溫海深， 呂里康， 李蘭敏， 趙 吉， 張思敏

(中國(guó)海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266003)

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急性高溫脅迫對(duì)雄性許氏平鲉血液生理生化及相關(guān)基因表達(dá)的影響*

溫海深， 呂里康， 李蘭敏， 趙 吉， 張思敏

(中國(guó)海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266003)

本文以雄性許氏平鲉(Sebastesschlegelii)為研究對(duì)象，對(duì)急性高溫處理下雄性許氏平鲉的血液生理指標(biāo)及肝臟相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行研究。研究顯示，紅細(xì)胞(RBC)和血紅蛋白(HGB)均呈先增加后減少的趨勢(shì)，白細(xì)胞(WBC)在實(shí)驗(yàn)中增加顯著(P<0.05)；同時(shí)急性高溫處理后，血清皮質(zhì)醇(COR)、血清葡萄糖(GLU)和蛋白水平發(fā)生顯著變化(P<0.05)，GLU出現(xiàn)與血細(xì)胞相似的變化規(guī)律，COR在整個(gè)處理過(guò)程中均顯著增加(P<0.05)；血清蛋白水平整體顯著下降(P<0.05)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(GPT)和天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(GOT)在處理2、6 h后顯著升高(P<0.05)；HSP70 mRNA表達(dá)水平在2和6 h后顯著升高(P<0.05)；甲狀腺激素水平在高溫處理下顯著下降(P<0.05)；TRα和TRβmRNA表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。研究結(jié)果表明，在急性高溫處理下雄性許氏平鲉處于脅迫狀態(tài)，其血液生理生化指標(biāo)和肝臟相關(guān)基因表達(dá)受高溫影響顯著。

許氏平鲉；血液生理生化；HSP70；甲狀腺激素；甲狀腺激素受體；高溫脅迫

魚(yú)類(lèi)屬變溫動(dòng)物，它的生長(zhǎng)繁衍與溫度、光照、紫外、氣壓等氣候因子有密切關(guān)系，其中溫度是魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)發(fā)育最重要的氣候因子。水溫影響著魚(yú)類(lèi)的攝食、生長(zhǎng)、免疫和生殖等活動(dòng)，具有多方面生態(tài)作用[1]。不同溫度下，魚(yú)類(lèi)的各項(xiàng)生理指標(biāo)具有顯著差異，而血液與魚(yú)類(lèi)機(jī)體代謝、生殖繁育等密切相關(guān)，可作為反映魚(yú)體生理和健康狀況的重要指標(biāo)。徐革峰[2]等對(duì)不同溫度條件下運(yùn)動(dòng)和攝食對(duì)細(xì)鱗鮭(Brachymystaxlenok)幼魚(yú)代謝模式的研究結(jié)果表明，在一定溫度范圍條件下，細(xì)鱗鮭幼魚(yú)的最大代謝率是由運(yùn)動(dòng)與攝食共同誘導(dǎo)產(chǎn)生的。此外，溫度對(duì)魚(yú)類(lèi)的繁殖進(jìn)程也是息息相關(guān)的，劉永新等[3]對(duì)紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)的研究發(fā)現(xiàn)低溫能夠有效提高紅鰭東方鲀家系雄性個(gè)體的比例。

許多研究表明，溫度對(duì)魚(yú)類(lèi)免疫機(jī)能也有顯著影響。對(duì)羅非魚(yú)(Oreochromisaureus)，鱈魚(yú)(GadusmorhuaL.)和黑鱸(Dicenttrarchuslabrax)的研究發(fā)現(xiàn)，適宜的溫度范圍，血清中免疫球蛋白的活性隨溫度的升高而增強(qiáng)[4-5]。低溫能夠使羅非魚(yú)白細(xì)胞的吞噬活性顯著降低，并且會(huì)抑制虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的噬菌活化因子的分泌[6]。高溫脅迫使尼羅羅非魚(yú)血液和肝臟生化指標(biāo)及肝臟熱休克蛋白(Heat shock protein 70，HSP70)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了顯著變化，這表明，溫度脅迫顯著影響了魚(yú)體的免疫機(jī)能[7]。

許氏平鲉(Sebastesschlegelii)隸屬于硬骨魚(yú)綱(Osteichthyes)鲉形目(Scorpaeniformes)鲉科(Scorpaenidae)平鲉屬(Sebastes)，原名黑鮶，俗稱(chēng)“黑頭”、“黑寨魚(yú)”、“黑石鱸”等，是一種廣泛分布于西北太平洋近海暖溫性魚(yú)類(lèi)。由于其肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，生長(zhǎng)快速且抗病能力強(qiáng)，成為北方沿海人工養(yǎng)殖的重要品種之一。其生存溫度范圍較廣(5～28 ℃)，生長(zhǎng)適宜溫度18～24 ℃。目前在全球變暖的大背景下，黃海北部的海域水溫波動(dòng)劇烈且晝夜溫差急劇擴(kuò)大，對(duì)網(wǎng)箱養(yǎng)殖許氏平鲉造成嚴(yán)重的影響。本研究旨從生理水平和代謝水平探究許氏平鲉對(duì)高溫脅迫的免疫反應(yīng)和應(yīng)激效應(yīng)，為許氏平鲉的人工養(yǎng)殖提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)魚(yú)類(lèi)

