王夢(mèng)，梁婧，侯海燕，董渠龍，陳亞瓊

·論著·

五味子乙素對(duì)BaP致HTR-8/SVneo侵襲力損傷的保護(hù)

王夢(mèng)，梁婧，侯海燕，董渠龍，陳亞瓊

目的：以人絨毛膜外滋養(yǎng)層細(xì)胞（human trophoblastHTR-8/SVneo，簡(jiǎn)稱HTR）細(xì)胞株為研究載體，研究五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）對(duì)苯并芘（benzo［a］pyrene，BaP）致HTR細(xì)胞侵襲力損傷的影響。方法：實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、BaP染毒組、不同濃度Sch B（0.5，1，2μmol/L）干預(yù)染毒組，通過(guò)新型四唑化合物（MTS）法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，明確BaP染毒及Sch B干預(yù)劑量；通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BaP染毒后以及Sch B干預(yù)后細(xì)胞侵襲力的改變。結(jié)果：①M(fèi)TS檢測(cè)細(xì)胞增殖情況：與對(duì)照組相比，20μmol/L濃度BaP作用后細(xì)胞增殖明顯下降（P＜0.01），不同濃度Sch B（0.5，1，2μmol/L）干預(yù)后細(xì)胞增殖情況優(yōu)于BaP染毒組（P＜0.05）。②Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：與對(duì)照組相比，BaP染毒組細(xì)胞侵襲力明顯下降（P＜0.01），不同濃度Sch B干預(yù)組細(xì)胞侵襲力也呈下降趨勢(shì)（P＜0.05）；與BaP染毒組相比，Sch B干預(yù)組細(xì)胞侵襲力明顯提升（P＜0.05）。結(jié)論：一定濃度的BaP會(huì)對(duì)HTR的細(xì)胞增殖及侵襲力造成損傷，Sch B可以預(yù)防BaP對(duì)HTR細(xì)胞增殖造成的損傷，同時(shí)提高細(xì)胞侵襲力。

