朱曉峰,張浩業(yè),喬 峰,竇鵬揮,鄒志田

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院胸外科，黑龍江 佳木斯 154003)

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原癌基因C-met在食管鱗癌中的表達與預后相關(guān)性研究①

朱曉峰,張浩業(yè),喬 峰,竇鵬揮,鄒志田

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院胸外科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：探討C-met基因mRNA陽性表達與食管鱗癌復發(fā)、轉(zhuǎn)移及預后的相關(guān)性。方法：應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測50例食管鱗癌組織和20例癌旁正常食管組織中C-met mRNA的表達情況，統(tǒng)計學分析C-met mRNA表達與臨床病理資料、復發(fā)轉(zhuǎn)移及預后的相關(guān)性。結(jié)果：C-met mRNA在食管鱗癌組織中陽性表達率明顯高于癌旁正常食管組織(P<0.01)；C-met mRNA陽性表達率與癌組織浸潤深度(P<0.05)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.01)和TNM(P<0.01)分期有關(guān)，而與患者年齡、性別、病變長度和癌組織分化程度無關(guān)；C-met mRNA陽性表達者與陰性表達者在術(shù)后5年內(nèi)發(fā)生復發(fā)、轉(zhuǎn)移的例數(shù)分別為16例(59.3%)和5例(21.7%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；C-met mRNA陽性表達者的5年生存率為25.9%，明顯低于陰性表達者的60.9%(P<0.01)；COX回歸多因素分析提示C-met mRNA陽性表達是影響食管鱗癌患者預后的獨立危險因素(HR=6.026,P=0.005)。結(jié)論：C-met mRNA的檢測對判斷食管鱗癌的復發(fā)、轉(zhuǎn)移及預后有重要臨床意義。

食管；鱗狀細胞癌；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)；C-met基因；預后

食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，手術(shù)目前是其主要的治療方法，然而即使臨床分期較低的食管癌患者，手術(shù)后仍然有20%～30%的復發(fā)率，這提示食管癌患者的預后在很大程度上取決于其內(nèi)在的生物學行為，尤其是基因表達失調(diào)對于腫瘤本身的生長、增殖以及侵襲、轉(zhuǎn)移起著至關(guān)重要的作用。C-met是一種由C-met原癌基因編碼的蛋白產(chǎn)物，為肝細胞生長因子受體，具有酪氨酸激酶活性，與多種癌基因產(chǎn)物和調(diào)節(jié)蛋白相關(guān)，參與細胞信息傳導、細胞骨架重排的調(diào)控，是細胞增殖、分化和運動的重要因素。目前研究表明[1]，C-met與多種惡性腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，許多腫瘤病人在其腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中均有C-met的過度表達和基因擴增。當前國內(nèi)外關(guān)于食管鱗癌C-met表達情況的研究報道較少，所以本研究通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測了50例食管鱗癌組織和20例癌旁正常食管組織中C-met mRNA的表達，并分析C-met mRNA的表達與臨床病理資料之間的關(guān)系，判斷其與食管鱗癌術(shù)后復發(fā)、轉(zhuǎn)移及預后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

50例食管鱗癌手術(shù)標本及20例癌旁正常食管組織標本來自于佳木斯大學附屬第一醫(yī)院胸外科2008-11～2010-12手術(shù)病例,其中男40例,女10例，年齡35～71歲,中位年齡52.6歲。50例腫瘤組織中,11例低分化,25例中分化,14例高分化,23例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。腫瘤部位中段24例，下段26例。腫瘤大小≤5cm 28例，>5cm 22例。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)1997年修訂的食管癌臨床分期標準，Ⅱa期27例，Ⅱb+III期23例，食管上段、T4及M1(Ⅳ期)病人不包括在手術(shù)范圍內(nèi)。胸腹部淋巴結(jié)清掃范圍參照美國癌癥聯(lián)合委員會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)食管癌淋巴結(jié)分布圖，淋巴結(jié)清掃數(shù)目8～24枚，平均9.8枚。所有患者術(shù)中肉眼大體判斷均達RO切除，術(shù)后病理診斷食管鱗癌，食管上、下切緣均無腫瘤細胞殘留。相應(yīng)的癌旁正常食管組織標本為術(shù)中采集距離食管癌組織至少5cm以上的正常食管組織。所有患者術(shù)前未行放療、化療等治療，手術(shù)標本取材后馬上放入液氮罐中保存。

