董渠龍，侯海燕，陳俊，高秀霞，陳亞瓊

·論著·

五味子乙素降低苯并芘對HTR-8/SVneo細胞毒性作用的體外研究

董渠龍#，侯海燕#，陳俊，高秀霞，陳亞瓊

目的：探索苯并芘［Benzo（a）pyrene，BaP］是否對人早孕胎盤絨毛膜外滋養(yǎng)層細胞HTR-8/SVneo具有毒性作用以及五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）是否可以降低BaP的毒性作用。方法：以HTR-8/SVneo細胞為載體，構建BaP對HTR-8/SVneo細胞的染毒模型和Sch B對HTR-8/SVneo細胞的保護模型，利用MTS細胞增殖實驗檢測不同濃度的BaP單獨給藥和Sch B聯(lián)合BaP給藥對HTR-8/SVneo細胞增殖的影響。結果：0.01，0.1μmol/L濃度的BaP并不抑制HTR-8/SVneo細胞的增殖（P＞0.05），而1，10，100μmol/L濃度的BaP對HTR-8/SVneo細胞的增殖有抑制作用（P＜0.05）且隨著其作用時間（6，12，24，36和48 h）的延長而增大，但作用24 h后其抑制作用趨于平衡，通過繪制HTR-8/ SVneo細胞的生長曲線發(fā)現(xiàn)，20μmol/L的BaP對HTR-8/SVneo細胞作用24 h后的抑制作用最佳，其抑制率達到24.95%；0.01，0.1，1μmol/L濃度的Sch B并未抑制HTR-8/SVneo細胞的增殖（P＞0.05），高于10μmol/L的Sch B抑制HTR-8/SVneo細胞的增殖（P＜0.05）。0.25，0.5，1，2μmol/L的Sch B可以降低BaP的毒性作用且對HTR-8/SVneo細胞沒有毒性作用，且其保護作用隨著濃度增加而增大（P＜0.05），其中2μmol/L的Sch B對HTR-8/SVneo細胞的保護作用最強，保護率達到17.84%。結論：BaP對HTR-8/SVneo細胞具有毒性作用，而一定濃度范圍內(nèi)的Sch B可以有效地降低BaP的這種毒性作用。

苯并芘；五味子素；五味子乙素；滋養(yǎng)層；滋養(yǎng)層細胞；比色法

苯并芘［Benzo（a）pyrene，BaP］是多環(huán)芳烴類化合物（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）的一種，其廣泛存在于空氣、水源和食物中［1-2］。BaP因具有強烈的致畸、致癌性被學術界公認為環(huán)境毒物［3］。隨著研究的深入，近年的一些研究表明BaP還具有生殖毒性［4］。文獻報道，BaP不僅可以誘導小鼠卵細胞及卵丘細胞出現(xiàn)明顯的DNA損傷，從而降低小鼠的生殖能力［5］，還可以嚴重影響移植前小鼠胚胎的發(fā)育、干擾胚胎DNA的穩(wěn)定性以及誘導細胞凋亡［6］。研究證實，BaP可以在小鼠滋養(yǎng)細胞的體外培養(yǎng)中抑制其增殖［7］，從而影響胎盤發(fā)育和胎兒生長。滋養(yǎng)細胞是妊娠中極為重要的一種細胞，其在胚胎植入、胎盤發(fā)育及母胎血液的交換中發(fā)揮重要作用，直接影響胚胎及胎兒的正常發(fā)育。BaP對人類滋養(yǎng)細胞是否具有毒性作用尚無報道，但上述研究提示BaP很可能對人滋養(yǎng)細胞有損傷作用，從而對人類產(chǎn)生生殖毒性，這也許是BaP可以引起胎盤功能不良、流產(chǎn)、胚胎停育、早產(chǎn)等不良妊娠結局的機制之一［8-10］。驗證BaP是否對人類滋養(yǎng)細胞具有毒性作用對于闡明BaP的生殖毒性具有重要意義，因此本研究以人類滋養(yǎng)細胞HTR-8/SVneo細胞為模型，進行體外試驗研究，探討B(tài)aP對滋養(yǎng)細胞是否有損傷作用。

