陳慕雁， 孫 芮， 洪澤州， 朱愛軍

(中國海洋大學(xué) 1.水產(chǎn)學(xué)院； 2.海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，山東 青島 266003)

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刺參組蛋白脫乙?；D(zhuǎn)移酶基因克隆及其在夏眠期間表達(dá)特征的研究*

陳慕雁1,2， 孫 芮1,2， 洪澤州1,2， 朱愛軍1,2

(中國海洋大學(xué) 1.水產(chǎn)學(xué)院； 2.海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，山東 青島 266003)

刺參(Apostichopusjaponicus)利用夏眠的習(xí)性來應(yīng)對夏季的高溫脅迫，長期的代謝減退和基因轉(zhuǎn)錄抑制是刺參夏眠調(diào)控過程中的關(guān)鍵策略。本研究克隆分析了刺參體內(nèi)關(guān)鍵組蛋白脫乙酰基轉(zhuǎn)移酶(HDACs)的基因全長及結(jié)構(gòu)特征，測定了該家族成員(HDAC1,HDAC3和HDAC4)在夏眠期間的基因表達(dá)模式。研究表明：刺參HDAC3和HDAC4與紫海膽(Strongylocehtrotuspurpturatus)相關(guān)基因的同源性最高，分屬HDACs家族的Ⅰ型和Ⅱ型。定量表達(dá)分析表明，刺參不同組織中同屬Ⅰ型的HDAC1和HDAC3基因在刺參夏眠不同階段的表達(dá)均無顯著差異；而屬于Ⅱ型的HDAC4基因在深度夏眠階段表達(dá)量顯著上調(diào)。研究結(jié)果表明，II型HDACs在刺參夏眠基因轉(zhuǎn)錄抑制中具有潛在的特殊調(diào)節(jié)作用。

刺參； 組蛋白脫乙?；D(zhuǎn)移酶； 基因特征； 夏眠； 轉(zhuǎn)錄抑制

夏眠是動物應(yīng)對高溫、低氧、干旱或缺少食物等極端環(huán)境時所采取的生存策略，廣泛存在于脊椎動物和無脊椎動物中[1]。動物夏眠期間，機(jī)體進(jìn)入代謝減退狀態(tài)以降低休眠動物降低體內(nèi)貯存的有限能量的消耗，保證基礎(chǔ)代謝的正常進(jìn)行。研究證實不同組織中細(xì)胞能量的1%～10%用以基因轉(zhuǎn)錄[2], 因而基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)抑制將會顯著降低有機(jī)體在代謝減退狀態(tài)下的能量消耗。已有研究表明鹵蟲 (Artemiafranciscana) 和濱螺 (Littorinalittorea)在缺氧脅迫響應(yīng)過程中[3]，哺乳動物在冬眠過程中[4-6]以及刺參在夏眠過程中都會發(fā)生嚴(yán)重的代謝減退并伴隨著基因表達(dá)的整體抑制[7]。