1.2 主要試劑及藥品

總RNA提取試劑盒(Trizo Rragent,Gibcobrl公司),RT-PCR試劑盒(Takara公司),DNA分子量標準(北京中山公司),其它試劑均為國產(chǎn)優(yōu)質(zhì)分析純。

1.3 RT-PCR實驗方法和結(jié)果判定

按照Trizol的說明書，首先應(yīng)用Trizol一步法分別提取食管鱗癌和癌旁正常食管組織中的總RNA，然后用紫外分光光度計測定純度并定量。從總RNA 中取0.5μg 用于合成cDNA第一鏈。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中加入以下試劑：MgCl22μL、10×RNA buffer 1μL、Rnase Free dH2O 3.75μL、 dNTP1μL、 Rnase Inhibitor 0.25μL、 Rnase Transcriptase 0.5μL和 Random 9mers 0.5μL樣品1μL。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：30℃ 10min、42℃ 30min、99℃ 5min、5℃ 10min。根據(jù)GenBank提供的C-met和內(nèi)參照β-actin的mRNA序列，應(yīng)用Oligo5.0軟件自行設(shè)計引物。設(shè)計引物序列由上?？迫A生物公司合成。C-met上游引物：5＇-TTCACCGCGGAAACACCCATC -3＇；下游引物：5＇-GTCTTCCAGCCAGGCCCAGT -3＇。預計擴增片段C-met140bp。β-actin上游引物，5＇-GGCATCCTCACCCTGAAGTA -3＇，下游引物，5＇-CCATCTCTTGCTCGAAGTCC -3＇。預計擴增片段為496 bp。C-met特異性引物稀釋終濃度為20pmol/μL，內(nèi)參照β-actin特異性引物稀釋終濃度為10pmol/μL。取2.5μL cDNA用于PCR擴增,在反應(yīng)體系中加入以下試劑：5×RNA buffer 2.5μL、滅菌 ddH2O 7.16μL、 TaqHs 0.04μL和C-met的上、下游引物各0.15μL或者β-actin的上、下游引物各0.15μL。C-met基因的逆轉(zhuǎn)錄擴增反應(yīng)條件：95℃ 2min變性、95℃ 1min、58℃ 1min、72℃ 1min、一共30個循環(huán)，最后72℃延伸7min。取2μLPCR產(chǎn)物與2μL Lodding Buffer混合，進行8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，100V/1.5h，電泳結(jié)束后，凝膠成像儀成像分析，計算目的基因mRNA的相對含量。應(yīng)用100bp梯度的Makers(中山公司)為分子量大小對照，確定電泳條帶。

1.4 隨訪

對患者定期隨訪，記錄腫瘤復發(fā)或轉(zhuǎn)移的時間，死于腫瘤復發(fā)或轉(zhuǎn)移的患者納入生存分析。隨訪截止日期為2015年12月底，術(shù)后中位隨訪時間為40.7個月(22～62個月)。所有患者都進行隨訪，隨訪率100%，隨訪通過門診復查及電話進行。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，兩樣本率的比較用皮爾遜卡方檢驗法,Kaplan-Meier壽命表法進行生存分析，Log-rank檢驗判斷生存差異性，采用COX回歸多因素分析法判定獨立的預后因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌組織和癌旁正常食管組織中C-met mRNA及β-actin mRNA的表達

依據(jù)C-met mRNA和β-actin mRNA條帶灰度值比較分析結(jié)果，50例食管鱗癌組織中有27例C-met mRNA陽性表達(陽性率為54.0%)；而20例癌旁正常組織僅有1例C-met mRNA陽性表達(陽性率為5.0%)。50例食管鱗癌組織和20例癌旁正常組織均有β-actin mRNA表達，見圖1。