五味子屬；苯并芘；細(xì)胞增殖；滋養(yǎng)層細(xì)胞

苯并芘（benzo［a］pyrene，BaP）作為多環(huán)芳烴類(lèi)化合物（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）中的典型代表，普遍存在于日常生活中［1-2］，其生殖毒性已被證實(shí)，目前關(guān)注的熱點(diǎn)是其對(duì)早期胚胎發(fā)育的影響。早期胚胎植入過(guò)程中的關(guān)鍵步驟是滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)子宮內(nèi)膜的侵入，故本研究從BaP對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲力造成損傷的角度出發(fā)，探討傳統(tǒng)中藥是否可以預(yù)防BaP對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲力造成的損傷。既往研究顯示五味子在保胎護(hù)胎的方劑中起著重要作用，五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）作為五味子中的重要活性成分，普遍應(yīng)用于現(xiàn)代臨床研究中。本研究選取人絨毛膜外滋養(yǎng)層細(xì)胞（human trophoblastHTR-8/SVneo，簡(jiǎn)稱HTR）為實(shí)驗(yàn)載體，在BaP損傷滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲力的同時(shí)，明確Sch B是否可以改善和預(yù)防BaP對(duì)細(xì)胞侵襲力造成的損傷。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品HTR細(xì)胞株由加拿大Graham Professor惠贈(zèng)。Sch B（中國(guó)藥品生物制品檢定所），分子質(zhì)量400.46 ku，微溶于水，純度≥99%，體外實(shí)驗(yàn)用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide DMSO）配制。BaP（美國(guó)Sigma公司），分子質(zhì)量252.31 ku，不溶于水，純度≥99%，體外實(shí)驗(yàn)用DMSO配制。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、0.125%胰蛋白酶、DMSO溶劑（美國(guó)Gibco公司），0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，天津市廣成化學(xué)試劑有限公司），MTS試劑盒（Promega北京生物技術(shù)有限公司）、Transwell小室（Chemicon公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HTR8-SVneo細(xì)胞接種于96孔板中，每孔200μL（密度5.0×103個(gè)/mL）含10%胎牛血清、100U/mL青霉素的RPMI1640的培養(yǎng)液，在37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.3.2 新型四唑化合物（MTS）法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況①取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞104個(gè)/mL接種于96孔板內(nèi)培養(yǎng)，分別檢測(cè)BaP染毒濃度（2，5，10，20，50μmol/L），以及Sch B（0.5，1，2，5，10 μmol/L）干預(yù)濃度，之后選取合適濃度檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。②最終實(shí)驗(yàn)分5組，對(duì)照組：不給予任何處理；BaP染毒組：20 μmol/L BaP（24 h）；Sch B低劑量組：0.5μmol/LSch B（48 h）+ 20μmol/LBaP（24 h）；Sch B中劑量組：1μmol/LSch B（48 h）+ 20μmol/LBaP（24 h）；Sch B高劑量組：2μmol/LSch B（48 h）+ 20μmol/LBaP（24 h）。③將MTS與培養(yǎng)基按照1∶5的比例配置好，吸棄96孔板培養(yǎng)基，每孔加入20μLMTS試劑及100μL完全培養(yǎng)基，并設(shè)有調(diào)零組，置于37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)150min。④用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm條件下的光密度值（OD），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按公式：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值）×100%，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.3.3 HTR細(xì)胞侵襲力的檢測(cè)應(yīng)用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲力，實(shí)驗(yàn)選取直徑為65mm，孔徑大小為8μm的Transwell小室，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)分6組，對(duì)照組：不給予任何處理；DMSO溶劑組：200μL 0.1%DMSO培養(yǎng)液；BaP染毒組：20μmol/L BaP；Sch B低劑量組：0.5μmol/L Sch B+20μmol/LBaP；Sch B中劑量組：1μmol/LSch B+20μmol/L BaP；Sch B高劑量組：2μmol/LSch B+20μmol/LBaP。①水化基底膜，將小室放入24孔板中，在上室加入300μL預(yù)溫的無(wú)血清培養(yǎng)基，室溫下靜置30min，使基質(zhì)膠再水化，之后再吸去培養(yǎng)基。②制備細(xì)胞懸液，先將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞無(wú)血清饑餓培養(yǎng)24 h，消化離心后，加入不同培養(yǎng)液配制細(xì)胞懸液，最終將細(xì)胞濃度消化調(diào)整為1.0×105個(gè)/mL。③接種細(xì)胞，在培養(yǎng)板中加500μL含10%胎牛血清（fetalbovine serum，F(xiàn)BS）的完全培養(yǎng)基，同時(shí)各組取200μL細(xì)胞懸液種植于小室內(nèi)在37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，之后取出培養(yǎng)板，棄去各組培養(yǎng)液。④固定染色，用棉簽擦去未穿透基底膜的基質(zhì)膠上和小室內(nèi)的細(xì)胞，反復(fù)用PBS沖洗，再加入500μL著色劑至空閑的24孔板中，將小室放入有著色劑的孔中20 min。⑤計(jì)數(shù)細(xì)胞，將小室放入燒杯中用水清洗數(shù)次，后將小室風(fēng)干。在顯微鏡下，每孔隨機(jī)選取4個(gè)非重疊視野照相，人工計(jì)數(shù)后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。定量資料滿足正態(tài)分布用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，2組間的比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTS檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

2.1.1 BaP染毒濃度與對(duì)照組相比，HTR-8/SVneo在各濃度BaP作用24 h后細(xì)胞增殖明顯下降，隨著B(niǎo)aP濃度的不斷增大，細(xì)胞增殖不斷下降（P＜0.05），在20μmol/L濃度作用時(shí)細(xì)胞增殖降低最明顯（P＜0.01），但隨著B(niǎo)aP濃度的進(jìn)一步增加，當(dāng)濃度達(dá)到50μmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖情況并未持續(xù)下降（P＜0.05），最終選取BaP染毒濃度為20μmol/L。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度BaP處理HTR細(xì)胞后細(xì)胞存活率