表觀遺傳修飾作為調(diào)控基因表達(dá)抑制的重要手段之一，在生命過程中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。其中組蛋白的乙酰化和去乙?；揎検腔蜣D(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵表觀遺傳調(diào)節(jié)機(jī)制之一，通常組蛋白的乙?；瘯T導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活，而去乙?；瘎t引起轉(zhuǎn)錄抑制。這一修飾系統(tǒng)主要受組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(Histone acetyltransferases,HATs)和組蛋白脫乙?；D(zhuǎn)移酶(Histone deacetylases, HDACs)調(diào)控[8]。如組蛋白H3 N-末端容納了多個能夠被乙?；腖ys殘基，由組蛋白乙?；l(fā)的結(jié)構(gòu)改變致使裝配緊密的DNA結(jié)構(gòu)變得松散，以便于DNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯[9-10]，組蛋白脫乙?；D(zhuǎn)移酶則可通過移除組蛋白尾部的乙?；鶊F(tuán)促使染色質(zhì)的裝配更為緊密從而抑制轉(zhuǎn)錄。已有研究表明組蛋白乙?；趧游锒吆腿毖醯拇x減退過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[11-12]，而關(guān)于乙?；揎椩跓o脊椎動物夏眠過程中的調(diào)控作用研究還鮮有報道。刺參(Apostichopusjaponicus)又名仿刺參，屬棘皮動物門(Echinodermata)海參綱(Holothuroiclea)楯手目(Aspidochirotida)，是我國北方海域重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。刺參具有夏眠的特殊生態(tài)習(xí)性，當(dāng)夏季水溫升高到一定的閾值時，刺參即進(jìn)入長達(dá)4個月的夏眠周期，夏眠期間刺參停止攝食，腸道退化萎縮，代謝減退，并伴隨著耗氧率和氨氮排泄的減少[13]，極大地延長了養(yǎng)殖周期，增加了養(yǎng)殖成本。本研究利用RACE技術(shù)首次克隆獲得刺參HDAC3和HDAC4基因全長cDNA序列，并進(jìn)行了同源比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析；利用qRT-PCR技術(shù)測定了刺參在非夏眠期、深度夏眠時期、夏眠解除時期HDAC1、HDAC3和HDAC4基因在腸道、呼吸樹和肌肉組織中的表達(dá)變化模式，以期為探討刺參夏眠期間乙?；诨虮磉_(dá)中的調(diào)控作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用刺參采自青島市膠南靈山衛(wèi)海區(qū)，共采集了3個階段的刺參樣品：非夏眠期作為對照組(2014 年5月初，海水水溫15 ℃)；深度夏眠期(2014年8月上旬，海水水溫28 ℃)；及夏眠解除期(2014年10月上旬，海水水溫18 ℃)。每個階段選取5頭健康且體重在100～120 g之間的刺參，快速解剖并取腸道、呼吸樹和肌肉組織置于凍存管中，于液氮中速凍，之后保存在-80 ℃超低溫冰箱中備用。

1.2 總RNA提取和cDNA 全長克隆

采用RNeasy mini kit 試劑盒(Cat No. 74104, Qiagen, Germany)提取刺參腸道，呼吸樹和肌肉組織樣品總RNA，用瓊脂糖電泳檢查RNA的完整性，NanoDrop 1000分光光度計(Thermo Scientific)檢測計算總 RNA 樣品濃度。根據(jù)刺參轉(zhuǎn)錄組中的HDAC3和HDAC4基因片段序列設(shè)計特異性引物(見表1)，利用SMART RACE cDNA末端擴(kuò)增試劑盒(Cat No. 634858, Clontech, USA)進(jìn)行HDAC3和HDAC4基因cDNA 全長克隆，具體按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。利用1%瓊脂糖電泳分析檢測結(jié)果，割膠后利用OMEGA公司的膠回收試劑盒進(jìn)行目的片斷的回收，將目的片斷連接至載體pMD19-T 質(zhì)粒上，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中(Cat No. D9052, Takara, Japan)，復(fù)蘇1h后涂在預(yù)先制備好的含氨芐的LB平板上過夜培養(yǎng)。挑取陽性克隆于SOC液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h。以菌液為模板進(jìn)行PCR 檢測并送至Invitrogen公司測序。

表1 刺參基因CDNA全長擴(kuò)增和QRT-PCR引物列表

1.3 序列分析

利用DNAStar軟件進(jìn)行序列拼接得到目的基因cDNA全長序列，并預(yù)測基因開放閱讀框(Open reading frame, ORF)和氨基酸序列。利用NCBI 網(wǎng)站上的BLAST 工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行同源比對分析。利用SMART version 4.0(http://www.smart.embl-heidelberg.de/)和Interpro: protein sequence analysis & classification(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)預(yù)測推斷氨基酸序列的功能結(jié)構(gòu)域，并用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。利用Clustal W程序和MEGA 6.0程序進(jìn)行基因的多序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。

