陳誠(chéng)廣西中醫(yī)學(xué)校530023南寧市東葛路61號(hào)王柳萍辛華廣西中醫(yī)藥大學(xué)530001

桑椹的質(zhì)量分析方法研究

陳誠(chéng)廣西中醫(yī)學(xué)校530023南寧市東葛路61號(hào)王柳萍辛華*廣西中醫(yī)藥大學(xué)530001

目的：建立桑椹藥材的質(zhì)量分析方法。方法：采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定桑椹藥材中的白藜蘆醇和蘆丁含量；采用改良后pH示差分光光度法測(cè)定桑椹花色苷的含量；采用薄層色譜法對(duì)桑椹進(jìn)行理化鑒別。結(jié)果：10批白藜蘆醇含量為0～0.0143mg/g，蘆丁含量為0.2922～2.3680mg/g，花色苷含量為0～21.11mg/g；薄層色譜供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜及對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，專屬性良好。結(jié)論：本研究建立的質(zhì)量分析方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可為桑椹的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

桑椹；白藜蘆醇；蘆丁；花色苷；HPLC；薄層色譜；光譜鑒別

桑椹為?？浦参锷５墓?，是藥食同源類中藥，具有滋陰補(bǔ)血、生津潤(rùn)燥的功效。目前，《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版關(guān)于桑椹藥材的質(zhì)量控制項(xiàng)目尚無(wú)專屬性強(qiáng)的薄層鑒別及含量測(cè)定項(xiàng)目。為了更好地控制藥材的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)在前期研究［1］的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步建立桑椹藥材薄層色譜鑒別方法，并采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定桑椹藥材中白藜蘆醇和蘆丁的含量，采用改良后pH示差分光光度法測(cè)定桑椹花色苷的含量，旨為桑椹藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1　儀器與試藥

1.1儀器Agilent 1200高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫）；BP211D電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；LG16-W型高速離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）；KQ5200E型超聲波清洗儀（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；雷磁pHS-3C精密pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；Agilent 8453紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)安捷倫）。

1.2試藥桑椹藥材樣品共10批，經(jīng)廣西蠶業(yè)技術(shù)推廣總站朱方容研究員鑒定為?？粕僦参飶V東桑Morus atropurpurea Roxb.的果穗，經(jīng)低溫干燥后置于干燥器中，備用。桑椹對(duì)照藥材（批號(hào)121158-200602），購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；白藜蘆醇（批號(hào)111535-2 00502）、蘆?。ㄅ?hào)100080-200707），均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用；乙腈（色譜純）；薄層層析硅膠G（青島海洋化工有限公司）；甲醇、CMC-Na、乙酸乙酯、甲酸、三氯化鋁（國(guó)藥集團(tuán)），實(shí)驗(yàn)用水（娃哈哈）。

2　方法與結(jié)果

2.1蘆丁、白藜蘆醇的含量測(cè)定

采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定。

2.1.1色譜條件色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm× 4.6 mm，5μm），Phenomenex KJO 4282保護(hù)柱；流動(dòng)相：乙腈-水，采用梯度洗脫程序，0 min（12∶88）～13 min（12∶88）～16 min（19∶81），后運(yùn)行5 min；流速：1.0 m l/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：306 nm；柱溫：35℃。

2.1.2對(duì)照品溶液的制備分別取白藜蘆醇對(duì)照品和蘆丁對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 m l含白藜蘆醇0.033 mg、蘆丁1.353mg的混合溶液，即得。

2.1.3供試品溶液的制備取桑椹藥材粉末（過(guò)三號(hào)篩）約0.2 g，精密稱定，置于50m l具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10m l，稱定重量，超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）10 min，冷卻，再稱定重量，用原提取溶液補(bǔ)足減失的重量，10 000轉(zhuǎn)/分鐘高速離心10 min，取上清液作為供試品溶液。

精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白溶劑各10μl，按2.1.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，空白溶劑、對(duì)照品及供試品色譜圖見(jiàn)圖1。

2.1.4線性關(guān)系考察精密吸取上述混合對(duì)照品溶液適量，稀釋5倍、10倍、25倍、50倍、100倍，分別取上述6個(gè)不同濃度的混合對(duì)照品溶液各10μl注入高效液相色譜儀測(cè)定，以對(duì)照品濃度（mg/m l）為橫坐標(biāo)，峰面積（Area）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。白藜蘆醇：Y=43788.3X-1.3，r= 1.0000，線性范圍為0.33～33.00mg/L；蘆?。篩=8 599.3X-41.1，r=0.99992，線性范圍為13.53～1 353.00 mg/L。

2.1.5精密度試驗(yàn)精密吸取同一混合對(duì)照品溶液10μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定白藜蘆醇和蘆丁的峰面積，其RSD分別為1.11%和0.38%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.1.6重復(fù)性試驗(yàn)取6份同一批次桑椹樣品粉末0.2 g，精密稱定，按供試品溶液的制備方法制備，進(jìn)樣10μl測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。白藜蘆醇和蘆丁含量的RSD分別為1.95%和1.56%，結(jié)果表明樣品重復(fù)性良好。