實(shí)驗(yàn)雄魚(yú)于2014年11月購(gòu)買(mǎi)自山東省海陽(yáng)市沿海網(wǎng)箱養(yǎng)殖群體。挑選30尾健康無(wú)病，發(fā)育良好的雄性許氏平鲉(體質(zhì)量：(406.9±41.5) g，體長(zhǎng)：(24.3±1.3) cm)，實(shí)驗(yàn)前于5個(gè)0.5 m3圓柱形塑料桶(直徑80 cm,深100 cm)中暫養(yǎng)2天。暫養(yǎng)期間每天換水2次，停止投喂；連續(xù)充氣，溫度為(17±1) ℃；pH 7.8～8.1；溶氧(7.22±0.59) mg/L；模擬自然光周期14L∶10D光照。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前隨機(jī)取6尾魚(yú)作為0 h組。設(shè)置17 ℃(室溫對(duì)照)、27 ℃ 2個(gè)溫度梯度，每個(gè)溫度梯度設(shè)置2個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3尾魚(yú)。將暫養(yǎng)后的實(shí)驗(yàn)魚(yú)隨機(jī)放入設(shè)置好溫度的實(shí)驗(yàn)水體中進(jìn)行急性高溫脅迫，持續(xù)進(jìn)行6 h。

1.3 樣品采集和處理

分別在急性高溫脅迫0 h和脅迫2、6 h后對(duì)實(shí)驗(yàn)魚(yú)進(jìn)行取樣，0 h一次性取6尾魚(yú)，2、6 h時(shí)每組每次分別隨機(jī)取6尾魚(yú)。將隨機(jī)選取的實(shí)驗(yàn)魚(yú)放入加有MS-222(200 mg/L)的海水中進(jìn)行麻醉，尾靜脈取血部分制成抗凝血，4 ℃保存，待測(cè)血液生理指標(biāo)；部分制取血清，保存于-80 ℃?zhèn)溆茫脕?lái)測(cè)定血液生化指標(biāo)及激素水平。另采集肝臟組織，置于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 血液樣本分析

血液生理指標(biāo)采用BS-1800全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀(邁瑞，深圳)進(jìn)行分析，包括紅細(xì)胞(Red blood cell，RBC)、白細(xì)胞(White blood cell，WBC)、血紅蛋白(Hemoglobin，HGB)。

采用BS-180全自動(dòng)生化分析儀(邁瑞，深圳)及相配套的試劑盒，對(duì)血清中血糖(Glucose，GLU)，總蛋白(Total protein，TP)，白蛋白(Albumin，ALB)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Glutamate pyruvic transaminase，GPT)和天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Glutamic oxaloacetic transaminase，GOT)的活力測(cè)定和分析。

使用碘125皮質(zhì)醇放射免疫分析試劑盒(九鼎，天津)，采用RIA液相平衡競(jìng)爭(zhēng)放射性免疫分析法進(jìn)行血清皮質(zhì)醇(Cortisol，COR)、游離三碘甲腺原氨酸(Free thyroxine 3，F(xiàn)T3)和游離甲狀腺素(Free thyroxine 4，F(xiàn)T4)水平的測(cè)定。

1.5 肝臟中HSP70表達(dá)水平分析

1.5.1 特異性表達(dá)引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Mu等[8]的研究成果在NCBI中獲得許氏平鲉HSP70mRNA(KC172645.1)的序列，使用Primer5.0、Oligo6.69和DNAMAN6.0等軟件設(shè)計(jì)HSP70的特異性表達(dá)引物(見(jiàn)表1)。引物由華大基因Oligo合成進(jìn)行合成。

表1 基因表達(dá)分析的特異性引物

1.5.2 總RNA的提取 總RNA提取按照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)相應(yīng)的步驟進(jìn)行提取，將提取后的總RNA用核酸測(cè)定儀測(cè)定每個(gè)樣品的濃度，以備反轉(zhuǎn)錄。同時(shí)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。

1.5.3 去除基因組DNA和反轉(zhuǎn)錄 去除基因組DNA并將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)驗(yàn)使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒(TAKARA，日本)。

1.5.4HSP70 mRNA相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè) 檢測(cè)過(guò)程在StepOnePlusTMReal-Time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems,美國(guó))上進(jìn)行，檢測(cè)過(guò)程中使用SYBR? Premix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus)試劑盒(TAKARA，日本)。實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)體系如表2所示。

表2 PCR反應(yīng)體系

實(shí)時(shí)定量PCR的上機(jī)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；溶解曲線生成：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，一個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因，根據(jù)2-△△CT方法計(jì)算得到HSP70mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 肝臟中TRα和TRβmRNA表達(dá)的水平的分析測(cè)定方法

總RNA的提取、純化、反轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平的檢測(cè)同1.5。

特異性引物的設(shè)計(jì)根據(jù)NCBI中獲得許氏平鲉TRαmRNA(JQ409563.1)和TRβmRNA(JQ409564.1)的序列，使用Primer5.0、Oligo6.69和DNAMAN6.0等軟件設(shè)計(jì)HSP70的特異性表達(dá)引物如表3。引物由華大基因Oligo合成進(jìn)行合成。

表3 基因表達(dá)分析的特異性引物

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，在假定方差齊性的條件下，作Turkey-HSD多重比較分析，探究同溫度間或不同時(shí)間點(diǎn)間各指標(biāo)數(shù)據(jù)的差異顯著性(若不滿(mǎn)足方差齊性，采用Games-Howell法)；在P<0.05時(shí)為差異顯著，所得數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示。