1.4 qRT-PCR測定基因表達(dá)水平

以不同組織的總RNA為模板，利用PrimeScript?RT Master Mix Perfect Real Time (Takara, Japan)試劑盒反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA(不混樣)，-20 ℃保存。利用在線軟件Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/)設(shè)計熒光定量引物(如表1所示)，以β-tubulin(TUBB)作為內(nèi)參基因[14]，應(yīng)用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒(Takara, Japan)，在Mastercycler?eprealplexReal-Time PCR儀(Eppendorf, Germany)上進(jìn)行熒光定量反應(yīng)，每個反應(yīng)設(shè)定3次技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，57 ℃退伙30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)；并添加熔解曲線，檢驗反應(yīng)產(chǎn)物是否單一。計算PCR 反應(yīng)的效率和相關(guān)系數(shù)R。采用2-△△Ct方法測定目的基因的表達(dá)量。表達(dá)差異分析采用SPSS 17.0單因素方差分析和Duncan檢驗。相對表達(dá)量表示為平均值±平均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean ± SEM)。P<0.05時認(rèn)為差異顯著。

2.3 軟件設(shè)計流程 在完成Bmob后端云服務(wù)器的搭建與配置基礎(chǔ)上，設(shè)計并開發(fā)由線性界面布局、數(shù)據(jù)獲取模塊和數(shù)據(jù)顯示模塊組成的應(yīng)用程序，實現(xiàn)服務(wù)器連接、數(shù)據(jù)庫監(jiān)聽、數(shù)據(jù)獲取、數(shù)據(jù)顯示等一系列流程。昆蟲生境移動監(jiān)測軟件數(shù)據(jù)獲取模塊會實時監(jiān)聽Bmob后端云數(shù)據(jù)庫中的昆蟲生境數(shù)據(jù)的更新狀態(tài)，如果發(fā)生了數(shù)據(jù)的更新，就將新上傳的那條數(shù)據(jù)獲取下來。數(shù)據(jù)獲取模塊獲取到數(shù)據(jù)后就把數(shù)據(jù)交給數(shù)據(jù)顯示模塊，數(shù)據(jù)顯示模塊拿到數(shù)據(jù)后使用SimpleAdapter適配器將昆蟲生境數(shù)據(jù)顯示在ListView視圖上。軟件設(shè)計流程見圖3。

2 結(jié)果

2.1 刺參HDAC3基因全長cDNA克隆及序列分析

刺參HDAC3基因cDNA全長為1885bp，其中包含85 bp的5′ UTR區(qū)域和495 bp的3′ UTR 區(qū)域。該基因開放閱讀框(ORF)長度為 1 305 bp，編碼了434個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為49.7 kD(見圖1)。利用SMART version 4.0預(yù)測刺參HDAC3蛋白的功能結(jié)構(gòu)域見圖1和表2(Genebank序列號：KX066363)，包含1個NL結(jié)構(gòu)域、1個PHD結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域，其中NL參與細(xì)胞分化進(jìn)程，PHD結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白質(zhì)和鋅離子，Hist_deacetyl域是組蛋白脫乙?；D(zhuǎn)移酶的代表功能域。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測如圖2A所示。

(編碼區(qū)用大寫字母表示，3’和5’非編碼區(qū)用小寫字母表示；星號(*)代表終止密碼子；底部為刺參HDAC3功能結(jié)構(gòu)域示意圖。ORF are indicated in uppercase, and 3’UTR and 5’UTR are shown in lowercase. The asterisk indicates the translational termination codon.At the bottom of the page is a schematic diagram of domainsand characteristic motifs of the protein.)

