盧鳳美，林昔，劉東璞，徐霄航，孟慶媛，盛延良，姚海濤

(1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)

?

中藥對大鼠肝纖維化MMP-13及α-SMA的影響①

盧鳳美1，林昔1，劉東璞1，徐霄航2，孟慶媛1，盛延良1，姚海濤1

(1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)

目的:探討中藥紅景天、大黃酸(Rhein 1,8-二羥基-3-羧基蒽醌)對四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型肝組織中MMP-13及α-SMA的表達的影響。方法:本實驗用四氯化碳誘導(dǎo)建立大鼠肝纖維化模型。健康♂SD大鼠70只，隨機分組：(1)對照組(10只)；(2)模型組(20只)；(3)干預(yù)組1(大黃酸組，20只)；(4)干預(yù)組2(紅景天組，20只)。于實驗8周后處死大鼠取肝組織檢測MMP-13mRNA、α-SMAmRNA及蛋白的表達情況。結(jié)果:紅景天、大黃酸干預(yù)組肝組織中MMP-13mRNA及蛋白陽性表達均高于模型組(P<0.05)；紅景天、大黃酸干預(yù)組肝組織中α-SMAmRNA及蛋白陽性表達均低于模型組(P<0.05)；肝組織MMP-13mRNA表達與α-SMAmRNA表達水平變化呈負相關(guān)。結(jié)論:中藥紅景天與大黃酸均能有效促進肝纖維化大鼠肝臟中MMP-13、抑制α-SMA表達；中藥大黃酸和紅景天都能保護肝細胞活性,促進肝細胞修復(fù)再生，具有抗肝纖維化作用。

紅景天；大黃酸 ；MMP-13； α-SMA

近年來肝病已是威脅我國百姓健康的一大殺手。肝病中肝纖維化是肝硬化、肝癌等的必由之路，因此對肝纖維化的治療和逆轉(zhuǎn)是治療肝病的重要環(huán)節(jié)。復(fù)方紅景天對肝纖維化的治療報道較多，同時對肝纖維化肝組織內(nèi)相關(guān)成分表達情況的影響也有各案報道[1～2]，肝臟纖維化的病理生理學(xué)發(fā)生機制極其復(fù)雜,首先，肝細胞在各種損傷性因素作用下受損發(fā)生變性、壞死合并炎癥反應(yīng),使肝竇內(nèi)的枯否細胞活化釋放大量的細胞因子,進而激活Diss腔內(nèi)貯脂細胞,使之發(fā)生功能轉(zhuǎn)變,轉(zhuǎn)化為肌纖維母細胞,表達平滑肌肌動蛋白(α-SMA)導(dǎo)致細胞外基質(zhì)增生沉積,降解減少,形成肝纖維化，其中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metal proteases,MMPs)[3～7]是降解細胞外基質(zhì)的主要酶類，金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metal protease,TIMPs)則通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性抑制肝星狀細胞凋亡及抑制細胞外基質(zhì)降解的雙重作用致肝纖維化。

本研究旨在觀察中藥紅景天、大黃酸對四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝臟膠原沉積的影響，用免疫組織化學(xué)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)方法研究大鼠肝纖維化在紅景天和大黃酸干預(yù)下對α-SMA及MMP-13表達的影響,分析不同組別間α-SMA及MMP-13 表達差異的意義,了解其對大鼠肝臟α-SMA及MMP-13基因表達的影響，對比二者抗肝纖維化作用的療效。進一步從分子水平和蛋白水平探討紅景天和大黃酸干預(yù)實驗性大鼠肝纖維化的可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

體重185～240g的健康♂SD大鼠70只,由佳木斯大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 實驗藥品

CCl4購于廣州化學(xué)試劑三廠,紅景天膠囊購自廣東長興科技尊然健康管理有限公司，大黃酸粉劑購自西安昊軒生物有限公司。RT-PCR試劑盒(大連寶生物生物工程有限公司),α-SMA及MMP-13免疫組化試劑盒(武漢博士德生物有限公司)。