2 結(jié)果

2.1 急性高溫脅迫對(duì)雄性許氏平鲉血液生理指標(biāo)的影響

急性高溫脅迫后，雄性許氏平鲉血液生理指標(biāo)紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)和白細(xì)胞(WBC)的變化水平如圖1所示。由圖1可知，在脅迫2 h后，RBC數(shù)量與對(duì)照組相比有顯著性升高(P<0.05)；6 h后，魚(yú)體內(nèi)RBC數(shù)量與2 h相比呈顯著下降趨勢(shì)(P<0.05)(見(jiàn)圖1A)。雄魚(yú)體內(nèi)HGB的變化情況與RBC相似，2 h后，高溫脅迫魚(yú)體內(nèi)的HGB顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，并在6 h后顯著下降(P<0.05)(見(jiàn)圖1B)。此外，雄性許氏平鲉血液中WBC的數(shù)量也隨時(shí)間呈顯著性變化，其中，2 h實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組顯著增加(P<0.05)(見(jiàn)圖1C)。

2.2急性高溫脅迫對(duì)雄性許氏平鲉血液生化指標(biāo)的影響

2.2.1急性高溫脅迫對(duì)雄性許氏平鲉血清葡萄糖和皮質(zhì)醇水平的影響 急性高溫脅迫后，雄性許氏平鲉血清葡萄糖(GLU)和皮質(zhì)醇(COR)變化水平如圖2所示。由圖2可知，脅迫2 h后血清GLU實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組有增加趨勢(shì)，而在6 h后，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，并且實(shí)驗(yàn)組在6 h時(shí)，GLU水平只有2 h的1/4。與此同時(shí)，在6 h后對(duì)照組雄魚(yú)的血清GLU水平較0和2 h顯著下降(P<0.05)(見(jiàn)圖2A)。血清COR在急性高溫脅迫后顯著增加(P<0.05)，在2h時(shí)增至對(duì)照組的1.78倍，6 h時(shí)增至對(duì)照組的2.2倍。但在同一溫度不同時(shí)間點(diǎn)之間沒(méi)有顯著性的變化(P>0.05)(見(jiàn)圖2B)。

(圖中標(biāo)注的大寫(xiě)字母表示同一時(shí)間點(diǎn)不同溫度間存在顯著性差異(P<0.05)，小寫(xiě)字母表示同一溫度不同時(shí)間點(diǎn)間存在顯著性差異(P<0.05)。Different capital letters indicate significant differences(P<0.05)at different temperatures of the same time point and different small letters indicate significant differences (P<0.05) in different time points of the same temperature in Tukey-HSD multiple range test.)

圖1 急性高溫脅迫對(duì)雄性許氏平鲉RBC(A)、HGB(B)和WBC(C)水平的影響

Fig.1 Effect of acute high temperature stress on red blood cell(A)，hemoglobin(B) and white blood cell(C) levels in maleSebastesschlegelii

(圖中標(biāo)注的大寫(xiě)字母表示同一時(shí)間點(diǎn)不同溫度間存在顯著性差異(P<0.05)，小寫(xiě)字母表示同一溫度不同時(shí)間點(diǎn)間存在顯著性差異(P<0.05)。Different capital letters indicate significant differences(P<0.05)at different temperatures of the same time point and different small letters indicate significant differences (P<0.05) in different time points of the same temperature in Tukey-HSD multiple range test.)

圖2 急性溫度脅迫對(duì)雄性許氏平鲉GLU(A)和COR(B)水平的影響

Fig.2 Effect of acute high temperature stress on serum glucose(A) and cortisol(B) levels in maleSebastesschlegelii

2.2.2 急性高溫脅迫對(duì)雄性許氏平鲉血清蛋白水平的影響 急性高溫脅迫對(duì)雄性許氏平鲉總蛋白(TP)和白蛋白(ALB)水平的影響如圖3所示。由圖3可知，TP在6 h時(shí)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組存在顯著性差異(P<0.05)(見(jiàn)圖3A)，而ALB在2和6 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比都顯著性下降(P<0.05)(見(jiàn)圖3B)。

2.2.3 急性高溫脅迫對(duì)雄性許氏平鲉血清轉(zhuǎn)氨酶活性的影響 急性高溫脅迫對(duì)雄性許氏平鲉血清轉(zhuǎn)氨酶水平的影響如圖4所示。由圖4可知，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(GPT)和天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(GOT)在脅迫2、6 h后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比顯著性升高(P<0.05)，但同一溫度不同時(shí)間點(diǎn)之間各組沒(méi)有出現(xiàn)顯著性的變化。

(圖中標(biāo)注的大寫(xiě)字母表示同一時(shí)間點(diǎn)不同溫度間存在顯著性差異(P<0.05)，小寫(xiě)字母表示同一溫度不同時(shí)間點(diǎn)間存在20顯著性差異(P<0.05)。Different capital letters indicate significant differences (P<0.05) at different temperatures of the same time point and different small letters indicate significant differences (P<0.05) in different time points of the same temperature in Tukey-HSD multiple range test.)

圖3 急性高溫脅迫對(duì)雄性許氏平鲉血清TP(A)和ALB(B)水平的影響

Fig.3 Effect of acute high temperature stress on serum total protein(A) and albumin(B) levels in maleSebastesschlegelii

(圖中標(biāo)注的大寫(xiě)字母表示同一時(shí)間點(diǎn)不同溫度間存在顯著性差異(P<0.05)，小寫(xiě)字母表示同一溫度不同時(shí)間點(diǎn)間存在顯著性差異(P<0.05)。Different capital letters indicate significant differences (P<0.05) at different temperatures of the same time point and different small letters indicate significant differences (P<0.05) in different time points of the same temperature in Tukey-HSD multiple range test.)