圖1 刺參HDAC3基因結(jié)構(gòu)序列及其編碼的氨基酸序列

2.2 刺參 HDAC3序列同源性與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

序列同源性分析表明，刺參 HDAC3基因序列與紫海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)(XP_794761.1)、密西西比鱷(Alligatormississippiensis)(XP_006265553.1)、矛尾魚(Latimeriachalumnae) (XP_005995391.1)、美國鱟(Limuluspolyphemus)(XP_013784620.1)、舌囊蟲(Saccoglouskowalevskii) (XP_002742058.1)的同源性分別為：84%、74%、75%、74%、80%(見圖3)。其中與紫海膽同源性最高為84%，舌囊蟲次之，與脊椎動物相似性相對較低。

圖2 HDAC3 (A)和HDAC4 (B) 蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

系統(tǒng)進(jìn)化樹(見圖4)分析表明：刺參HDAC3與同屬棘皮動物的海膽(S.purpuratus)同源關(guān)系最為接近，并與鴨嘴海豆芽(Lingulaanatina)、舌囊蟲(Saccoglossuskowalevskii)等無脊椎動物聚在一起，明顯與脊椎動物分為2支。因此，刺參HDAC3的進(jìn)化地位與刺參生物學(xué)分類地位一致。

(黑色代表具有相同的氨基酸，灰色代表具有相近的氨基酸。Identical and similar amino acid residues in all the proteins are indicated by black and grey highlights. Gaps are marked by hyphens. Percent identity of amino acid sequence to sea cucumber HDAC3 is shown at the end. AJ: 仿刺參Apostichopusjaponicus; AM:密西西比短吻鱷Alligatormississippiensis; LC:矛尾魚Latimeriachalumnae; LP:美洲鱟Limuluspolyphemus; SK: 囊舌蟲Saccoglossuskowalevskii; SP: 紫海膽S.purpuratus)

圖3 刺參與其他物種HDAC3序列的同源性比對

Fig.3 Comparison of the amino acid sequence of sea cucumber HDAC3 with HDAC3s from other species

(系統(tǒng)發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的可信度采用1000次重抽樣來檢測，樹形圖分支上的數(shù)字代表其置信值。The tree topology was evaluated by 1,000 bootstrap replications and numbers on each branch of the tree represent the bootstrap support value. Sequences were acquired from GenBank:密西西比短吻鱷(Alligatormississippiensis)，XP_006265553.1；多疣壁虎(Gekkojaponicus)，XP_015266654.1；青綠頂亞馬遜鸚鵡(Amazonaaestiva)，KQK74258.1；白喉帶鹀(Zonotrichiaalbicollis)；XP_005496373.2；家鼠(Musmusculus)，AAF28798.1；智人(Homosapiens)，AAC52038.1；褐家鼠(Rattusnorvegicus)，NP_445900.1；矛尾魚(Latimeriachalumnae)，XP_005995391.1；葉吻銀鮫(Callorhinchusmilii)，XP_007906313.1；斑馬魚(Daniorerio)，NP_957284.1；羅非魚(Oreochromisniloticus)，XP_003451863.1；鴨嘴海豆芽(Lingulaanatina)，XP_013403048.1；囊舌蟲(Saccoglossuskowalevski)i，XP_002742058.1；紫海膽(S.purpuratus)，XP_794761.1.)

圖4 不同物種的HDAC3系統(tǒng)進(jìn)化樹

Fig.4 Consensus neighbor-joining tree based on the sequences of HDAC3 from different species

