋白(SABC，200×)

組別Caspase-3A組(NS)23.51±1.19B組(Pilo+NS)56.98±4.99#C組(Pilo+靈芝酸)28.40±2.29#*D組(Pilo+DMSO+靈芝酸)35.29±4.87#*

注：#B、C、D組與A組相比P<0.01；*C、D組與B組相比P<0.05。

3 討論

現(xiàn)如今，醫(yī)學(xué)界對(duì)癲癇患者給予越來(lái)越多的關(guān)注，進(jìn)行相關(guān)的評(píng)價(jià)，制定相應(yīng)治療方案，對(duì)于提高癲癇患者生活質(zhì)量具有重要意義。近年的研究認(rèn)為，Caspase家族的激活在癲癇后神經(jīng)元的損傷中發(fā)揮重要作用，同時(shí)其蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)又參與復(fù)雜的凋亡過程。Caspase-3就是直接介導(dǎo)凋亡的效應(yīng)者之一。Caspase-3就是直接介導(dǎo)凋亡的效應(yīng)者之一。觀測(cè)致癇鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，其損傷的神經(jīng)元細(xì)胞具有典型的凋亡特征，而Caspase-3的活化又與這種凋亡關(guān)系密切，其抑制劑可以減輕這種損傷[4～6]。本實(shí)驗(yàn)中我們所應(yīng)用的靈芝酸是靈芝中一種具有生物活性的三萜類物質(zhì)[7]，此物質(zhì)具有鎮(zhèn)靜、止痛、抗腫瘤、抑制炎癥反應(yīng)、保肝護(hù)肝和抗衰老、調(diào)節(jié)人體糖代謝等作用[8～13]，對(duì)海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用是通過降低致癇鼠海馬神經(jīng)元中ERK1/2的磷酸化水平達(dá)到目的[14]。本實(shí)驗(yàn)中鋰-匹魯卡品導(dǎo)致的大鼠癲癇后Caspase-3蛋白表達(dá)量增高，而在給予靈芝酸后，可明顯減低此蛋白的表達(dá)量，說明此藥物能夠抑制Caspase-3介導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，改善癲癇灶微環(huán)境，為臨床改善癲癇發(fā)作提供了實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)，也為抗癲癇藥物的研究提供了新的方向。

[1]IE Leppik.Wanted：a global campaign against epilepsy [J].The Lancet，2012，380(9848)：1121

[2]Nadler JV.The recurrent mossy fiber pathway of the epileptic brain[J].Neurochem Res，2003，28(11)：1649-1658

[3]Kubota T,Asaka Y,Miura I,et a1.Structures of ganoderic acid A and B,two lanostane type bitter triterpenes from Ganoderma lucidum (Fr.) Karst[J].Helv Chim Acta，1982，65(2)：611-619

[4]郭小明.Caspase-3與癲癇神經(jīng)元損傷[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2004，5：34-35

[5]NA Thornberry.Y Lazebnik Caspases:Enemies Within [J].Science,1998,281(5381):1312-1316

[6]Zhang Lx.Apotosis of hippocampal neurons after amygdala kindled seizures [J].Brain Res Mol Brain Res，1998，55(2)：198-208

[7]蔣麗，黃遠(yuǎn)英，殷光玲.靈芝孢子油免疫調(diào)節(jié)作用的研究[J].現(xiàn)代食品科技，2013，29(3)：531-533

[8]王淑秋，邸偉華，馬小茹，等.戊四氮(PTZ)致癇大鼠腦組織NO和NOS變化及靈芝抱子粉干預(yù)[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2011，34(4):79-80

[9]RR Leker，F(xiàn) Soldner，DJ Hoeppner，et al.Notch ignalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo[J].Nature,2006，442(7104):823-826

[10]CE Murry，RB Jennings，KA Reimer .Preconditioning with ischemia :a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium[J].Circulation，1986，74(5):1124-1136

[11]李仲娟，楊朝令，楊細(xì)鳳，等.靈芝酸G對(duì)FcεRIα肥大細(xì)胞的活性影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2014，25(9)：2101-2102

[12]王健，楊元帥，王鋼，等.靈芝酸抗癌機(jī)制的分子模擬研究[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，29(11)：887-892

[13]金德寬.靈芝酸對(duì)人體糖代謝調(diào)節(jié)作用的研究[J].食品研究與開發(fā)，2012，33(11)：202-207

[14]欒倩，劉蕾，劉君星，等.靈芝酸對(duì)癇樣放電海馬神經(jīng)元ERK1/2磷酸化水平的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2014，37(2)：1-3

黑龍江省教育廳資助項(xiàng)目，編號(hào)：12521543。

程瑤(1988～)女，黑龍江齊齊哈爾人，在讀碩士研究生。

金玉玲(1969～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：754167691@qq.com。

R285.5

A

1008-0104(2016)05-0008-02

2016-05-04)