圖4 急性高溫脅迫對(duì)雄性許氏平鲉血清GPT(A)和GOT(B)活力的影響

Fig.4 Effect of acute high temperature stress on serumglutamic-pyruvic transaminase (A) and glutamic-oxaloacetic transaminase (B) activities in maleSebastesschlegelii

2.3 急性高溫脅迫對(duì)雄性許氏平鲉肝臟HSP70 mRNA的影響

急性高溫脅迫對(duì)雄性許氏平鲉肝臟HSP70 mRNA的影響如圖5所示。由圖5可知，雄性許氏平鲉肝臟中HSP70 mRNA的表達(dá)水平在2和6 h較對(duì)照組都出現(xiàn)了顯著性升高(P<0.05)，并且在脅迫2 h時(shí)升高幅度最為顯著，為對(duì)照組的5.08倍。但經(jīng)過(guò)4 h后出現(xiàn)顯著下降變化(P<0.05)。

2.4 高溫脅迫對(duì)雄性許氏平鲉甲狀腺激素水平的影響

急性高溫脅迫對(duì)雄性許氏平鲉甲狀腺激素水平的影響如圖6所示。由圖6可知，脅迫后雄性許氏平鲉的甲狀腺激素水平隨溫度和時(shí)間均出現(xiàn)了顯著性變化。FT3在脅迫6h后迅速降低，并與對(duì)照組出現(xiàn)了顯著性差異(P<0.05)，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組在脅迫2～6 h的過(guò)程中，F(xiàn)T3水平也顯著下降(P<0.05)(見(jiàn)圖6A)；雄魚(yú)FT4水平在脅迫下出現(xiàn)下降趨勢(shì)，并在2 h時(shí)較對(duì)照組顯著下降(P<0.05)(見(jiàn)圖6B)。

(圖中標(biāo)注的大寫(xiě)字母表示同一時(shí)間點(diǎn)不同溫度間存在顯著性差異(P<0.05)，小寫(xiě)字母表示同一溫度不同時(shí)間點(diǎn)間存在顯著性差異(P<0.05)。Different capital letters indicate significant differences (P<0.05) at different temperatures of the same time point and different small letters indicate significant differences (P<0.05) in different time points of the same temperature in Tukey-HSD multiple range test.)

圖5 急性高溫脅迫對(duì)雄性許氏平鲉肝臟HSP70 mRNA表達(dá)水平的影響

Fig.5 Effect of acute high temperature stress on expression levels ofHSP70 mRNAs in liver of maleSebastesschlegelii

急性高溫脅迫對(duì)雄性許氏平鲉肝臟中TRα和TRβmRNA表達(dá)水平的影響如圖7所示。由圖7可知，急性高溫脅迫后雄性許氏平鲉TRα和TRβmRNA的表達(dá)水平都呈下降趨勢(shì)。雄魚(yú)TRαmRNA的表達(dá)量只在2 h實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組顯著下降(P<0.05)(見(jiàn)圖7A)，而TRβmRNA的表達(dá)量在2和6 h實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組都顯著下降(P<0.05)(見(jiàn)圖7B)。

3 討論

3.1 急性高溫脅迫對(duì)雄性許氏平鲉血液生理生化指標(biāo)的影響

紅細(xì)胞(RBC)是血液中最主要的成分，主要功能是攜帶和運(yùn)輸氧氣，以滿(mǎn)足機(jī)體生理活動(dòng)和運(yùn)動(dòng)的需要。血紅蛋白(HGB)是血液中承擔(dān)運(yùn)輸氧氣的直接載體。RBC和HGB的數(shù)量與魚(yú)類(lèi)的呼吸、運(yùn)動(dòng)、代謝和生態(tài)等都有著密切的關(guān)系。在14、19和23 ℃ 3個(gè)梯度下，虹鱒紅細(xì)胞數(shù)量隨水溫上升而減少，鳙魚(yú)(Aristichlhysnobilis)紅細(xì)胞數(shù)量卻是隨水溫上升而增加[9]。本實(shí)驗(yàn)中，雄性許氏平鲉在急性高溫脅迫后，RBC和HGB呈先上升后下降的趨勢(shì)，說(shuō)明水溫升高，機(jī)體需要增加呼吸量和代謝率維持新陳代謝和穩(wěn)態(tài)，從而增加紅細(xì)胞數(shù)量以增強(qiáng)攜氧能力。白細(xì)胞(WBC)作為魚(yú)類(lèi)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的重要成分，主要作用是保護(hù)機(jī)體抵御外部和內(nèi)部的傷害。本實(shí)驗(yàn)中雄魚(yú)在2 h時(shí)WBC數(shù)量顯著增加是機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)高溫脅迫應(yīng)答的結(jié)果。

(圖中標(biāo)注的大寫(xiě)字母表示同一時(shí)間點(diǎn)不同溫度間存在顯著性差異(P<0.05)，小寫(xiě)字母表示同一溫度不同時(shí)間點(diǎn)間存在顯著性差異(P<0.05)。Different capital letters indicate significant differences (P<0.05) at different temperatures of the same time point and different small letters indicate significant differences (P<0.05) in different time points of the same temperature in Tukey-HSD multiple range test.)

圖6 急性高溫脅迫對(duì)雄性許氏平鲉血清FT3(A)和FT4(B)水平的影響

Fig.6 Effect of acute high temperature stress on serumfreetriiodothyronine(A)and free thyroxine (B)of maleSebastesschlegelii

(圖中標(biāo)注的大寫(xiě)字母表示同一時(shí)間點(diǎn)不同溫度間存在顯著性差異(P<0.05)，小寫(xiě)字母表示同一溫度不同時(shí)間點(diǎn)間存在顯著性差異(P<0.05)。Different capital letters indicate significant differences(P<0.05)at different temperatures of the same time point and different small letters indicate significant differences (P<0.05) in different time points of the same temperature in Tukey-HSD multiple range test.)