2.3 刺參HDAC4基因全長 cDNA 克隆及序列分析

刺參HDAC4基因序列全長共3 248 bp，其中包括開放閱讀框ORF3 012 bp，5’UTR區(qū)176 bp，3’UTR區(qū)60 bp，共編碼1 003個氨基酸，預(yù)測蛋白分子量是268.52 kDa(見圖5)。預(yù)測推斷刺參HDAC4的功能結(jié)構(gòu)域，包括2個HDAC4_Gln結(jié)構(gòu)域，2個Hist_deacetyl結(jié)構(gòu)域，1個NEBU結(jié)構(gòu)域，1個PGRP結(jié)構(gòu)域，1個鋅指結(jié)構(gòu)域，1個FTP結(jié)構(gòu)域。其中，HDAC4_Gln結(jié)構(gòu)域富含谷氨酰胺，形成許多螺旋體，與蛋白質(zhì)的可逆性裝配有關(guān)；Hist_deacetyl結(jié)構(gòu)域是組蛋白脫乙?；D(zhuǎn)移酶的代表性功能域，包括了3層二級結(jié)構(gòu)(α螺旋-β折疊-α螺旋)；ZnF_C2C2類結(jié)構(gòu)域代表了在轉(zhuǎn)錄因子TFIIS中的鋅指基序，NEBU為肌動蛋白結(jié)合域；PGRP為鋅離子結(jié)合域，調(diào)節(jié)N—乙酰胞壁酰L—丙氨酸酰氨酶的活性(見圖5和表3)(Genebank序列號: KX066364)。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測如圖2B所示。

表3 刺參HDAC4保守結(jié)構(gòu)域位置

(編碼區(qū)用大寫字母表示，3’和5’非編碼區(qū)用小寫字母表示；星號(*)代表終止密碼子；底部為刺參HDAC4功能結(jié)構(gòu)域示意圖。ORF are indicated in uppercase, and 3’UTR and 5’UTR are shown in lowercase. The asterisk indicates the translational termination；At the bottom of the page is a schematic diagram of domains and characteristic motifs of the protein.)

圖5 刺參HDAC4基因結(jié)構(gòu)序列及其編碼的氨基酸序列

Fig.5 Nucleotide sequence of sea cucumberHDAC4gene and deduced amino acid sequences

2.4 刺參 HDAC4序列同源性與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

(黑色代表具有相同的氨基酸，灰色代表具有相近的氨基酸。Identical and similar amino acid residues in all the proteins are indicated by black and grey highlights. Gaps are marked by hyphens. Percent identity of amino acid sequence to sea cucumber HDAC3 is shown at the end. AJ: 仿刺參(A.japonicus);CC: 胡椒鯛(C.cinctus); OA:O.abietinus; SP：紫海膽(S.purpuratus); VE:切葉蟻(V.emeryi).)

圖6 刺參與其他物種HDAC4序列的同源性比對

Fig.6 Comparison of the amino acid sequence of sea cucumber HDAC4 with HDAC4s from other species

2.5 夏眠不同時期刺參各組織中HDAC1、HDAC3和HDAC4基因的表達(dá)模式

利用qRT-PCR 技術(shù)測定了夏眠不同階段刺參腸道、呼吸樹和肌肉組織中HDAC1、HDAC3和HDAC4基因的表達(dá)模式(如圖8所示)。HDAC1和HDAC3在刺參夏眠的不同階段不同組織內(nèi)均無顯著變化(見圖8a、b)。HDAC4的表達(dá)量在深度夏眠期的腸道組織中顯著增加，當(dāng)夏眠解除時又恢復(fù)到正常水平；呼吸樹組織中HDAC4的表達(dá)量在夏眠不同階段沒有顯著變化；在肌肉組織中，HDAC4表達(dá)量在深度夏眠和夏眠解除時期均顯著升高(見圖8c)。

3 討論

動物進(jìn)入休眠狀態(tài)伴隨著耗能過程的整體抑制，比如轉(zhuǎn)錄和翻譯過程的抑制[15]。我們前期的研究表明在刺參夏眠期間基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的翻譯過程均受到整體的抑制[7, 16]。然而目前關(guān)于乙?；揎椩趧游锵拿咂陂g基因表達(dá)抑制中調(diào)控作用的研究還鮮有報道。

DNA的結(jié)構(gòu)以及在核中的易接近性是決定轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶等蛋白能否結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因素[17]。DNA片斷緊緊包裹著組蛋白核心形成一個致密的結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。組蛋白尾部殘基的乙?；揎棇?dǎo)致緊密纏繞的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，從而促使參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的各種蛋白因子與DNA特異序列結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[18]。本研究重點關(guān)注組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶 (HDACs)在刺參夏眠過程中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式的變化，以期為乙?；揎椩诖虆⑾拿哌^程中的基因表達(dá)的整體調(diào)控中的作用研究奠定基礎(chǔ)。