1.3 方法設(shè)計

1.3.1 實驗動物分組

健康♂SD大鼠70只，隨機分組:(1)對照組(10只)生理鹽水灌胃+橄欖油腹腔注射；(2)模型組(20只)用CCl4ip法誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型,即用100mL/L CCl4(橄欖油稀釋)1mL/kg,1次/周,同時給予生理鹽水灌胃2次/周，共8周；(3)干預(yù)組1(20只)在造模同時給予大黃酸灌胃(50μg/kg，2次/周，共8周)；(4)干預(yù)組2(20只)在造模的同時給予紅景天灌胃(濃度40g/L,劑量10mL/kg,2次/周,共8周)。在造模的同時給予紅景天灌胃(濃度40g/L,劑量10mL/kg,2次/周,共8周)。各組間暴露因素?zé)o差別(P>0.05)。各組大鼠在最后一次CCl4腹腔注射給藥后48h處死,取新鮮肝組織迅速放到-80℃冰箱凍存，其余肝臟用福爾馬林固定,留做病理檢材。(試驗中CCl4、紅景天劑量均在前期試驗中探索出最佳劑量)[8]。

1.3.2 檢測方法

①常規(guī)石蠟切片肝纖維化造模檢測。②免疫組織化學(xué)法檢測肝組織MMP-13、α-SMA表達。按試劑盒說明書操作。③RT-PCR檢測肝組織MMP-13、α-SMAmRNA:MMP-13 360bp S:5，-TATAGCAACAATTCTGGCG-3,；A:5,-CTGGTGGTGAAGAGCCAC-3,α-SMA 101Bp S:5，-AAGAGGAAGACAGCACAGCTC-3,；A:5,-GATGGATG-GGAAAACAGCC-3,按PCR試劑盒說明操作β-actin作為內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 經(jīng)病理主任醫(yī)師診斷80%(16/20)模型組大鼠肝纖維化為3期以上，20%(4/20)纖維化程度超過2期。干預(yù)組1(大黃酸)和干預(yù)組2(紅景天)肝纖維化程度均較模型組輕。

2.2 MMP-13、α-SMA免疫組化:大鼠肝組織MMP-13、α-SMA表達：模型組大鼠較正常組肝組織MMP-13蛋白的水平顯著降低(P<0.05)；干預(yù)組1與干預(yù)組2大鼠肝組織中MMP-13蛋白的水平較模型組顯著增高(P<0.05，表1，圖1)。干預(yù)組1與干預(yù)組2兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。肝組織中α-SMA蛋白表達的變化在正常組織切片中呈微弱水平表達,陽性信號主要見于竇周間隙中。模型組較對照組肝組織α-SMA蛋白的表達顯著增強,以竇周間隙中胞漿陽性表達最明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)組1、干預(yù)組2比較模型組大鼠肝組織中α-SMA蛋白的水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1，圖2。兩中藥干預(yù)組(干預(yù)組1與干預(yù)組2)間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

A B C D

圖1 肝組織中MMP-13表達 A 正常對照組 B 模型組 C 紅景天干預(yù)組D大黃酸干預(yù)組

A B C D

表1 肝組織MMP-13、α-SMA表達的變化

注：aP<0.05vs模型組;a1P<0.05vs模型組;a2P<0.05vs模型組;P>0.05a1vsa2。

2.3 RT-PCR結(jié)果：模型組大鼠肝組織MMP-13mRNA的水平較正常組顯著降低(P<0.05)；干預(yù)組1與干預(yù)組2大鼠肝組織中MMP-13mRNA的水平較模型組顯著增高(P<0.05，表2) 干預(yù)組1與干預(yù)組2兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。模型組較對照組大鼠肝組織α-SMAmRNA的水平顯著增高(P<0.05)；干預(yù)組1、干預(yù)組2大鼠肝組織中α-SMAmRNA的水平較模型組低，其A值相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,表2)。干預(yù)組1與干預(yù)組2兩組間比較差別不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 肝組織MMP-13mRNA、α-SMAmRNA表達的變化

注：aP<0.05vs模型組;a1P<0.05vs模型組;a2P<0.05vs模型組;P>0.05a1vs a2。

3 討論

由于各種損傷性因素的作用，肝臟細胞受到損傷時，活化了處于靜止?fàn)顟B(tài)的肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)，產(chǎn)生大量的細胞外基質(zhì)(EMC Ⅰ、Ⅱ型膠原)，同時產(chǎn)生大量抑制纖維化因子如間質(zhì)金屬蛋白酶-2( matrix metalloproteinases-2，MMP-2)及促纖維化因子如金屬蛋白酶組織抑制劑-1 (tissue inhibitor of metalloproteinase1，TIMP-1)和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)等，在肝纖維化時表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)合成增多，大量沉積,同時肝臟的原有結(jié)構(gòu)被破壞[4]。MMP-13可以抑制肝纖維化的發(fā)生，降解EMC。肝星狀細胞活化，MMP-13/α-SMA比值降低，細胞外基質(zhì)(EMC)降解減少,肝組織內(nèi)Ⅰ、Ⅱ型膠原沉積增多,進而加劇肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。因此，MMP-13/α-SMA對肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展起著重要的作用[9]。

