王淑靜，李春玉，鄒艷紅，聶 磊，韓小唯，王麗敏

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院兒科,黑龍江 佳木斯 154003)

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Cyr61及MMP-3/TIMP-2在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織中的表達①

王淑靜，李春玉，鄒艷紅，聶 磊，韓小唯，王麗敏

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院兒科,黑龍江 佳木斯 154003)

目的：觀察單側(cè)輸尿管梗阻大鼠(UUO)腎組織中富含半胱氨酸61(Cyr61)、基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)/金屬蛋白酶組織抑制因子-2(TIMP-2)的相關(guān)性，探討Cyr61在腎間質(zhì)纖維化過程中的作用。方法：將80只雄性SD幼年大鼠，隨機分為假手術(shù)組和模型組，結(jié)扎模型組大鼠左側(cè)輸尿管并離斷致UUO模型。分別在術(shù)后第1、3、7、14天每組每次各處死10只大鼠，取左腎標本，做HE和Masson染色，并用免疫組化SABC法檢測腎組織中Cyr61、MMP-3、TIMP-2的表達。結(jié)果：免疫組化的結(jié)果顯示在UUO模型大鼠腎組織中Cyr61在腎損傷初期大量表達，同時Cyr61與MMP-3/TIMP-2比值呈正相關(guān)(r=0.890,P<0.05)。結(jié)論：Cyr61在腎損傷的早期即發(fā)揮一定的保護作用，同時這種保護作用在MMP-3/TIMP-2比例的失衡中可能具有重要的調(diào)節(jié)的作用。

腎間質(zhì)纖維化；富含半胱氨酸61；基質(zhì)金屬蛋白酶-3；金屬蛋白酶組織抑制物-2

Cyr61(Cysteine-rich 61，Cyr61/CCN1)作為整合素的配體，是抗纖維化中重要的一個環(huán)節(jié)[1]。它可以誘導MMPs的表達，抑制TIMPs的生成。國內(nèi)Cyr61的研究主要集中在肝纖維化、多囊腎、缺血性腎損傷、腎炎以及其對腎小管上皮細胞凋亡的影響[1，3，4]，而檢測其在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠(unilateral ureteral obstruction,UUO)中的表達及其與MMP—3/TIMP—2相關(guān)性的研究尚未見報道，本實驗通過結(jié)扎單側(cè)輸尿管誘導建立腎間質(zhì)纖維化的模型，分析Cyr61與MMP-3/TIMP-2比值的相關(guān)性，探討Cyr61對腎間質(zhì)纖維化發(fā)展過程的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

80只4周齡清潔級SD雄性幼年大鼠，體重(150±50)g，隨機分為2組，假手術(shù)組和模型組各40只，假手術(shù)組尋找到左側(cè)輸尿管后僅游離處理,不做結(jié)扎和離斷，模型組大鼠以10%水合氯醛(0.4mL/100g)腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于手術(shù)板，剪毛后常規(guī)消毒、鋪巾，在無菌條件下選取左側(cè)脊柱旁1.5cm，左肋下1cm處做一縱行切口，依次切開皮膚、皮下組織、鈍性分離肌肉，切開后腹膜，沿左腎下極尋找左輸尿管，用玻璃分針將左輸尿管托起并將其游離，緊貼左腎下極結(jié)扎近端輸尿管，結(jié)扎輸尿管遠端后從中間離斷；逐層縫合、消毒。分別于術(shù)后1、3、7、14d，每組各處死10只幼年大鼠，取左腎標本，用10%中性甲醛充分固定后，石蠟包埋待用。

1.2 主要試劑

兔抗大鼠多克隆抗體Cyr61、MMP-3、TIMP-2，免疫組化試劑盒及DAB顯色盒均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 病理學染色檢查及分析

腎組織經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋后，切成3μm厚度的組織標本，行HE 染色來評估腎小管間質(zhì)損傷程度，改良 Masson三色法染色觀察腎小管損害及腎間質(zhì)纖維化。在高倍鏡下(×400)每張標本的皮質(zhì)部位，隨機切10個不含腎小球的不重疊的視野，按文獻[5]描述的方法進行半定量評分。

1.3.2 腎標本免疫組化染色及分析

采用SABC法，按說明書步驟進行(稀釋一抗比例Cyr61：1：80，MMP-3:1：100，TIMP-2：1:150)。在高倍鏡下(×400)，每張切片隨機選取10個腎小管間質(zhì)的視野， DAB顯色的陽性區(qū)域可出現(xiàn)對比鮮明的棕黃色(均質(zhì)或者顆粒)為特異性陽性反應(yīng)。用圖像分析儀對所選取的圖像進行分析，計算各因子陽性表達的累計光密度值(IOD)。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠腎小管及間質(zhì)病理學改變

HE和Masson染色光鏡下檢查可見模型組大鼠術(shù)后1d，遠端腎小管無明顯擴張，腎小球結(jié)構(gòu)正常；術(shù)后3d，遠端腎小管可見明顯擴張，腎間質(zhì)可見輕度水腫，間質(zhì)內(nèi)可見少量的炎性細胞浸潤，腎間質(zhì)未見明顯纖維化；術(shù)后7d各級腎小管均出現(xiàn)明顯擴張，部分腎小管管腔內(nèi)可見少許脫落的上皮細胞及蛋白管型，間質(zhì)增寬中可見增多的炎性細胞及部分間質(zhì)的纖維化；術(shù)后第14天可見近端、遠端腎小管及集合管成囊狀擴張，腎小管結(jié)構(gòu)嚴重破壞，腎間質(zhì)中大量炎性細胞浸潤及間質(zhì)的纖維化。見圖1。