圖7 急性高溫脅迫對(duì)雄性許氏平鲉肝臟TRα(A)和TRβ(B)mRNA表達(dá)水平的影響

Fig.7 Effect of acute high temperature stress on expression levels ofTRα(A)andTRβ(B)mRNAs in liver of maleSebastesschlegelii

血清葡萄糖(GLU)作為直接能源物質(zhì)可以為機(jī)體的各項(xiàng)生命活動(dòng)提供能量。血清皮質(zhì)醇(COR)濃度的升高可被看作是魚(yú)類(lèi)應(yīng)激的靈敏信號(hào)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)魚(yú)類(lèi)處于溫度脅迫狀態(tài)時(shí)，血清GLU和COR有上升趨勢(shì)[10]；對(duì)羅非魚(yú)進(jìn)行高溫處理，結(jié)果顯示血糖含量顯著上升[11]；對(duì)吉富品系尼羅羅非魚(yú)和斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)的研究發(fā)現(xiàn)，低溫有助于皮質(zhì)醇的增加[7]。本實(shí)驗(yàn)中COR水平在受到脅迫時(shí)迅速增加，這是溫度急劇變化刺激魚(yú)類(lèi)下丘腦-垂體-腎間組織軸作用的結(jié)果。COR還可加強(qiáng)肝臟中糖異生作用，維持血糖水平穩(wěn)定[12]。因此GLU的增加既是能量代謝加快的需要也是機(jī)體對(duì)外界刺激的響應(yīng)。在本實(shí)驗(yàn)中GLU在2 h顯著高于0和6 h，是高溫條件下魚(yú)體能量消耗增加和COR對(duì)其調(diào)節(jié)的結(jié)果。

蛋白質(zhì)是血清的主要組成部分?？偟鞍?TP)具有維持血液正常膠體滲透壓，維持pH值恒定的作用，參與脂肪酸、固醇等物質(zhì)運(yùn)輸并與免疫功能相關(guān)；血清白蛋白(ALB)是機(jī)體重要的免疫蛋白，與魚(yú)體的抗病及環(huán)境適應(yīng)能力有著密切的關(guān)系。鯽(Carassiusauratus)在9～25 ℃水溫范圍內(nèi)，TP、ALB隨水溫上升而上升，并在25 ℃時(shí)達(dá)到最大值，而超過(guò)25 ℃后，TP、ALB含量均隨水溫升高而下降[13]。對(duì)團(tuán)頭魴高溫應(yīng)激的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)TP和ALB出現(xiàn)顯著下降[10]。本研究中，TP和ALB均出現(xiàn)顯著下降，這是因?yàn)樵诟邷孛{迫下，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生大量皮質(zhì)醇影響機(jī)體的物質(zhì)代謝和免疫系統(tǒng)，加速蛋白的分解。研究表明，動(dòng)物應(yīng)激過(guò)程中神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)功能的變化對(duì)免疫機(jī)制有抑制作用[14]，而ALB與機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)，在脅迫2h時(shí)顯著下降，這可能是魚(yú)類(lèi)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)造成的。

3.2 急性高溫脅迫對(duì)雄性許氏平鲉肝臟代謝和HSP70mRNA的影響

轉(zhuǎn)氨酶在氨基酸代謝及蛋白質(zhì)、脂肪和糖類(lèi)相互轉(zhuǎn)化的進(jìn)程中意義重大[15]，其中谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(GPT)和天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(GOT)是很重要的兩種轉(zhuǎn)氨酶。研究顯示，虹鱒GPT活性隨水溫上升而升高，GOT活性隨水溫上升先上升后下降；鳙魚(yú)GPT酶活性隨水溫上升先略有升高后快速下降，GOT活性隨水溫上升略有下降[9]。血清GOT和GPT活力的變化被認(rèn)為是心臟和肝臟受損的重要標(biāo)志[16]。本研究中，雄性許氏平鲉轉(zhuǎn)氨酶活力在脅迫后迅速升高，并持續(xù)到脅迫6 h，這與何福林[17]等對(duì)虹鱒的研究結(jié)果類(lèi)似。對(duì)虹鱒和鳙魚(yú)的研究還發(fā)現(xiàn)，GOT和GPT在達(dá)到峰值后出現(xiàn)了下降，但是本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有得出這一結(jié)果，這可能與實(shí)驗(yàn)脅迫時(shí)間較短，GOT和GPT在肝臟中的合成還未受到影響有關(guān)。

HSP70是HSPs家族重要成員之一，作為分子伴侶在調(diào)節(jié)、修復(fù)和降解變性蛋白質(zhì)方面起重要作用，可以清除應(yīng)激所造成細(xì)胞內(nèi)異?；虻鞍踪|(zhì)變性[18]。研究表明，溫度脅迫可以誘導(dǎo)HSP70在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)，降低溫度脅迫對(duì)機(jī)體的傷害。對(duì)團(tuán)頭魴進(jìn)行高溫(34 ℃)脅迫發(fā)現(xiàn)，脅迫過(guò)程中肝臟HSP70 mRNA水平先升高后下降，說(shuō)明該基因的表達(dá)受熱應(yīng)激的調(diào)控[19]；強(qiáng)俊等[7]研究了急性溫度脅迫下尼羅羅非魚(yú)肝臟HSP70 mRNA表達(dá)的變化，結(jié)果表明21和31 ℃應(yīng)激組在6h時(shí)，HSP70 mRNA表達(dá)量達(dá)到對(duì)照組的1.7和1.6倍。本實(shí)驗(yàn)中HSP70 mRNA表達(dá)水平在受到高溫脅迫后急速增加，并在2 h達(dá)到對(duì)照組的5.08倍。這是許氏平鲉通過(guò)增加HSP70表達(dá)量以適應(yīng)高溫的結(jié)果，進(jìn)一步說(shuō)明了HSP70 mRNA的表達(dá)受到溫度調(diào)控。經(jīng)過(guò)6 h，HSP70 mRNA表達(dá)水平始終顯著高于對(duì)照組，沒(méi)有出現(xiàn)上述實(shí)驗(yàn)中的下降變化，這是因?yàn)槊{迫時(shí)間較短，HSP70對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用還在其閾值范圍內(nèi)，或者HSP70還未從細(xì)胞中流失。對(duì)此需要做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探究。