1：食管鱗癌組織；2：癌旁正常食管組織；M：DNA分子量標準基因產(chǎn)物：C-met mRNA 140bp，β-actin mRNA 496bp

2.2 C-met mRNA表達情況與臨床病理資料的關(guān)系

在食管鱗癌組織中，C-met的表達與患者年齡、性別、病變長度和癌組織分化程度無關(guān)，而與癌組織浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)，見表1。

表1 C-met mRNA在食管鱗癌中的表達與臨床病理資料的關(guān)系

2.3 C-met mRNA表達情況與食管鱗癌術(shù)后復發(fā)、轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

術(shù)后隨訪出現(xiàn)復發(fā)、轉(zhuǎn)移的患者共21例，復發(fā)轉(zhuǎn)移率為42.0%。C-met mRNA陽性表達者有復發(fā)、轉(zhuǎn)移的為16例(59.3%)，陰性表達者中為5例(21.7%)，二者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.4 C-met mRNA表達情況與食管鱗癌預后的相關(guān)性

應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線對50例患者進行術(shù)后隨訪，結(jié)果顯示所有患者的5年生存率為42.0%。C-met mRNA陽性表達者5年生存率為25.9%，C-met mRNA陰性表達者5年生存率為60.9%，log-rank檢驗顯示二者差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。COX回歸多因素分析顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR=4.896,P=0.008)和C-met mRNA表達(HR=6.026,P=0.005)是影響食管鱗癌患者預后的獨立危險因素。

3 討論

C-met基因位于人類第七號染色體長臂(7q31)，大小約超過110kbp，包含21個外顯子。它的啟動子區(qū)域包含許多的調(diào)控序列，有AP1、AP2、NF-KB和HGF基因等。C-met基因編碼蛋白產(chǎn)物是先合成170kD的單鏈前體物，進而切割和重排成50kD的α亞基和145kD的β亞基，然后兩亞基再以二硫鍵相連形成190kD的異二聚體。α亞基和β亞基的胞外區(qū)是配體識別部位，可識別并結(jié)合HGF，而胞內(nèi)部位具有酪氨酸激酶活性，是多種信號分子相互作用的結(jié)合部位。作為肝細胞生長因子(HGF)唯一受體蛋白，C-met受體被HGF激活后發(fā)生自體磷酸化，其酪氨酸激酶活性增強，導致多種底物蛋白的酪氨酸磷酸化，這些中間底物的激活擴大了HGF的生物學活性，如促進細胞增殖、運動等[2]。

目前認為C-met促進腫瘤進展的機制主要有以下幾點：①C-met通過上調(diào)環(huán)氧合酶COX-2的基因表達和增加前列腺素(PG)的合成，從而促進食管癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[3]。②C-met誘導基質(zhì)降解酶的產(chǎn)生，通過破壞基底膜和增加蛋白水解來促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。③在食管惡性腫瘤的生長和增殖過程中新生血管的形成是不可或缺的[5]，同時也是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的必要條件，而HGF是一種促血管生長因子，它與內(nèi)皮細胞表達的C-met受體特異性結(jié)合，能夠激活血管內(nèi)皮細胞，引起血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，從而參與腫瘤新生血管的形成[6]。

最近的研究表明在正常細胞中C-met的表達和在腫瘤細胞中有著明顯的區(qū)別。在正常細胞中，原癌基因C-met mRNA呈低表達或不表達，雖然在組織器官切除或損傷后，C-met的表達有一過性的增加，但表達水平很快恢復到正常，證明正常細胞可以通過減少C-met的表達來控制它對HGF的反應(yīng)。在許多惡性腫瘤細胞中，可以觀察到C-met的持續(xù)、過度表達，常常伴隨高水平的自體磷酸化，這通常是由于基因的擴增所致。C-met的過度表達可見于人的肝癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、甲狀腺癌、結(jié)腸癌和腦膠質(zhì)瘤，C-met的過度表達提示腫瘤預后差[7，8]。

