尉榮翠，房迎華，趙秀琴，張道春，黃昕艷

(佳木斯大學(xué)第二附屬醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

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Aβ寡聚體對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞突觸形態(tài)及突觸蛋白Ng表達(dá)的影響①

尉榮翠，房迎華，趙秀琴，張道春，黃昕艷

(佳木斯大學(xué)第二附屬醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

目的：研究Aβ25-35寡聚體對(duì)原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)細(xì)胞突觸形態(tài)及突觸蛋白Ng表達(dá)的影響。方法：5、10、20umol/L Aβ25一35寡聚體作用于原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元1h，以免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Ng的表達(dá)。結(jié)果:與對(duì)照組相比:10、20μmol/L Aβ25-35寡聚體致Ng表達(dá)減少,差異有顯著性(P<0.05，P<0.01)，以10μmol/L Aβ25-35組最顯著(P<0.01)。結(jié)論：Aβ25-35寡聚體對(duì)突觸有損傷作用與作用濃度有關(guān)。

Aβ25-35 寡聚體；原代培養(yǎng)；Ng

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能減退為特征的神經(jīng)變性疾病，眾多的研究認(rèn)為，其典型的病理學(xué)改變老年斑(senile plaque,SP) 的主要成分β-淀粉樣蛋白(Amyloid-β,Aβ)是該病發(fā)病的起始因素和關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]，Aβ聚集后損傷突觸、激活膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞、損傷神經(jīng)元、最終導(dǎo)致癡呆。最近有研究表明，Aβ在形成纖維性沉積前的中間體狀態(tài)即Aβ寡聚體(oligomers)亦可產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，且發(fā)現(xiàn)在AD發(fā)病早期還未出現(xiàn)明顯的老年斑之前，其認(rèn)知功能的減退與可溶性Aβ水平及突觸功能障礙密切相關(guān)[2、3]，Aβ引起毒性的必需結(jié)構(gòu)是其25-35位的氨基酸殘基序列(即Aβ25-35)。但是,Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷機(jī)制還不清楚。本研究利用寡聚體Aβ25-35作用于原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)細(xì)胞建立AD細(xì)胞模型，觀察Aβ25-35 寡聚體對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞的突觸蛋白神經(jīng)顆粒素(Neurogranin， Ng)表達(dá)的影響，以期對(duì)AD早期的發(fā)病機(jī)制有進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

六氟異丙醇(HFIP)、無(wú)酚紅F12購(gòu)自Sigma公司，B27添加劑、DMEM/F12、胎牛血清購(gòu)自Gibco，Ng及Aβ25-35均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Aβ25-35寡聚體的制備：將Aβ25-35肽從-20℃冰箱取出放在冰上，在通風(fēng)櫥內(nèi)將HFIP放在冰上預(yù)冷，每1mg Aβ25-35加入220μLHFIP，蓋上離心管蓋在室溫放置60min，Aβ25-35充分溶解后放回冰上10min，再將Aβ25-35-HFIP溶液放置室溫下?lián)]發(fā)、過(guò)夜。次日再置于通風(fēng)櫥內(nèi)使HFIP揮發(fā)殆盡(約2h)。每管加44μLDMSO，吹打混勻后，每管加9386μLF12培養(yǎng)基，4℃孵育24h，4℃，14000rpm離心10min后，轉(zhuǎn)移上清液至新管，分裝，放入-20℃，儲(chǔ)存濃度為100μmol/L。