3.3 高溫脅迫對(duì)雄性許氏平鲉甲狀腺激素水平的影響

面對(duì)環(huán)境脅迫，魚(yú)類(lèi)的神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)會(huì)做出應(yīng)激反應(yīng)，達(dá)到防御、自身穩(wěn)定與免疫監(jiān)督的作用，從而穩(wěn)定機(jī)體內(nèi)環(huán)境。其中下丘腦-垂體-甲狀腺(HPT)軸在整個(gè)應(yīng)激過(guò)程中起到了重要的作用[20]。

甲狀腺激素(FTH)是維持血脂正常代謝的重要激素之一[21]，主要為三碘甲狀腺原氨酸(FT3)和甲狀腺素(FT4)。甲狀腺激素中FT3在魚(yú)體內(nèi)代謝比FT4要快許多，所以FT3在一定程度上更能代表甲狀腺的功能。已有研究報(bào)道，低溫可以使羅非魚(yú)的血清FT3水平升高[22]；劉群等[23]研究發(fā)現(xiàn)隨著養(yǎng)殖密度增加，F(xiàn)T3和FT4的含量逐漸降低。本研究中，T3和T4水平在27 ℃下都顯著下降，說(shuō)明此溫度已經(jīng)超過(guò)許氏平鲉的適溫范圍?？偟膩?lái)看，甲狀腺激素水平的降低，是魚(yú)類(lèi)降低機(jī)體基礎(chǔ)代謝，減少產(chǎn)熱和散熱，減少能量損耗的結(jié)果。這對(duì)魚(yú)體面對(duì)高溫脅迫提高其免疫力具有重要意義，是魚(yú)類(lèi)對(duì)水溫升高的適應(yīng)性變化。

甲狀腺激素受體(TRs)是一類(lèi)受體激活型轉(zhuǎn)錄因子[24]。研究表明，甲狀腺激素產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)都是通過(guò)甲狀腺激素受體介導(dǎo)的[25]，通過(guò)與其受體進(jìn)行結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，以此發(fā)揮其生物學(xué)作用。許多研究表明，THs在魚(yú)類(lèi)早期生長(zhǎng)發(fā)育及繁殖過(guò)程中起到重要的調(diào)控作用[26]，并且在免疫應(yīng)答方面也具有重要的作用。本研究中，雄性許氏平鲉的TRα和TRβmRNA經(jīng)過(guò)高溫脅迫后表達(dá)水平均顯著下降。TRα和TRβmRNA表達(dá)水平的下降與T3和T4含量的相一致，可以看出這兩者之間是呈正相關(guān)的。急性高溫脅迫使許氏平鲉TRα和TRβmRNA的表達(dá)水平降低，影響了甲狀腺軸的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)。

急性高溫脅迫影響了許氏平鲉HPT軸的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)功能，使TRα和TRβmRNA的表達(dá)水平下降，因此導(dǎo)致血清FT3和FT4含量也出現(xiàn)下降，而甲狀腺激素對(duì)血清脂類(lèi)的代謝調(diào)節(jié)及魚(yú)類(lèi)本身對(duì)能量需求的調(diào)節(jié)使TG和TC最終也表現(xiàn)為顯著下降。

4 結(jié)論

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，全球變暖的大背景下，海水水溫的異常升高將導(dǎo)致許氏平鲉機(jī)體出現(xiàn)應(yīng)激。應(yīng)激狀態(tài)下，魚(yú)體代謝水平上升，原本用于生長(zhǎng)的能量被大量消耗[27]。因此，養(yǎng)殖實(shí)踐中應(yīng)選擇合適的養(yǎng)殖區(qū)域(水溫：18～24 ℃)，避免許氏平鲉在高溫海水中因應(yīng)激而出現(xiàn)的機(jī)體損傷或免疫水平下降。

[1] 許友卿, 曹占旺, 丁兆坤, 等. 高溫對(duì)魚(yú)類(lèi)的影響及其預(yù)防研究 [J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2010, 29: 235-242.

XU You-qing, CAO Zhan-wang, DING Zhao-kun, et al. Effects and prevention of high temperature on fishes[J]. Fisheries Science, 2010, 29: 235-242.

[2] 徐革鋒, 王裕玉, 韓英, 等. 不同溫度條件下運(yùn)動(dòng)和攝食對(duì)細(xì)鱗鮭幼魚(yú)代謝模式的影響 [J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2014, 25: 1156-1162.

XU Ge-feng, WANG Yu-yu, HAN Ying, et al. Effect of locomotion and feeding on metabolic mode of juvenile lenok,Brachymystaxlenok(Pallas) under different water temperatures[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2014, 25: 1156-1162.

[3] 劉永新, 周勤, 張紅濤, 等. 溫度對(duì)紅鰭東方鲀?cè)缙谏L(zhǎng)和性別分化的影響 [J]. 南方水產(chǎn)科學(xué), 2014(5): 24-29.

LIU Yong-xin, ZHOU Qin, ZHANG Hong-tao, et al. Effect of temperature on growth and sex differentiation at early developmental stage of redfin puffer (Takifugurubripes)[J]. South China Fisheries Science, 2014(5): 24-29.