傳統(tǒng)中藥五子衍宗丸可以促進人類生育力，五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）是其君藥五味子的主要成分。研究表明，Sch B可以通過激活超氧化物歧化酶、谷胱甘肽等重要的抗氧化酶來抵抗機體的氧化應激并抑制細胞的凋亡［11］。同時，多項研究表明Sch B還可以激活Nrf2-ARE信號通路［12-14］，而該通路的激活以及隨后的血紅素加氧酶、醌氧化還原酶表達可以降低BaP對角質(zhì)細胞誘導的損傷［15］。

本試驗旨在探討B(tài)aP對HTR-8/SVneo細胞是否有直接的損傷作用，同時也探討Sch B是否可以降低BaP引起的細胞損傷，這對于闡明BaP的生殖毒性和Sch B是否具有預防及治療BaP引起的生殖毒性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 研究材料HTR-8/SVneo細胞株由加拿大Graham CH教授惠贈并經(jīng)過相關認證，BaP（美國Sigma公司），Sch B（中國藥品生物制品檢定所），RPMI1640培養(yǎng)基（美國GIBCO公司），胎牛血清（美國GIBCO公司），胰蛋白酶（北京索萊寶生物科技公司），二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司），MTS細胞增殖檢測試劑盒（Promega北京生物技術有限公司），HERAcell細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），IX71倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司），SW-CJ-1F無菌超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術公司），移液器（德國Eppendorf公司），imark酶標儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)HTR-8/SVneo細胞接種于規(guī)格為10 cm細胞培養(yǎng)皿中，給予RPMI1640完全培養(yǎng)基7mL后置于37℃、含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長情況適時進行換液、傳代、凍存及MTS細胞增殖實驗。

1.3 MTS細胞增殖實驗

1.3.1 MTS細胞增殖實驗檢測BaP對HTR-8/SVneo細胞增殖的抑制效應收集消化的細胞制成單細胞懸浮溶液，將細胞接種于96孔板中（每孔接種8 000個細胞），培養(yǎng)24 h后分組將RPMI1640完全培養(yǎng)基更替為0.01～1 000μmol/L的BaP溶液進行加藥處理，同時以0.1%DMSO溶液作為對照組，每組5個孔。繼續(xù)培養(yǎng)一段時間后（分批次培養(yǎng)6，12，24，36，48 h），加入20μLMTS溶劑+100μLRPMI1640完全培養(yǎng)基混合溶液于37℃下作用2 h，利用酶標儀在492 nm波長處測出每孔的OD值。

1.3.2 MTS細胞增殖實驗檢測Sch B對HTR-8/SVneo細胞的增殖效應實驗方法如上述，不同之處在于加藥組為0.01～1 000μmol/L的Sch B溶液。

1.3.3 MTS細胞增殖實驗檢測Sch B聯(lián)合BaP給藥對HTR-8/SVneo細胞的增殖效應實驗方法如上述，不同之處在于加藥組為Sch B聯(lián)合BaP溶液。

1.4 結果計算根據(jù)各組所測OD值計算BaP對HTR-8/ SVneo細胞的損傷率和Sch B的保護率。計算公式如下：

保護率（%）=（實驗組平均OD值－對照組平均OD值）/對照組平均OD值×100%

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析。實驗中各數(shù)據(jù)均為計量資料，以均數(shù)±標準差（±s）表示。經(jīng)檢驗，各組數(shù)據(jù)均滿足正態(tài)性和方差齊性的特點，故采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進行統(tǒng)計分析，組間差別采用LSD法進行檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。采用Graphpad軟件對所得數(shù)據(jù)進行制圖。