1.2.2 海馬神經(jīng)細(xì)胞的原代培養(yǎng)：選用出生3d內(nèi)的Wistar大鼠，解剖分離出海馬，經(jīng)0.125%胰酶于37℃培養(yǎng)箱中消化8～12min，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化。經(jīng)懸浮、離心、過(guò)濾等步驟收集細(xì)胞,用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基制成細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液,接種于預(yù)先鋪有多聚賴(lài)氨酸的24孔培養(yǎng)板內(nèi)的蓋玻片上，置于37℃， 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后換含2%B27的DMEM/F12培養(yǎng)基，每隔3d半量換液1次。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及Aβ25-35寡聚體干預(yù):海馬神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)7d后，棄原培養(yǎng)液，加入DMEM培養(yǎng)液及Aβ25-35寡聚體。實(shí)驗(yàn)分為三組，使Aβ25-35寡聚體的終濃度分別為5、10、20μmol/L，同時(shí)設(shè)不加Aβ25-35寡聚體的對(duì)照組(以相應(yīng)體積的DMEM培養(yǎng)液代替)，每組設(shè)8孔，1h后終止培養(yǎng)，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。

1.2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色:4%多聚甲醛固定10min，PBS洗滌后,加入0.3% Triton X-100，PBS洗滌，滴加0.3%H2O2甲醇30min，5%正常馬血清室溫封閉60min。加入一抗Ng (1∶200，陰性對(duì)照以PBS代替),室溫反應(yīng)2h后入4℃冰箱過(guò)夜。次日PBS洗滌后加入生物素化二抗工作液山羊抗兔IgG，PBS洗滌后滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，PBS洗滌后常規(guī)梯度乙醇脫水，DAB顯色，二甲苯透明，封片。

1.3 圖像分析與統(tǒng)計(jì)處理

倒置顯微鏡下，以胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒沉著為陽(yáng)性細(xì)胞。在200倍鏡下分別計(jì)數(shù)5個(gè)孔各5個(gè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的百分比，以此代表神經(jīng)元純度。倒置顯微鏡下(LEICA DM4000 B)采集圖像，進(jìn)行灰度定量分析(Leica Qwin V3)，平均灰度值1～255(白色平均灰度值為255，黑色平均灰度值為0)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)形態(tài)學(xué)觀察

倒置相差顯微鏡下觀察，接種24h后，幾乎全部細(xì)胞己貼壁，可見(jiàn)光滑的突起。第3天，神經(jīng)細(xì)胞胞體增大，突起延長(zhǎng)并出現(xiàn)分枝，胞體呈三角形或橢圓形；第5天，神經(jīng)細(xì)胞胞體進(jìn)一步增大，突起繼續(xù)增粗增長(zhǎng)，末端分叉明顯，己交織成網(wǎng)，胞體和突起暈光明顯，立體感強(qiáng);第7天，神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，胞體大，突起長(zhǎng),分枝連接成網(wǎng)，見(jiàn)圖1。

圖1 原代海馬神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)7d(×200)

2.2 Aβ寡聚體不同濃度組致傷原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)第一部分：分別以5、10、20μmol/L濃度的Aβ25-35與神經(jīng)細(xì)胞共同培養(yǎng)1h后鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，10μmol/L組的細(xì)胞數(shù)目明顯減少，大部分神經(jīng)元胞體縮小，細(xì)胞間出現(xiàn)明顯空隙，突起數(shù)目減少，斷裂或消失，并可見(jiàn)到少量細(xì)胞碎片。20μmol/L濃度的Aβ組細(xì)胞突起消失，細(xì)胞胞膜已破裂，有很多細(xì)胞碎片，PBS沖洗后，碎片脫落，無(wú)法做免疫細(xì)胞化學(xué)染色。

2.3 Aβ寡聚體不同濃度組對(duì)Ng表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)第二部分：正常對(duì)照組，棕黃色細(xì)胞多，被染色的細(xì)胞多為胞體較大，突起長(zhǎng)，樹(shù)突多處可見(jiàn)棕黃色顆粒(圖2)。與正常對(duì)照組相比，Aβ 5μmol/L 組著色細(xì)胞無(wú)明顯減少，突起較長(zhǎng)，平均灰度值略有增大，Ng表達(dá)略有減少，但差異無(wú)顯著性(P﹥0.05) (圖3)；Aβ 10μmol/L 組著色細(xì)胞減少，被染色的細(xì)胞多為胞體較小，突起較短(圖4)，Aβ 20μmol/L 組細(xì)胞明顯減少，殘存細(xì)胞胞體小，突起斷裂、消失(圖5)。Aβ 10μmol/L、20μmol/L 組灰度值增大，Ng表達(dá)減少，差異有顯著性(P<0.01)；其中，Aβ 10μmol/L 組最明顯，與Aβ 5μmol/L 組比較(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Aβ引起的PSD-95減少具有劑量依賴(lài)性，以Aβ10μmol/L為致突觸損傷的適宜濃度見(jiàn)表1。