圖1 模型組與假手術(shù)組同一時間點腎小管間質(zhì)損害程度

*P<0.05；表示模型組內(nèi)各時間點腎小管間質(zhì)損害程度相比，﹟P<0.05。

2.2 實驗大鼠腎間質(zhì)中Cyr61陽性的表達

光鏡下，Cyr61在假手術(shù)組腎小管上皮細胞少量表達，在腎小球無表達。模型組術(shù)后1d腎小管間質(zhì)中Cyr61表達明顯增加，主要集中在近曲腎小管中。術(shù)后第7天Cyr61的表達明顯減少，陽性表達較術(shù)后3d及術(shù)后1d明顯減少，其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；術(shù)后14d，Cyr61在腎小管間質(zhì)中呈現(xiàn)低表達(P<0.05)。見圖2 。

圖2 各組大鼠腎組織中Cyr61、MMP-3、TIMP-2的表達

*P<0.05；表示模型組內(nèi)各時間點相比，﹟P<0.05。

2.3 各時間點實驗大鼠MMP-3、TIMP-2陽性的表達

光鏡下，假手術(shù)組MMP-3在遠端腎小管上皮細胞的胞漿中及腎小球上皮細胞可見少量的表達。模型組在術(shù)后第1天可見到MMP-3的表達明顯增多，術(shù)后7天，MMP-3的表達到高峰后逐漸降低。TIMP-2在假手術(shù)組腎小管上皮細胞中可見少量的表達，模型組主要表達在腎小管、集合管的上皮細胞、腎間質(zhì)細胞中，腎小球可見少量表達，其表達隨梗阻時間的延長表達呈現(xiàn)增長趨勢。見圖2。

2.4 腎小管的損傷程度、Cyr61與MMP-3/TIMP-2比值相關(guān)性的分析

觀察各時間點腎小管間質(zhì)的損害程度與Cyr61的表達發(fā)現(xiàn)，二者之間呈負相關(guān)(r=-0.737，P<0.05)，即隨著腎小管損害程度的增加，Cyr61的表達逐漸降低;而Cyr61的表達與MMP-3/TIMP-2比值之間呈正相關(guān)(r=0.890,P<0.05)。見圖3。

圖3 相關(guān)分析散點圖

3 討論

大量的研究證實：腎小管間質(zhì)損害的程度與腎功能的下降密切相關(guān)，其損害的嚴重程度也是判斷各種腎臟疾病預(yù)后的重要指標。早期判斷腎小管損害程度并盡早的進行干預(yù)治療，對腎臟病患兒的康復起著決定性的意義。

有研究表明，在腎缺血損害后3～6 h近端腎小管直部即可迅速誘導Cyr61的表達[6]。本實驗發(fā)現(xiàn)，在梗阻損害發(fā)生后，模型組大鼠腎組織中Cyr61首先在近端腎小管曲部大量表達，隨梗阻時間的延長，在遠端腎小管、集合管均有表達。實驗中，我們觀察到各時間點中Cyr61的表達與腎小管及間質(zhì)的損害程度呈負相關(guān)，近曲小管是物質(zhì)重吸收和利用的部位，也是藥物損傷的部位，這表明Cyr61作為一種即刻蛋白，可能在腎損傷的早期發(fā)揮一定的負向調(diào)節(jié)作用，這與前人的研究一致[7]，同時這種負向調(diào)節(jié)作用可能也持續(xù)存在于梗阻所致的腎纖維化過程中。

腎纖維化的特點是ECM成分的過多積累和沉淀[8]。MMPs及其組織抑制因子TIMPs是調(diào)節(jié)ECM 動態(tài)平衡的最重要的酶系之一，其活性的變化及比例的失衡是最終導致腎臟纖維化發(fā)生的主要機制。趙麗君等人在2013年的研究中顯示大鼠單側(cè)輸尿管梗阻后出現(xiàn)的腎間質(zhì)纖維化病理損害和與 MMP-3/TIMP-2 的表達失衡有關(guān)[9]。本實驗通過免疫組化的方法，觀察MMP-3、TIMP-2在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織中的表達與趙麗君等人的研究相符，但本研究發(fā)現(xiàn)MMP-3的表達在梗阻后的7天就出現(xiàn)了下降，在梗阻后14天則出現(xiàn)了明顯的下降。其原因主要考慮為：①所取樣本量不同；②標本部位存在差異；③觀察陽性表達的選取的時間點存在差異。

LI-GANG JIE等人在類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜細胞的增殖與侵襲試驗中觀察到Cyr61可以顯著上調(diào)MMP-3的表達[10]。在我們的研究中同樣也觀察到MMP-3的增高，同時我們的實驗還發(fā)現(xiàn)，隨著梗阻時間的延長，Cyr61的表達同MMP-3/TIMP-2的比值存在著正相關(guān)，這表明Cyr61可能也通過調(diào)控MMP-3/TIMP-2的平衡，在腎纖維化的過程中發(fā)揮重要作用。研究中我們還發(fā)現(xiàn)，各時間點假手術(shù)組中MMP-3/TIMP-2的比值幾乎無差異，而模型組中，隨著梗阻時間的延長其比值出現(xiàn)下降，這個比值是否可以作為判斷腎小管損害程度及判斷預(yù)后的標準，在阻斷腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展過程中，為臨床預(yù)防和阻斷腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展提供一個新的治療環(huán)節(jié)，未來我們需要更大量的實驗數(shù)據(jù)進一步的研究驗證。

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佳木斯大學研究生科技創(chuàng)新項目，編號：LM2015_021。

王淑靜(1988～)女， 河南濮陽人，在讀碩士研究生。

王麗敏(1964～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導師。E-mail:wanglimin6518@163.com。

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