2 結果

2.1 BaP抑制HTR-8/SVneo細胞的增殖探索0.01～1 000μmol/L范圍內(nèi)不同濃度的BaP作用HTR-8/SVneo細胞24 h后的細胞增殖情況如圖1所示，其中0.01、0.1μmol/L濃度的BaP對HTR-8/ SVneo細胞的增殖沒有影響（P＞0.05），1，10，100，1 000μmol/L濃度的BaP均抑制HTR-8/SVneo細胞的增殖，其細胞增殖率分別是對照組的92.06%、84.71%、93.75%、93.86%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。由此可知，1，10，100μmol/L濃度的BaP對HTR-8/SVneo增殖的抑制作用最明顯，故接下來在此范圍內(nèi)探索BaP的最佳染毒濃度。

圖1 各濃度BaP對HTR-8/SVneo細胞增殖的影響

2.2 不同濃度BaP在不同的作用時間對HTR-8/ SVneo細胞的影響確定BaP抑制HTR-8/SVneo細胞增殖的最佳濃度在1～100μmol/L范圍內(nèi)后，對該范圍內(nèi)的各BaP濃度分別作用HTR-8/SVneo細胞6，12，24，36和48 h后進行MTS細胞增殖實驗，繪成細胞生長曲線，見圖2（見封三）。從圖中可以看出，BaP濃度為1，2.5，5，10，20μmol/L時，其對HTR-8/ SVneo細胞增殖的抑制作用隨著濃度的增加而增加，BaP濃度為20，40，100μmol/L時則相反，其中，20μmol/L BaP對HTR-8/SVneo細胞增殖的抑制作用最強，其作用HTR-8/SVneo細胞24 h時抑制率達到24.95%。另外，各濃度BaP對HTR-8/SVneo細胞增殖的抑制作用隨著作用時間的延長而增強，但是作用24 h后抑制強度減弱，趨于平衡。

2.3 Sch B對HTR-8/SVneo細胞增殖的影響探索0.01～1 000μmol/L范圍內(nèi)不同濃度的Sch B作用HTR-8/SVneo細胞24 h后的細胞增殖情況，見圖3。0.01，0.1，1μmol/L濃度的Sch B并未抑制HTR-8/ SVneo細胞的增殖（P＞0.05），其中1μmol/L濃度的Sch B對HTR-8/SVneo細胞有輕微的促增殖作用，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；10，100，1 000μmol/L濃度的Sch B則均抑制HTR-8/SVneo細胞的增殖，其細胞增殖率分別是對照組的95.71%、90.02%、81.75%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

從圖3中不難發(fā)現(xiàn)，0.1、1、10μmol/L濃度范圍內(nèi)的Sch B中存在著具有潛在的保護作用，故研究0.1～10μmol/L濃度范圍的Sch B作用HTR-8/SVneo細胞24 h后的細胞增殖情況，結果如圖4所示：0.1 μmol/L濃度的Sch B對HTR-8/SVneo細胞的增殖沒有影響（P＞0.05）；0.25，0.5，1，2，5μmol/L濃度的Sch B對HTR-8/SVneo細胞有輕微的促增殖作用，且在0.25～2μmol/L濃度范圍內(nèi)其促增殖作用隨著劑量增加而輕微增加，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；10μmol/L濃度的Sch B則抑制了HTR-8/ SVneo細胞的增殖，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖3 各濃度Sch B對HTR-8/SVneo細胞增殖的影響

圖4 確定最佳濃度后的各濃度Sch B對HTR-8/SVneo細胞增殖的影響

2.4 Sch B降低了BaP對HTR-8/SVneo細胞的毒性作用各濃度的Sch B和20μmol/LBaP聯(lián)合給藥作用HTR-8/SVneo細胞24 h后，與正常對照組相比，各組的細胞增殖則受到了不同程度的抑制，但是與BaP單獨給藥組相比，濃度為0.25，0.5，1，2，5 μmol/L的Sch B聯(lián)合BaP給藥組則促進了HTR-8/ SVneo細胞的增殖，即降低了BaP的毒性作用，且在此濃度范圍內(nèi)其抑制BaP毒性作用隨著劑量增加而增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。10μmol/L的Sch B聯(lián)合BaP給藥組則增強了BaP對HTR-8/ SVneo細胞增殖的抑制作用（P＜0.05），見圖5。進一步分析各濃度Sch B對抗BaP從而保護HTR-8/ SVneo細胞的效率可以發(fā)現(xiàn)，與單獨BaP給藥組相比，0.1，0.25，0.5，1，2，5μmol/L的Sch B聯(lián)合BaP給藥組的細胞保護率分別為0.94%、2.60%、7.81%、12.05%、17.84%、2.63%；10μmol/L的Sch B聯(lián)合BaP給藥組則進一步抑制了細胞的增殖，其細胞增殖率為BaP單獨給藥組的96.43%。