2.1.2 Sch B干預(yù)濃度與對(duì)照組相比，HTR-8/ SVneo在Sch B各濃度作用6 h后，隨著Sch B濃度不斷增大，細(xì)胞增殖沒(méi)有明顯變化（P＞0.05），直到濃度達(dá)到10μmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖有所下降（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

2.1.3 Sch B干預(yù)BaP染毒細(xì)胞與單純BaP染毒模型比較，HTR-8/SVneo在不同濃度Sch B（0.5，1，2 μmol/L）干預(yù)后，細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)（P＜0.05），隨著濃度的增大，細(xì)胞增殖能力也增加。與對(duì)照組比較，不同濃度Sch B干預(yù)后細(xì)胞增殖有所下降（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖2 不同濃度Sch B處理HTR細(xì)胞后細(xì)胞存活率

圖3 不同濃度Sch B+BaP處理HTR細(xì)胞后細(xì)胞存活率

2.2 HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲力的檢測(cè)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，DMSO溶劑組侵襲力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；BaP染毒組侵襲力明顯下降（P＜0.01），不同濃度Sch B作用細(xì)胞后，細(xì)胞侵襲力也有所下降（P＜0.05）；與BaP染毒組比較，不同濃度Sch B干預(yù)組作用細(xì)胞后，細(xì)胞侵襲力明顯增強(qiáng)（P＜0.05），隨著濃度的增加，侵襲力也隨之增強(qiáng)，見(jiàn)圖4和圖5。

3 討論

在BaP生殖毒性的相關(guān)研究中，妊娠早期胚胎發(fā)育過(guò)程對(duì)環(huán)境有害物質(zhì)BaP最為敏感［3］。在妊娠早期，最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)就是胚胎著床，而確保胚胎是否能成功著床的關(guān)鍵因素是絨毛膜外滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)子宮內(nèi)膜的適度侵襲，滋養(yǎng)層細(xì)胞過(guò)度的侵入會(huì)導(dǎo)致多種妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病（如絨毛膜癌、葡萄胎）的發(fā)生，而侵入不足則會(huì)造成自然流產(chǎn)、胎兒生長(zhǎng)受限、子癇前期等疾?。?-5］。因此研究BaP對(duì)早期胚胎著床過(guò)程中滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力的影響及其可能的保護(hù)因素具有重要的意義，既往的研究表明BaP與滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲力的降低有關(guān)［6］。

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HTR-8/SVneo細(xì)胞模型侵襲力（×100）

圖5 不同濃度Sch B+BaP處理HTR細(xì)胞后細(xì)胞侵襲力

中醫(yī)在女性生殖健康中有其獨(dú)特的治療優(yōu)勢(shì)，五味子是臨床常用的滋補(bǔ)固澀類(lèi)中藥，歸肺、心、腎經(jīng)。而大多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為滑胎也就是西醫(yī)學(xué)稱復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，多是由腎虛導(dǎo)致的。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎是生命之根，先天之本，腎主藏精，精能化氣，腎精所化之氣，即為腎氣。腎精的盛衰，始終影響著整個(gè)孕期，而且也是能否受孕的關(guān)鍵。若腎氣虧損，便不能固攝胎元而致流產(chǎn)。又因女子以肝為本，五味子能補(bǔ)肝腎之氣，肝脈既能得腎氣之溫煦，腎精也能得肝血之滋養(yǎng)。因此推斷五味子可通過(guò)補(bǔ)腎精來(lái)達(dá)到保胎固胎的效果。