2.1.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，分別于制備后0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、18 h、24 h進(jìn)樣10μl測(cè)定，白藜蘆醇和蘆丁含量的RSD分別為1.72%和0.50%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8加樣回收率試驗(yàn)分別取已知含量的桑椹樣品粉末6份，每份0.1 g，精密稱定，分別加入適量對(duì)照品，按照供試品溶液制備方法制備，測(cè)定含量后計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示白藜蘆醇和蘆丁的加樣回收率分別為100.8%、102.2%，RSD分別為2.3%、1.8%。表明該方法同時(shí)測(cè)定蘆丁和白藜蘆醇含量的準(zhǔn)確性較好。

2.1.9樣品含量測(cè)定取10批不同產(chǎn)地的藥材，按照上述“供試品溶液的制備”方法制備樣品溶液，進(jìn)樣10μl測(cè)定峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2花色苷的含量測(cè)定采用pH示差分光光度法進(jìn)行測(cè)定。

2.2.1緩沖溶液的配制醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH4.5）：取醋酸鈉18 g，加冰醋酸9.8 ml，再加水稀釋至1 000 m l，即得［2］。鹽酸-氯化鉀緩沖液（pH1.0）：移取250 m l 0.2mol/LKCl溶液，670m l0.2mol/L HCl溶液，稀釋至1 000ml［3］，即得。

圖1　 HPLC色譜圖

表1　白藜蘆醇和蘆丁含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

2.2.2供試原液的制備取已干燥備用的桑椹粉末（過(guò)三號(hào)篩）約0.2 g，精密稱定，置于50 ml具塞錐形瓶中，精密加入2%HCl甲醇溶液10m l，稱定重量，超聲（功率200W，頻率40 kHz）處理40 min，放冷，再稱定重量，用2%HCl甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，精密加入10 ml蒸餾水，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試原液。

2.2.3供試品溶液的制備精密吸取2份供試原液各1 m l，分別用鹽酸-氯化鉀緩沖液（pH1.0）和醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH4.5）定容至10 m l，搖勻，平衡50 min，即得供試品溶液。用蒸餾水做空白，分別測(cè)定兩種供試液（pH1.0和pH4.5）在最大吸收波長(zhǎng)（514 nm）和參比波長(zhǎng)處（700 nm）的吸光度值，色譜圖見(jiàn)圖2。測(cè)定3次取平均值，按照經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算含量［4］。在pH1.0時(shí)，桑椹花色苷以紅色的2-苯基苯并吡喃的形式存在，吸收很大；pH=4.5時(shí)，則以無(wú)色假堿式花色苷的形式存在，沒(méi)有吸收。

A=（Amax-A700）pH1.0-（Amax-A700）pH4.5；C（mg/ml）=（A×M×DF）/（a×L）；花色苷含量（mg/g）=（C×V）/m；式中：C為花色苷的質(zhì)量濃度，A為吸光度；M為分子量，桑椹花色苷以矢車菊素-3-葡萄糖苷計(jì)算（C21H21O11），其分子量為449.2；DF為稀釋倍數(shù)；a為消光系數(shù)，26 900；L為光程：1.0；V為溶劑體積；m為取樣量。

2.2.4樣品含量測(cè)定分別稱取不同批次的桑椹藥材粉末，一式3份，按“供試原液的制備”方法制備樣品溶液，再按上述方法進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算含量。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3薄層鑒別

2.3.1供試品、對(duì)照藥材、對(duì)照品溶液的制備稱取不同批次桑椹粉末（過(guò)三號(hào)篩）0.2 g，加甲醇10m l，加熱回流30 min，趁熱過(guò)濾，濾液濃縮至1ml，作為供試品溶液。另取桑椹對(duì)照藥材0.2 g，同法制備對(duì)照藥材溶液。再取蘆丁對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

圖2　桑椹pH示差分光光譜圖（A為吸光度差值）

表2　花色苷含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

2.3.2 TLC鑒別方法照《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版薄層色譜法（附錄VIB）［2］進(jìn)行試驗(yàn)，將硅膠G按1∶2.7的比例與0.7% CMC-Na混合，研磨均勻，鋪板（20 cm×10 cm），陰干，105℃活化30 min，置干燥器中保存?zhèn)溆?。分別吸取上述三種溶液各2μl，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（8∶1∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，晾干，待乙醇揮干后，在105℃加熱5 min，取出，置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜及對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖3。

3　討論

3.1在HPLC測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，對(duì)蘆丁、白藜蘆醇對(duì)照品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，蘆丁有3個(gè)吸收峰，分別為206 nm、257 nm、358 nm，白藜蘆醇有2個(gè)吸收峰，分別為217 nm、306 nm。由于樣品中白藜蘆醇的含量較低，必須優(yōu)先提高其靈敏度，故選擇306 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。預(yù)試驗(yàn)中曾對(duì)乙腈-水洗脫系統(tǒng)和甲醇-水洗脫系統(tǒng)、等度洗脫和梯度洗脫都進(jìn)行了考察對(duì)比。結(jié)果甲醇-水洗脫系統(tǒng)出峰晚，溶劑消耗大，用時(shí)長(zhǎng)，且峰型差；等度洗脫保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，峰變寬；梯度洗脫比等度洗脫節(jié)省溶劑和時(shí)間，出峰良好，分離度高。結(jié)果選擇以乙腈-水洗脫系統(tǒng)為流動(dòng)相，并采用梯度洗脫。