圖5 各濃度Sch B聯(lián)合BaP給藥對HTR-8/SVneo細胞增殖的影響

3 討論

滋養(yǎng)細胞是妊娠中極為重要的一種細胞，其直接參與胚胎植入、胎盤形成及母血交換等過程，其功能異常往往引起流產(chǎn)、胚胎停育、早產(chǎn)等不良妊娠結局。研究證實，BaP可以抑制小鼠滋養(yǎng)細胞的增殖，從而影響小鼠的胎盤發(fā)育及胎兒生長［7］。Pratt等［16］的研究發(fā)現(xiàn)吸煙女性的絨毛膜細胞滋養(yǎng)層細胞及合體滋養(yǎng)層細胞的二羥環(huán)氧BaP（BPDE）-DNA加合物的含量明顯高于不吸煙者，而Lee等［17］研究表明BPDEDNA加合物可以產(chǎn)生生物毒性，這提示BaP很可能能夠對人滋養(yǎng)細胞造成損害，從而對人類產(chǎn)生生殖毒性。本研究利用MTS細胞增殖實驗檢測BaP對HTR-8/SVneo細胞增殖的影響，結果發(fā)現(xiàn)0.01，0.1 μmol/L的BaP對HTR-8/SVneo細胞增殖不產(chǎn)生抑制作用，但是1，10，100，1 000μmol/L濃度的BaP均不同程度地抑制了HTR-8/SVneo細胞的增殖，且毒性作用在1～100μmol/L濃度范圍內(nèi)最強。為了更加明確BaP的毒性作用，我們將BaP濃度細分為1，2.5，5，10，20，40，100μmol/L共7個濃度梯度，并分批次地作用于HTR-8/SVneo細胞6，12，24，36，48 h，以觀察HTR-8/SVneo細胞在不同濃度梯度的BaP不同作用時間下的細胞增殖情況。結果發(fā)現(xiàn)，1～100 μmol/L濃度范圍內(nèi)的BaP在各個時間點對HTR-8/ SVneo細胞均有抑制作用，其抑制作用在1，2.5，5，10，20μmol/L濃度范圍內(nèi)隨著BaP濃度的增加而增加，在20，40，100μmol/L濃度范圍內(nèi)則相反，且各濃度的BaP對HTR-8/SVneo細胞的毒性都是隨著作用時間的延長而增大，但是作用24 h毒性最明顯，之后趨于“飽和”狀態(tài)。因此，本研究明確了BaP對HTR-8/SVneo細胞的毒性作用，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)孕早期胚胎停育的母親外周血中BPDE-DNA含量較高［18］，這一作用的明確也許可以解釋BaP為什么可以引起胎盤功能不良、流產(chǎn)、胚胎停育、早產(chǎn)等不良妊娠結局［8-10，19］。需要注意的是，BaP對HTR-8/ SVneo細胞的毒性作用并不是隨著BaP的濃度增加而一味地增加，而是在20μmol/L這個濃度處達到了最大，這可能與本研究中發(fā)現(xiàn)過高濃度的BaP易形成結晶，從而降低了BaP的毒性有關。該濃度對細胞的損傷程度與章艷燕等［20］的研究相吻合，且該研究也以20μmol/L的BaP作為染毒劑量，這加強了本實驗的可靠性。