本研究利用RT-PCR技術(shù)，以β-actin為內(nèi)參照，檢測了食管鱗癌組織和癌旁正常食管組織中C-met mRNA的表達情況，結(jié)果提示C-met mRNA在癌旁正常食管組織中低表達，而在食管鱗癌組織中呈高表達(P<0.01)。本實驗的研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，C-met mRNA的表達與癌組織浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)，浸潤深度越深C-met mRNA陽性表達率越高(P<0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者C-met mRNA陽性表達率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.01)，表明C-met mRNA基因的表達與癌組織浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，而與患者年齡、性別、病變長度和癌組織分化程度無關(guān)(P>0.05)，更進一步說明食管鱗癌中C-met的過度表達能促進腫瘤細胞的擴散和轉(zhuǎn)移，提示C-met的過度表達與食管鱗癌的不良病理參數(shù)密切相關(guān)，腫瘤預后差。

本研究還發(fā)現(xiàn)，C-met mRNA陽性表達者復發(fā)、轉(zhuǎn)移率為59.3%，明顯高于陰性表達者的21.7%。50例食管鱗癌患者總的5年生存率為42.0%，C-met mRNA陽性表達患者的5年生存率為25.9%，明顯低于陰性表達患者的60.9%。COX回歸多因素分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和C-met mRNA表達是影響食管鱗癌患者預后的獨立危險因素。

目前以HGF-C-met信號通路為靶點的抑制劑、拮抗劑和反義核苷酸治療在多項實驗研究中已經(jīng)取得了可喜的成果。許多能夠阻斷HGF-C-met信號轉(zhuǎn)呈途徑的化合物已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，其中的典型代表是格爾德霉素類藥物(GA)。由于GA能降低C-met受體的表達，而且具有降低HGF誘導的uPA的表達的作用，因此在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移方面有很大臨床意義。HGF拮抗劑NK4由HGFɑ鏈N末端的發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)和4個Kringle區(qū)結(jié)構(gòu)所組成，能夠和C-met相結(jié)合，競爭性地抑制HGF和C-met的相互作用，影響HGF-C-met信號通路，進而抑制HGF誘導的腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移過程。多項體外實驗顯示NK4可抑制HGF誘導的包括人結(jié)腸癌、膽囊癌、乳腺癌、胰腺癌、宮頸癌、膽管癌和前列腺癌等細胞的運動和侵襲。有國內(nèi)學者采用脂質(zhì)體法合成的C-met反義寡核苷酸鏈,將構(gòu)建的C-met反義質(zhì)粒及U1SnRNA/核酸/反義C-met復合體分別轉(zhuǎn)染肝癌SF7721細胞，來封閉C-met信號轉(zhuǎn)呈，探討C-met信號轉(zhuǎn)呈阻滯對肝癌生長和轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果顯示C-met反義寡核苷酸鏈能抑制肝癌SF7721細胞的增殖，C-met反義質(zhì)粒及U1SnRNA/核酸/反義C-met復合體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細胞表達受體C-met的量均顯著減少，而且轉(zhuǎn)染后細胞增殖速度明顯減慢，侵襲運動能力減弱。體內(nèi)實驗也發(fā)現(xiàn)細胞轉(zhuǎn)染后裸鼠體內(nèi)生成腫瘤速度較慢，進而證明阻斷HGF-C-met的信號傳導能夠降低腫瘤生長甚至轉(zhuǎn)移的能力。國外學者也應(yīng)用C-met反義寡核苷酸/U6表達質(zhì)粒治療非小細胞肺癌，同樣觀察到伴有C-met蛋白表達下調(diào)的對腫瘤的抑制作用[9，10]。

C-met基因在食管鱗癌中表達的研究較少,它在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制尚不完全清楚,但是C-met mRNA在食管鱗癌中呈現(xiàn)高表達而且與腫瘤侵襲、復發(fā)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，所以研究其結(jié)構(gòu)、功能和作用機制對判斷食管鱗癌的復發(fā)、轉(zhuǎn)移、預后及以后的治療有重要臨床意義，HGF-C-met信號通路有望成為未來生物治療的靶點。

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黑龍江省衛(wèi)生廳科研項目,編號：2012-187。

朱曉峰(1970～)男，黑龍江佳木斯人，博士，主任醫(yī)師，碩士研究生導師。

鄒志田(1962～)男，黑龍江佳木斯人，博士，主任醫(yī)師，碩士研究生導師。E-mail:zxf700105@sina.com。

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1008-0104(2016)05-0001-04

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