通過多年的基礎(chǔ)與臨床研證實中藥紅景天具有從多層次多靶位抗肝纖維化作用的特點[10,11]。紅景天對大鼠肝纖維化模型的治療效果前期實驗已經(jīng)證實,同時二者之間存在一定的劑量關(guān)系，其治療肝纖維化的機制可能是紅景天能有效保護肝臟細胞，增加MMP-13蛋白及mRNA的表達,降低肝纖溶顆?？擅黠@降低大鼠肝臟α-SMA表達及mRNA的表達，上調(diào)MMP-13/α-SMA比值。本實驗?zāi)康脑谟趯Ρ却簏S酸與紅景天在抗肝纖維化方面的作用。結(jié)果顯示經(jīng)大黃酸和紅景天干預(yù)組，病理切片組織學(xué)觀察大鼠肝細胞的變性、壞死以及炎癥反應(yīng)均較模型組減輕，門管區(qū)及中央靜脈周圍的纖維化程度明顯減輕，免疫組化和RT-PCR檢測結(jié)果均顯示干預(yù)組MMP-13表達較模型組增高，α-SMA表達較模型組下降，證明大黃酸和紅景天同樣具有較好的抗纖維化作用，大黃酸具有良好的抗氧化和抗炎的作用，因而可有效保護肝細胞，減輕肝臟損傷，抑制肝臟星狀細胞活化，上調(diào)MMP-13/α-SMA比值從而增加膠原降解，減少細胞外基質(zhì)分泌，有效抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。

[1]劉東璞,盧鳳美，孟慶媛，等.紅景天對大鼠肝纖維化肝臟中TIMP-1、Smad4表達的影響[J].中國老年學(xué)雜志，2012，,32(12)：2556-2558

[2]盧鳳美,劉東璞，郭夢凡.紅景天對大鼠肝纖維化肝臟中Smad4、Smad7表達的影響[J].中國老年學(xué)雜志，2013,33(6)：1314-1316

[3]Carpino G,Morini S,Ginanni Corradini S,et al.Alpha-SMA expression inhepatic-stellate cells and quantitative analysis of hepatic fibrosis in cirrhosis and in recurrent chronic hepatitis after liver transplantation[J].Dig Liver Dis，2005，37:349-356

[4]E Huet,B Vallee,D Szul,et al.Gabison.Extracellular matrix metalloproteinase inducer/CD147 promotes myofibroblast differentiation by inducing alpha-smooth muscle actin expression and collagen gel contraction:implications in tissue remodeling[J].FASEB J,2008，22:1144-1154

[5]Kato N,Kosugi T,Sato W,et al.Basigin/CD147 Promotes Renal Fibrosis after Unilateral Ureteral Obstruction[J].The American Journal of Pathology，2011，178(2):572-579

[6]K Philipp,F Riedel,G Germann,et al.Sauerbier TGF-beta antisenseoligonucleotides reduce mRNA expression of matrix metalloproteinases in cultured wound-healing-related cells[J].Int J Mol Med,2005，15:299-303

[7]MA Karsdal,L Larsen,MT Engsig,et al.Foged Matrix metallo proteinase-dependent activation of latent transforming growth factor-beta controls the conversion of osteoblasts into osteocytes by blocking osteoblast apoptosis[J].J Biol Chem,2002，277:44061-44067

[8]劉東璞，盧鳳美,張輝，等.CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型的建立[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)2009,32(4):14-15

[9]武超，曹紅燕，孫明瑜.大黃酸在肝病中的應(yīng)用研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2015,42(12):2382-2387

[10]劉東璞,盧鳳美,孟慶媛,等.紅景天對 AFB1致大鼠肝癌中Survin表達的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2013,36(5):91-92

[11]劉翠杰,宋漢君.紅景天苷對肝癌細胞凋亡的誘導(dǎo)實驗研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2013,36(4):90-91

1.佳木斯大學(xué)面上項目，編號:S2013-036;2.佳木斯大學(xué)面上項目，編號:S2014-001。

盧鳳美(1970～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，副教授。

劉東璞(1969～)男，黑龍江佳木斯人，副教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:liudongpu1220@163.com。

R285.5；R575.2

A

1008-0104(2016)05-0046-02

2016-05-18)