[4] Chen W H, Sun L T, Tsai C L, et al. Cold-Stress induced the modulation of catecholamines, cortisol, immunoglobulin m, and leukocyte phagocytosis in tilapia [J]. General & Comparative Endocrinology, 2002, 126: 90-100.

[5] Magnadóttir B, Jónsdóttir H, Helgason S, et al. Immune parameters of immunised cod (Gadusmorhua L.) [J]. Fish & Shellfish Immunology, 2001, 11: 75-89.

[6] Hardie L J, Fletcher T C, Secombes C J. Effect of temperature on macrophage activation and the production of macrophage activating factor by rainbow trout (Oncorhynchusmykiss) leucocytes [J]. Developmental & Comparative Immunology, 1994, 18: 57-66.

[7] 強(qiáng)俊, 楊弘, 王輝, 等. 急性溫度應(yīng)激對(duì)吉富品系尼羅羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)幼魚(yú)生化指標(biāo)和肝臟HSP70mRNA表達(dá)的影響 [J]. 海洋與湖沼, 2012, 43: 943-953.

QIANG Jun, YANG Hong, WANG Hui, et al. The effect of acute temperature stress on biochemical indices and expression of liverHSP70 mRNA in GIFT nile tilapia juveniles (Oreochromisniloticus) [J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2012, 43: 943-953.

[8] Mu W, Wen H, Li J, et al. Cloning and expression analysis of a HSP70 gene from Korean rockfish (Sebastesschlegelii)[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2013, 35(4): 1111-1121.

[9] 向建國(guó), 何福林. 水溫影響虹鱒紅細(xì)胞數(shù)量變化的初步研究 [J]. 當(dāng)代水產(chǎn), 2006, 31: 37-38.

Xiang Jian-guo, He Fu-lin. Preliminary study on temperature affect red blood cell count changes on rainbow trout [J]. Current Fisheries, 2006, 31: 37-38.

[10] 劉波. 高溫應(yīng)激與大黃蒽醌提取物對(duì)團(tuán)頭魴生理反應(yīng)及相關(guān)應(yīng)激蛋白表達(dá)的影響[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

Liu Bo. Effects of High Temperature Stress and Anthraquinone Extract fromRheumofficinaleBail on the Physiological Response and Gene Expression of Heat Shock Protein of Wuchang Bream (MegalobYamaamblycephala) [D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2012.

[11] 彭婷, 胡庭俊, 林勇, 等. 低溫脅迫對(duì)羅非魚(yú)血液生化、免疫及抗氧化指標(biāo)的影響 [J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2012, 31: 259-263.

Peng Ting, Hu Ting-jun, Lin Yong, et al. Effects of low temperature stress on indices of biochemistry, immunity and antioxidation in nile tilapia [J]. Fisheries Science, 2012, 31: 259-263.

[12] Snedecor J G, King D B, Henrikson R C. Studies on the chick glycogen body: Effects of hormones and normal glycogen turnover [J]. General & Comparative Endocrinology, 1963, 3: 176-183.

[13] 韓京成, 劉國(guó)勇, 梅朋森, 等. 溫度對(duì)鯽血液生化指標(biāo)和消化酶的影響 [J]. 水生態(tài)學(xué)雜志, 2010(1):87-92.

Han Jing-cheng, Liu Guo-yong, Mei Peng-sen, et al. Effects of temperature on the hematological indices and digestive enzyme activities of Crucian carp (Carassiusauratus)[J]. Journal of Hydroecology, 2010(1):87-92.

[14] 馬文濤, 楊來(lái)啟, 林玉梅, 等. 應(yīng)激對(duì)大鼠血清皮質(zhì)醇及白細(xì)胞介素2、6、8水平的影響 [J]. 中國(guó)心理衛(wèi)生雜志, 2002, 16: 14-15.

Ma Wen-tao, Yang Lai-qi, Lin Yu-mei, et al. Effects of stress on serum interleukin 2, 6, 8 and cortisol levels in rats [J]. Chinese Mental Health Journal, 2002, 16: 14-15.

[15] 劉偉, 李佐鋒. 溫度對(duì)鏈鳙魚(yú)生理生化指標(biāo)的影響 [J]. 東北師大學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 1996(2): 108-112.

Liu Wei, Li Zuo-feng. Effeets of temperatures on the physiological and bioehemical index of silver carp and bighead carp [J]. Journal of Northeast Normal University(Natural Science Edition), 1996(2): 108-112.

[16] 張桂蘭. 虹鱒魚(yú)血液學(xué)指標(biāo)的測(cè)定 [J]. 水產(chǎn)學(xué)雜志, 1991,4(2): 80-84.

Zhang Gui-lan. Determination of hematological indices of rainbow trout [J]. Chinese Journal of Fisheries, 1991,4(2): 80-84.

[17] 何福林, 向建國(guó), 李常健, 等. 水溫對(duì)虹鱒血液學(xué)指標(biāo)影響的初步研究 [J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2007, 31: 363-369.

He Fu-lin, Xiang Jian-guo, Li Chang-jian, et al. Preliminary study on the effect of water temperature on hematology indices of Rainbow trout [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2007, 31: 363-369.

[18] Encomio V G, Chu F L. Heat shock protein (hsp70) expression and thermal tolerance in sublethally heat-shocked eastern oysters Crassostreavirginica infected with the parasite Perkinsusmarinus [J]. Diseases of Aquatic Organisms, 2007, 76: 251-260.

[19] 明建華, 謝駿, 劉波, 等. 團(tuán)頭魴HSP70 cDNA的克隆、序列分析以及熱應(yīng)激對(duì)其mRNA表達(dá)的影響 [J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2009, 16: 635-648.