(系統(tǒng)發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的可信度采用1000次重抽樣來檢測，樹形圖分支上的數(shù)字代表其置信。The tree topology was evaluated by 1,000 bootstrap replications and numbers on eachbranch of the tree represent the bootstrap support value. Sequences were acquired from GenBank:紫海膽(S.purpuratus), XP_011660540.1; 切葉蟻(Vollenhoviaemeryi), XP_011874060.1; 多疣壁虎(Gekkojaponicas), XP_015265702.1;葉吻銀鮫 (Callorhinchusmilii)， XP_007899619.1; 半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)， XP_008316615.1; 錦龜(Chrysemyspictabellii), XP_008160870.1; 鋸蠅(Orussusabietinus)， XP_012285216.1; 綠蜥蜴(Anoliscarolinensis)， XP_008114639.1; 胡椒鯛(Cephuscinctus), XP_015593268.1; 日本鵪鶉(Coturnixjaponica), XP_015742338.1; 火雞(Meleagrisgallopavo), XP_010718850.1; 原雞(Gallusgallus), XP_015155729.1; 佛羅里達(dá)弓背蟻(Camponotusfloridanus), XP_011255713.1.)

圖7 不同物種的HDAC4系統(tǒng)進(jìn)化樹

Fig.7 Consensus neighbor-joining tree based on the sequences of HDAC4 from different species

圖8 夏眠不同時期刺參基因在腸道、呼吸樹和肌肉組織中表達(dá)差異性分析

HDACs共分3個家族:與酵母 Rpd3 同源的I類HDACs，包括 HDAC1、HDAC2、HDAC3、 HDAC8;與酵母Hda1同源的II類HDACs,包括 HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9、HDAC10;與酵母Sir2同源的III類HDACs包括SIRT1～SIRT7。I 類 HDACs主要與Sin3, Mi2, NCoR /SMRT 等因子形成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物,II類HDACs如HDAC4、HDAC5也參與形成NCoR/SMRT轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，目前在大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了Ⅰ類HDACs的表達(dá)，而類HDACs的表達(dá)更為局限，這暗示2類HDACs可能參與不同的細(xì)胞分化和發(fā)育進(jìn)程[19]。

本研究發(fā)現(xiàn)同屬I型的HDAC1和HDAC3在刺參夏眠的不同階段不同組織內(nèi)表達(dá)量均無顯著變化，其中深度夏眠期間HDAC3表達(dá)量在腸道組織中略有所升高，這與王天明等[20]研究結(jié)果中長時間室內(nèi)誘導(dǎo)夏眠(20天以上)刺參腸道組織中該基因表達(dá)量檢測結(jié)果一致。HDAC4表達(dá)量在深度夏眠期腸道和肌肉組織中均保持在較高水平，這與之前在冬眠的十三條紋地松鼠(Ictidomystridecemlineatus)HDAC4的蛋白表達(dá)模式相吻合。Storey等[21]在十三條紋地松鼠冬眠期間的研究表明，在冬眠期間的褐色脂肪組織中，HDAC1和HDAC4的蛋白表達(dá)量分別上調(diào)了1.5和6倍。HDAC1和HDAC3屬于Ⅰ型HDACs，而HDAC4則屬于Ⅱ型a類。Ⅱ型a類HDACs 不同于其他HDACs，其氮末端具有和轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合以招募其靶標(biāo)基因所需的功能域。通常Ⅱ型a類HDACs的表達(dá)具有組織特異性，已有研究表明此類HADCs在哺乳動物的骨骼、心臟、平滑肌、免疫系統(tǒng)、血管系統(tǒng)和腦組織中發(fā)揮了轉(zhuǎn)錄抑制的功能[22]。