3.2國(guó)內(nèi)外有關(guān)桑椹花色苷含量測(cè)定的參考文獻(xiàn)中多以桑椹鮮果、桑椹酒、桑椹提取物或者是經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂純化過(guò)的桑椹紅色素作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，而未見(jiàn)直接用干燥后的桑椹藥材作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用pH示差分光光度法測(cè)定花色苷的含量，在樣品前處理上稍做改進(jìn)，采用兩步稀釋法。由于花色苷易溶于水，所以溶劑提取后，在過(guò)濾前先加入定量的蒸餾水將醇相稀釋，放出熱量，再過(guò)濾除去析出的干擾物質(zhì)。這樣處理后，既可以避免在容量瓶中產(chǎn)生大量的熱，又可以提前除去析出的干擾物質(zhì)，稀釋后的待測(cè)溶液澄清、透明，無(wú)白色渾濁干擾，能滿足測(cè)定要求。在平衡時(shí)間的考察方面，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)每隔5 min測(cè)定一次吸光度值，最后確定平衡時(shí)間為50min，并經(jīng)過(guò)多批樣品測(cè)定，重復(fù)性很好。此外，由于花色苷的光穩(wěn)定性很差，所以整個(gè)操作過(guò)程都要注意避光。

3.3在薄層色譜鑒定實(shí)驗(yàn)中，對(duì)蘆丁的提取方法、展開(kāi)劑的選擇、濕度、顯色方法等進(jìn)行考察。

3.3.1蘆丁的提取方法加入甲醇分別以超聲30min和回流30min兩種方式進(jìn)行提取，結(jié)果顯示回流方法提取效果較超聲提取好。其主要原因是蘆丁難溶于冷水，而在沸甲醇中的溶解度（1∶7）較大。

3.3.2展開(kāi)劑的選擇在實(shí)驗(yàn)中曾對(duì)比過(guò)乙酸乙酯-甲酸-水、三氯甲烷-甲醇、三氯甲烷-丙酮、丙酮-甲醇等展開(kāi)劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以乙酸乙酯-甲酸-水（8∶1∶1）為展開(kāi)劑最好，斑點(diǎn)分離較好且清晰，位置適宜，其Rf值在0.5左右。

3.3.3濕度對(duì)展開(kāi)效果的影響在相同的色譜條件下，濕度大于85%的環(huán)境下展開(kāi)效果較差，斑點(diǎn)的清晰度不夠，甚至觀察不到斑點(diǎn)。因此，應(yīng)把濕度控制在85%以下。

3.3.4顯色方法的選擇在相同色譜條件下，分別用氨熏和三氯化鋁乙醇溶液進(jìn)行顯色，比較了兩種不同的顯色方法。結(jié)果氨熏后在對(duì)應(yīng)位置上，日光下可見(jiàn)淡黃色斑點(diǎn)，斑點(diǎn)較清晰，但短時(shí)間內(nèi)斑點(diǎn)顏色變淺，不易觀察，且紫外（365 nm）下在相應(yīng)位置未觀察到熒光斑點(diǎn)。而噴以三氯化鋁乙醇溶液，待乙醇揮干之后，在日光下隱約可見(jiàn)淡黃色斑點(diǎn)，置紫外燈（365 nm）下可見(jiàn)淡黃色斑點(diǎn)但不夠清晰。若在烘箱中105℃干燥5 min后于再置紫外燈（365 nm）下觀察可在相應(yīng)位置明顯看到到黃色熒光斑點(diǎn)。因此，采取噴以三氯化鋁后，105℃干燥5 min的顯色方法較好，能觀察到明顯斑點(diǎn)。

圖3　桑椹薄層色譜圖

［1］陳誠(chéng)，李洪波，楊欣，等.中藥桑椹活性物質(zhì)的研究進(jìn)展［J］.中藥材，2010，33（10）：1660-1662.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄68-71；附錄110.

［3］全國(guó)化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)化學(xué)試劑分會(huì).GB/T 604-2002.化學(xué)試劑酸堿指示劑pH變色域測(cè)定通用方法［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2002：50.

［4］Lee J，Durst R W，Wrolstad R E.Determination of totalmonomeric anthocyanin pigment content of fruit Juices，beverages，natural colorants，and wines by the pH differentialmethod：collaborative study［J］.Journal of AOAC international，2005，88（5）：1269-1278.

（2016-09-13收稿/編輯陳明偉）

R284.1

A

1003-0719（2016）05-0076-04

廣西衛(wèi)生廳醫(yī)療衛(wèi)生重點(diǎn)科研課題（編號(hào)：重2010092）

，副教授，研究方向：中藥商品質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究；E-mail：1004605269@qq.com