而現(xiàn)代研究表明，五味子中的藥用成分主要是木脂素［7］，Sch B又是五味子木脂素的主要活性成分之一［8］。同時(shí)有多項(xiàng)研究顯示Sch B具有保肝、抗氧化、抗腫瘤的作用［9-11］，其可以影響腫瘤細(xì)胞的侵襲力［12］，腫瘤細(xì)胞的侵襲過(guò)程與胚胎早期人絨毛膜外滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)子宮內(nèi)膜的侵襲十分相似，因此推測(cè)Sch B可以預(yù)防BaP對(duì)細(xì)胞侵襲力的影響，從而達(dá)到對(duì)早期胚胎的保護(hù)作用。

為了明確BaP對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲力的損傷，首先要選取BaP染毒濃度，明確其對(duì)細(xì)胞增殖的影響，也就是對(duì)細(xì)胞存活率的影響。本研究采用MTS實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)BaP對(duì)細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)HTR細(xì)胞在BaP作用24 h后，隨著染毒濃度的增加，細(xì)胞存活率明顯下降，說(shuō)明兩者存在劑量依賴性，吳念等［13］的研究與本研究結(jié)果一致，當(dāng)濃度達(dá)到20μmol/L時(shí)，BaP對(duì)細(xì)胞增殖抑制最明顯，但當(dāng)濃度升至50 μmol/L時(shí)，BaP對(duì)細(xì)胞損傷并沒(méi)有持續(xù)下降，考慮可能是因?yàn)锽aP的溶解性引起濃度過(guò)大而產(chǎn)生沉淀，導(dǎo)致高濃度BaP并未直接作用于細(xì)胞，故其并未影響到細(xì)胞的增殖情況。

在明確BaP對(duì)HTR細(xì)胞存活率有損傷后，本研究應(yīng)用MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Sch B單獨(dú)作用后細(xì)胞增殖情況，同時(shí)進(jìn)一步為實(shí)驗(yàn)確定干預(yù)濃度。在檢測(cè)Sch B藥物本身對(duì)細(xì)胞增殖情況的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，一定濃度內(nèi)的Sch B作用細(xì)胞后，細(xì)胞增殖情況未見(jiàn)明顯改變，而當(dāng)濃度達(dá)到10μmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖出現(xiàn)下降，說(shuō)明其降低了細(xì)胞存活率，因此提示高濃度的Sch B不僅不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生增殖作用，反而對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用。

本研究選取低、中、高（0.5，1，2μmol/L）3個(gè)Sch B濃度作用于BaP染毒后HTR細(xì)胞模型，用MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各濃度作用后細(xì)胞存活率，與對(duì)照組比較，單純?nèi)径窘M與藥物干預(yù)組細(xì)胞增殖都有所減少，說(shuō)明Sch B干預(yù)染毒細(xì)胞后，細(xì)胞存活率未恢復(fù)至染毒前水平，但是與BaP染毒細(xì)胞比較，Sch B不同濃度干預(yù)后，細(xì)胞增殖情況明顯好轉(zhuǎn)，說(shuō)明Sch B雖未使細(xì)胞存活率恢復(fù)至染毒前水平，但較染毒細(xì)胞相比，明顯提高了其細(xì)胞存活率，并隨著Sch B濃度的增大，細(xì)胞增殖提高程度越明顯，說(shuō)明兩者存在濃度依賴性關(guān)系。

本研究進(jìn)行了Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，其常用于研究腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。有研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用Sch B后腫瘤細(xì)胞的侵襲力并未改變，但可以降低誘導(dǎo)因子處理后的腫瘤細(xì)胞侵襲［12］，這就說(shuō)明Sch B對(duì)細(xì)胞的侵襲力是有影響的。本研究利用其研究BaP染毒HTR細(xì)胞的侵襲力，發(fā)現(xiàn)BaP染毒后HTR細(xì)胞穿透小室的細(xì)胞數(shù)明顯減少，說(shuō)明細(xì)胞侵襲力明顯下降。Sch B低、中、高（0.5，1，2μmol/L）3個(gè)濃度干預(yù)細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，干預(yù)組各濃度都未使細(xì)胞侵襲力恢復(fù)至染毒前水平，但在Sch B干預(yù)后染毒細(xì)胞穿透聚碳酸酯膜的數(shù)量與BaP染毒組相比明顯增加，說(shuō)明干預(yù)后細(xì)胞的侵襲力明顯優(yōu)于BaP染毒細(xì)胞，隨著濃度的增大，其穿透基底膜的細(xì)胞數(shù)越多，說(shuō)明Sch B對(duì)BaP染毒細(xì)胞侵襲力的保護(hù)作用與Sch B呈濃度依賴性。