HDAC4在動物休眠前后基因或蛋白表達(dá)量的顯著改變提示Ⅱ型HDACs在動物休眠中的特殊作用。研究證實, HDAC4催化序列與Ⅰ類 HDACs相區(qū)別的特征是前者具有一段鋅離子結(jié)合域，可容納2種自分子中心分離的蛋白片段[23]。本研究中對HDAC3和HDAC4功能域的預(yù)測中也有同樣的發(fā)現(xiàn)，我們推測HDAC4的特殊作用可能與這段鋅離子結(jié)構(gòu)有關(guān)，此假設(shè)還有待于今后深入探討。

4 結(jié)論

本文分析了刺參體內(nèi)關(guān)鍵組蛋白脫乙?；傅慕Y(jié)構(gòu)特征及其在刺參夏眠期間的基因表達(dá)模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ⅱ型的HDAC4基因在深度夏眠階段表達(dá)量顯著上升，暗示Ⅱ型HDACs在刺參夏眠基因轉(zhuǎn)錄抑制中具有潛在的特殊調(diào)節(jié)作用。本文為刺參夏眠期間乙酰化在基因表達(dá)中的調(diào)控作用機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

[1] Zhao Y, Yang H, Storey K B, et al. Differential gene expression in the respiratory tree of the sea cucumberApostichopusjaponicusduring aestivation[J]. Mar Genomics, 2014, 18: 173-183.

[2] Rolfe D F, Brown G C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals[J]. Physiol Rev, 1997, 77(3): 731-758.

[3] Ladare K, Storey K. A profile of the metabolic responses to anoxia in marine invertebrate[J]. Cell and Molecular Responses to Stress, 2002，3(2)： 27-46.

[4] Van Breukelen F, Martin S. Reversible depression of transcription during hibernation[J]. J Comp Physiol, 2002, 172(5): 355-361.

[5] Osborne P G, Gao B, Hashimoto M. Determination in vivo of newly synthesized gene expression in hamsters during phases of the hibernation cycle[J]. Jpn J Physiol, 2004, 54(3): 295-305.

[6] Storey K B. Evidence for a reduced transcriptional state during hibernation in ground squirrels[J]. Cryobiology, 2006, 53(3): 310-318.

[7] Zhao Y, Yang H, Storey K B, et al. RNA-seq dependent transcriptional analysis unveils gene expression profile in the intestine of sea cucumberApostichopusjaponicusduring aestivation[J]. Comp Biochem Physiol D, 2014, 10: 30-43.

[8] 李保華, 張衛(wèi)林. 組蛋白乙?；?去乙?；c基因表達(dá)調(diào)控研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 35(18): 5364-5365.

Li B H, Zhang W L. Research Progress in the Histone Acetylation/ Deacetylation and Gene Expression and its Regulation [J]. J Anhui Agri Sci, 2007, 35(18): 5364-5365.

[9] Eberharter A, Becker P B. Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin[J]. EMBO Rep, 2002, 3(3): 224-229.

[10] Orphanides G, Reinberg D. RNA polymerase II elongation through chromatin[J]. Nature, 2000, 407(6803): 471-476.

[11] Storey K B. Evidence for a reduced transcriptional state during hibernation in ground squirrels[J]. Cryobiology, 2006, 53(3): 310-318.

[12] Krivoruchko A, Storey K B. Epigenetics in anoxia tolerance: a role for histone deacetylases[J]. Mol Cell Biochem, 2010, 342(1-2): 151-161.

[13] Yang H, Zhou Y, Zhang T, et al. Metabolic characteristics of sea cucumberApostichopusjaponicus(Selenka) during aestivation[J]. J Exp Mar Bio Ecol, 2006, 330(2): 505-510.

[14] Zhao Y, Chen M, Wang T, et al. Selection of reference genes for qRT-PCR analysis of gene expression in sea cucumberApostichopusjaponicusduring aestivation[J]. Chin J Oceanol Limnol, 2014, 32: 1248-1256.

[15] Storey K B, Storey J M. Metabolic rate depression in animals: transcriptional and translational controls[J]. Biol Rev, 2004, 79(1): 207-233.