圖2 正常對(duì)照組Ng(×400)

圖3 5μmol/L Aβ25-35寡聚體組Ng(×400)

圖4 10μmol/L Aβ25-35寡聚體組Ng(×400)

圖5 20μmol/L Aβ25-35寡聚體組Ng(×400)

組別灰度值正常對(duì)照組239.35±0.31Aβ5μmol/L組239.48±0.28#Aβ10μmol/L組240.06±0.24*Aβ20μmol/L組252.71±0.23*

與正常對(duì)照組比較﹟P>0.05，*P<0.01；10μmol/L組與5μmol/L組比。

3 討論

目前認(rèn)為，Aβ在大腦皮層內(nèi)的蓄積是AD病理發(fā)生過(guò)程中的一個(gè)早期必然事件，超前于其它腦區(qū)損傷和臨床癥狀數(shù)年[4]。然有大量的證據(jù)顯示Aβ纖維發(fā)揮了多種對(duì)神經(jīng)元的毒性，然而最近有研究表明，Aβ由可溶狀態(tài)到不溶狀態(tài)的轉(zhuǎn)變是AD發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，Aβ在形成纖維性沉積前的中間體狀態(tài)，即Aβ寡聚體亦可產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，Aβ寡聚體可以在生理水平明顯抑制大鼠海馬的突觸傳遞[5，6]，提示可溶性Aβ寡聚體可能是導(dǎo)致AD病人腦內(nèi)突觸功能障礙和突觸丟失的主要效應(yīng)物。

突觸可塑性是學(xué)習(xí)和記憶的基礎(chǔ)，在AD早期主要表現(xiàn)為顯著的記憶損害，資料表明這一表現(xiàn)起始于海馬突觸功效的微弱改變，而此改變?cè)缬陲@著的神經(jīng)元退行性變[2，3]，而突觸喪失與AD患者的癡呆程度直接相關(guān)[7]。

神經(jīng)顆粒素(Neurogra-nin， Ng)屬Calpacitin蛋白家族，是一種神經(jīng)元特異性蛋白。主要存在于大腦皮層、海馬和嗅球，Ng 分布于成熟神經(jīng)元的胞體、核周、樹(shù)突和樹(shù)突棘，但多數(shù)Ng仍積聚于樹(shù)突的胞質(zhì)內(nèi)，可作為一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變樹(shù)突受損的一種標(biāo)記物[8，9]。Ng與學(xué)習(xí)、記憶相關(guān)的海馬、神經(jīng)遞質(zhì)及其受體、蛋白激酶等關(guān)系密切，在正常生理狀態(tài)下，即細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平低時(shí)，Ng與CaM結(jié)合，而在細(xì)胞內(nèi)高Ca2+濃度狀態(tài)下，Ng與CaM分離，釋放出游離的CaM，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)CaM及Ca2+/CaM依賴(lài)性蛋白酶，如Ca2+/CaM-依賴(lài)性蛋白激酶Ⅱ(calcium-calmodulin-dependentkinaseⅡ，CaMKⅡ)及Ca2+/CaM-依賴(lài)性腺苷酸環(huán)化酶等活性的調(diào)節(jié)。Ng在突觸的發(fā)育、突觸的穩(wěn)定性和可塑性中起重要作用[10]，因此，我們以Ng做為突觸結(jié)構(gòu)和功能可塑性的觀察指標(biāo)，摸索Aβ25-35寡聚體致突觸損傷的濃度，亦可用做觀察藥物突觸保護(hù)作用的指標(biāo)。