Ming Jian-hua, Xie Jun, Liu Bo, et al. Cloning, sequence analysis ofHSP70 cDNA and effects of heat stress on its mRNA expression inMegalobramaamblycephala[J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2009, 16: 635-648.

[20] 邊原, 李剛, 楊勇, 等. 甲狀腺激素在免疫應(yīng)答方面的研究進(jìn)展 [J]. 實(shí)用藥物與臨床, 2015, 18: 219-222.

Bian Yuan, Li Gang, Yang Yong, et al. Research progress of thyroid hormone upon immune response [J]. Practical Pharmacy and Clinical Remedies, 2015, 18: 219-222.

[21] Duntas L H. Thyroid disease and lipids [J]. Thyroid Official Journal of the American Thyroid Association, 2002, 12: 287-293.

[22] 劉波, 王美垚, 謝駿, 等. 低溫應(yīng)激對(duì)吉富羅非魚(yú)血清生化指標(biāo)及肝臟HSP70基因表達(dá)的影響 [J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2011, 31: 4866-4873.

Liu Bo, Wang Mei-yao, Xie Jun, et al. Effects of acute cold stress on serum biochemical and immune parameters and liver HSP70 gene expression in GIFT strain of Nile tilapia (Oreochromisniloticus) [J]. Acta Ecologica Sinica, 2011, 31: 4866-4873.

[23] 劉群, 溫海深, 李吉方, 等. 網(wǎng)箱養(yǎng)殖密度對(duì)虹鱒甲狀腺激素及血脂指標(biāo)的影響 [J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2014, 38: 1076-1083.

Liu Qun, Wen Hai-shen, Li Ji-fang, et al. Effects of different stocking density on the levels of thyrioid hormone and plasma lipids inoncorhynchusmykiss[J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2014, 38: 1076-1083.

[24] Yen P M, Ando S, Xu F, et al. Thyroid hormone action at the cellular, genomic and target gene levels [J]. Molecular & Cellular Endocrinology, 2006, 246: 121-127.

[25] 張俊玲, 施志儀. 牙鲆早期階段的變態(tài)發(fā)育及其機(jī)制 [J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2003, 12: 348-352.

Zhang Jun-ling, Shi Zhi-yi. Metamorphosis and mechanism during early development of Japanese flounder,Paralichthysolivaceus[J]. Journal of Shanghai Ocean University, 2003, 12: 348-352.

[26] 張曉娜, 田華, 汝少?lài)?guó). 魚(yú)類(lèi)甲狀腺軸對(duì)胚胎發(fā)育、仔魚(yú)變態(tài)及性別分化的調(diào)控作用研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2012(S1): 94-101.

Zhang Xiao-na, Tian Hua, Ru Shao-guo. Advances in piscine thyroidal axis and its regulatory effects on embryogenesis, metamorphosis and sex differentiation [J]. Periodical of Ocean University of China, 2012(S1): 94-101.

[27] Andrade T, Afonso A, Pérez-Jiménez A, et al. Evaluation of different stocking densities in a Senegalese sole (Soleasenegalensis) farm: implications for growth, humoral immune parameters and oxidative status[J]. Aquaculture, 2015, 438: 6-11.

責(zé)任編輯 朱寶象

Effect of Temperature on Physiological and Biochemical Parameters and Gene Expression of MaleSebastesschlegelii

WEN Hai-Shen, LV Li-Kang, LI Lan-Min, ZHAO Ji, ZHANG Si-Min

(The Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

In this study, we took the male black rockfish (Sebastesschlegelii) as the research object. Physiological and biochemical parameters of this species and the expressions of its related liver genes were detected after acute temperature treat. The results showed that RBC and HGB first increased and then decreased; and WBC increased significantly(P<0.05). At the same time, serum cortisol (COR), serum glucose (GLU) and protein contents changed significantly after acute heat treat (P<0.05). GLU had varied similarly with the blood cells while COR significantly increased throughout the whole process (P<0.05) and serum protein content tended to decrease overall(P<0.05). The activity of alanine aminotransferase (GPT) and aspartate aminotransferase (GOT) significantly elevated at 2 h and 6 h after acute heat treat (P<0.05). After the acute heat shock, the abundance ofHSP70 mRNA increased significantly at 2 h and 6 h in male black rockfish (P<0.05). The level of thyroid hormone showed a downward trend as well. Lipid level changed similarly to thyroid hormone but showed a significant change as the temperature and time went by. The abundance ofTRαandTRβmRNA decreased significantly after acute heat treat (P<0.05). The male black rockfish was in stress state after acute heat treat, its physiological and physiological parameters and liver gene expression were affected by high temperature.

Sebastesschlegelii; hematological physiology; HSP70; thyroid hormone; thyroid hormone receptor; heat shock

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41476110)資助

2016-06-30；

2016-08-19

溫海深(1963-),男,教授,研究方向:魚(yú)類(lèi)生理與繁育。E-mail: wenhaishen@ouc.edu.cn

S917.4

A

1672-5174(2016)11-044-08

10.16441/j.cnki.hdxb.20160241

溫海深， 呂里康， 李蘭敏， 等. 急性高溫脅迫對(duì)雄性許氏平鲉血液生理生化及相關(guān)基因表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2016, 46(11): 44-51.

WEN Hai-Shen, LV Li-Kang, LI Lan-Min, et al. Effect of temperature on physiological and biochemical parameters and gene expression of maleSebastesschlegelii[J]. Periodical of Ocean University of China, 2016, 46(11): 44-51.

Supported by the National Natural Science Foundation of China(41476110)