[16] Chen M, Li X, Zhu A, et al. Understanding mechanism of sea cucumberApostichopusjaponicusaestivation: Insights from TMT-based proteomic study [J]. Comp Biochem Physiol D, 2016, 19: 78-89.

[17] Kornberg R D, Lorch Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome[J]. Cell, 1999, 98(3): 285-294.

[18] Cheung P, Tanner K G, Cheung W L, et al. Synergistic coupling of histone H3 phosphorylation and acetylation in response to epidermal growth factor stimulation[J]. Mol Cell, 2000, 5(6): 905-915.

[19] De Ruijter A J M, Van Gennip A H, Caron H N, et al. Histone deacetylases (HDACs): characterization of the classical HDAC family[J]. Biochem J, 2003, 370(3): 737-749.

[20] Wang T, Yang H, Zhao H, et al. Transcriptional changes in epigenetic modifiers associated with gene silencing in the intestine of the sea cucumber,Apostichopusjaponicus(Selenka), during aestivation[J]. Chin J Oceanol Limnol, 2011, 29: 1267-1274.

[21] Biggar Y, Storey K B. Global DNA modifications suppress transcription in brown adipose tissue during hibernation[J]. Cryobiology, 2014, 69(2): 333-338.

[22] Parra M. Class IIa HDACs-new insights into their functions in physiology and pathology[J]. FEBS J, 2015, 282(9): 1736-1744.

[23] Bottomley M J, Surdo P L, Di Giovine P, et al. Structural and functional analysis of the human HDAC4 catalytic domain reveals a regulatory structural zinc-binding domain[J]. J Biol Chem, 2008, 283(39): 26694-26704.

責(zé)任編輯 朱寶象

Molecular Cloning of Sea Cucumber Histone Deacetylases (HDACs) Genes and Their Expression Analysis During Aestivation

CHEN Mu-Yan1,2， SUN Rui1,2， HONG Ze-Zhou1,2， ZHU Ai-Jun1,2

(Ocean University of China 1.College of Fisheries； 2.The Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Qingdao 266003， China)

Sea cucumber,ApostichopusjaponicusSelenka, survives high summer temperature by entering into aestivation which is characterized by hypometabolism and global transcriptional depression. We investigated the hypothesis that aestivationis associated with acetylation-dependent epigenetic mechanisms by cloning, sequencing and quantifying the transcripts of important members of histone deacetylases (HDACs) family. The results showed that the deduced amino acid sequences and characteristic motifs of sea cucumber HDAC3 and HDAC4 were highly similar to those of their echinoderms. No significantly variation was observed inHDAC1 andHDAC3 belonging to class I in different tissues of sea cucumber during aestivation. However, the expression ofHDAC4 belonging to class II was significantly up-regulated in intestine and muscle during deep-aestivation.The findings in present study suggested that class II HDACs involved in transcriptional silencing during aestivation.

sea cucumber; histone deacetylase; gene characterization; aestivation; transcriptional depression

國家自然科學(xué)基金項目(31472257)資助

2016-07-18；

2016-09-05

陳慕雁(1979-)，女，副教授。研究方向：無脊椎動物抗逆生理學(xué)。E-mail: chenmuyan@ouc.edu.cn

Q175

A

1672-5174(2016)11-052-10

10.16441/j.cnki.hdxb.20160260

陳慕雁， 孫芮， 洪澤州， 等. 刺參組蛋白脫乙?；D(zhuǎn)移酶基因克隆及其在夏眠期間表達(dá)特征的研究[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2016, 46(11)： 52-61.

CHEN Mu-Yan， SUN Rui， HONG Ze-Zhou, et al. Molecular cloning of sea cucumber histone deacetylases (HDACs) genes and their expression analysis during aestivation[J]. Periodical of Ocean University of China, 2016, 46(11)： 52-61.

Supported by the National Natural Science Foundation of China (31472257)