實(shí)驗(yàn)中我們以5、10、20μmol/L濃度的Aβ25-35寡聚體加入原代培養(yǎng)7d的大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)基中，觀察發(fā)現(xiàn)，10μmol/L Aβ25-35寡聚體組細(xì)胞數(shù)目減少，大部分神經(jīng)元胞體縮小，突起數(shù)目減少，斷裂或消失，并可見(jiàn)到少量細(xì)胞碎片，而20μmol/L寡聚體濃度組細(xì)胞突起消失，細(xì)胞胞膜已破裂，有很多細(xì)胞碎片，PBS沖洗后，碎片脫落，無(wú)法做免疫細(xì)胞化學(xué)染色。免疫細(xì)胞化學(xué)染色后采集圖像，進(jìn)行灰度定量分析，白色灰度值最高為255，黑色最低為0，灰度值越低，表明著色越多，Ng表達(dá)越強(qiáng)。結(jié)果，5μmol/L Aβ25-35寡聚體組Ng表達(dá)略有減少，但與正常組比較差異無(wú)顯著性(P﹥0.05)；10μmol/L Aβ25-35寡聚體組Ng表達(dá)減少較明顯；20μmol/L Aβ25-35寡聚體組Ng表達(dá)明顯減少。試驗(yàn)再重復(fù)2次，結(jié)果相同。故認(rèn)為Aβ25-35寡聚體引起的Ng減少具有劑量依賴(lài)性，致突觸損傷模型的最佳有效濃度為10μmol/L。

本研究結(jié)果表明，Aβ25-35寡聚體能降低Ng的表達(dá)，呈劑量依賴(lài)性，10μmol/L Aβ的致傷作用非常顯著?？梢酝茰y(cè)，在此濃度作用下突觸后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和整合出現(xiàn)障礙，突觸可塑性嚴(yán)重受損，此數(shù)據(jù)可為AD早期突觸損傷模型的建立提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

隨著對(duì)Aβ寡聚體致傷機(jī)制的深入了解，對(duì)AD復(fù)雜的病因及發(fā)病機(jī)制的不斷探究，特別對(duì)于AD早期認(rèn)知障礙與突觸功能損害的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，將為AD的發(fā)病機(jī)制研究探索出新的途徑，也為AD的早期干預(yù)、治療以及新藥物的研發(fā)開(kāi)拓新的思路與方向。

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WEIRong-cui,FANGYing-hua,ZHAOXiu-qin,ZHANGDao-chun,HUANGXin-yan

(Institute of Neuroscience,Jiamusi University,Jiamusi 154002,China)

Objective:To investigate neurotoxicity in synapses of primary cultured hippocampal neurons induced by Aβ25-35 oligomers.Methods:The hippocampal neurons were incubated by Aβ oligomers with different concentration for 1 hour.Ng was used as index of the measure synaptic damage.The expression of PSD-95 was detected by using immunohistochemical SABC method.Result:Compared with the normal group,the expression of Ng decreased in 1μmol/L Aβ group，5μmol/L Aβ group (P<0.05,P<0.01).The latter is more significant (P<0.01) with statistical significance.Conclusion:Neurotoxicity in Synapse induced by Aβ25-35oligomers is associated with concentration in a dose-dependent manner.

β-Amyloid peptide fragment 25-35(Aβ25-35)；primary cultivation; Ng

佳木斯大學(xué)科研項(xiàng)目，編號(hào)：s2013-052。

作者介紹：尉榮翠(1969～)女，黑龍江佳木斯人，本科，副主任護(hù)師。

黃昕艷(1969～)女，黑龍江佳木斯人，碩士， 主任醫(yī)師。E-mail:huangxiyan@163.com。

R329.2

A

1008-0104(2016)05-0050-03

2016-05-12)Neurotoxicity in synapse of primary cultured hippocampal neurons induced by Aβ25一35 oligomers