目前關(guān)于BaP對(duì)細(xì)胞侵襲力損傷的研究并不多，更少有關(guān)其造成損傷的機(jī)制研究，本研究證實(shí)BaP會(huì)對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞活力造成影響并降低其侵襲力，Sch B在不影響細(xì)胞存活率的同時(shí)還可以保護(hù)BaP對(duì)細(xì)胞侵襲力的損傷，這為發(fā)掘預(yù)防環(huán)境污染物對(duì)人類(lèi)生殖力損傷的藥物研究提供了新思路。

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The Protection Effect of Schisandrin B on Extravillous Trophoblast Cell Line Aggressive Damage Caused by BaP

WANG

Meng，LIANG Jing，HOUHai-yan，DONGQu-long，CHEN Ya-qiong.DepartmentofObstetrics and Gynecology，Affiliated Hospital of Medical College of Chinese People′s Armed Police Forces，Tianjin 300162，China（WANGMeng，HOU Hai-yan，DONG Qulong，CHEN Ya-qiong）；Tianjin Key Laboratory for Prevention and Control of Occupational and Environmental Hazards，Tianjin 300162，China（HOU Hai-yan，CHEN Ya-qiong）；Guang′anmen Hospital China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100053，China（LIANG Jing）

CHENYa-qiong，E-mail：chenyq82@gmail.com

Objective:Using human trophoblast HTR-8/SVneo（HTR）cell lines for the study of the carrier to study Schisandrin B（Sch B）′s action of benzo［a］pyrene（BaP）damage effecton HTR cell lines aggressivity.Methods：Experiment is divided into the controlgroup，the BaP infected group，different dose Sch B（0.5，1，2μmol/L），intervention infected groupcell proliferation by MTSexperimental detection，clear BaP canister and Sch B intervention dose，by Transwell invasion experiment after the detection of BaP infected cells and Sch B cell invasion force change after intervention.Results：①The MTS test cell proliferation，compared with control group，20μmol/L BaP concentration cell proliferation significantly decreased after effect（P＜0.01），after Sch B（0.5，1，2μmol/L）intervention the cellproliferation isobviously better than BaP infected group（P＜0.05）.②Transwellcell invasion experiment，compared with controlgroup，the BaPcells infected group wasmuch lessaggressive（P＜0.05）.Sch B intervention group cell invasion force also declined（P＜0.05）.Compared with the infected group，Sch B cells ofaggressive intervention group was obviously ascending（P＜0．05）.Conclusions：①A certain concentrations of BaP damaged HTR cell proliferation and invasion force.②Sch B can prevent the damage of BaP of HTR cell proliferation，and at the same time improve cellaggressivity.

Schisandra；Benzo（a）pyrene；Cellproliferation；Trophoblastcell（JInt Obstet Gynecol，2016，43：590-593）

2016-03-22）

［本文編輯秦娟］

國(guó)家自然科學(xué)基金（81273977）；武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院種子基金（FYM201415）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃（15JCQNJC12300）

300162天津，中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科（王夢(mèng)，侯海燕，董渠龍，陳亞瓊）；天津市職業(yè)與環(huán)境危害防制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（侯海燕，陳亞瓊）；中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院南區(qū)（梁婧）

陳亞瓊，E-mail：chenyq82@hotmail.com