本研究又進一步探索了Sch B是否具有對抗BaP毒性從而保護HTR-8/SVneo細胞的作用，首先利用MTS細胞增殖實驗驗證Sch B本身對HTR-8/ SVneo細胞是否具有毒性作用。研究結果提示，0.01～1μmol/L濃度的Sch B并未抑制HTR-8/SVneo細胞的增殖，0.25，0.5，1，2，5μmol/L濃度的Sch B對HTR-8/SVneo細胞還有輕微的促增殖作用，且在0.25，0.5，1，2μmol/L濃度范圍內(nèi)其促增殖作用隨著劑量增加而輕微增加，但是10，100，1 000μmol/L濃度的Sch B則抑制HTR-8/SVneo細胞增殖，即產(chǎn)生了細胞毒性，這說明適量濃度范圍內(nèi)的Sch B（≤5 μmol/L）不會對HTR-8/SVneo細胞產(chǎn)生毒性作用。之后將0.1～10μmol/L濃度Sch B與20μmol/LBaP共同培養(yǎng)24 h，之所以選擇20μmol/LBaP濃度并作用24 h是因為前述實驗證實該濃度及該作用時間具有最佳的毒性效率，適合探索Sch B的保護作用。結果發(fā)現(xiàn)，濃度為0.25，0.5，1，2，5μmol/L的Sch B聯(lián)合BaP給藥組則促進了HTR-8/SVneo細胞的增殖，即降低了BaP的毒性作用，且在此濃度范圍內(nèi)其抑制BaP毒性作用隨著劑量增加而增加，但10μmol/L的Sch B聯(lián)合BaP給藥組則增強了BaP的毒性作用，這可能與10μmol/L的Sch B本身就具有細胞毒性有關，當然這種猜測還有待于進一步證實。進一步的分析發(fā)現(xiàn)，0.1，0.25，0.5，1，2，5μmol/L的Sch B對HTR-8/SVneo細胞的保護率分別為0.94%、2.60%、7.81%、12.05%、17.84%和2.63%，保護效果明確有效。

至于Sch B如何對抗BaP從而保護HTR-8/ SVneo細胞，本實驗尚未明確。但是，從以前的研究中可以推測，這可能與Sch B減輕BaP對HTR-8/ SVneo細胞的氧化損傷、DNA損傷有關［21-23］，具體機制還有待于進一步實驗研究證實。

綜上，本研究證實了BaP對HTR-8/SVneo細胞的毒性作用，也證實了一定濃度范圍內(nèi)的Sch B可以降低BaP的毒性作用，這對于闡明BaP的生殖毒性具有重要作用，同時也為預防或者逆轉這一毒性開辟了一條新的道路。希望未來有更深入的機制研究可以闡明BaP的毒性機制和Sch B的保護機制，也相信在不久的將來可以開發(fā)出相關藥物保護和促進人類生殖健康，為改善不良妊娠結局作出相應貢獻。

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［本文編輯王昕］

Schisandrin B Attenuating Benzo（a）pyrene-induced HTR-8/SVneo Cells Damage In Vitro

DONG Qu-long，HOU Hai-

yan，CHEN Jun，GAOXiu-xia，CHEN Ya-qiong.DepartmentofObstetricsand Gynecology，Affiliated HospitalofMedicalCollege of Chinese People′sArmed Police Forces，Tianjin 300162，China（DONGQu-long，HOUHai-yan，CHEN Jun，GAOXiu-xia，CHEN Ya-qiong）；Chinese Academy ofMedicalSciences&Peking Union MedicalCollege，Beijing 100730，China（HOUHai-yan）

CHENYa-qiong，E-mail：chenyq82@hotmail.com

Objective:To investigatewhether administering ofbenzo（a）pyrene（BaP）and schisandrin B（Sch B）to human trophoblast HTR-8/SVneo cells has cytotoxicity and cytoprotection，respectively.Methods:By HTR-8/SVneo cells culture in vitro，MTS cell proliferation assay was performed to detect the effectof different concentration of BaP-alone，Sch B-alone and Sch B combiningwith BaP treatmenton cell proliferation.Results:0.01 and 0.1μmol/LBaP did not inhibitHTR-8/SVneo cell proliferation（P＞0.05），but1，10 and 100μmol/LBaPall inhibited HTR-8/SVneo cellproliferation（P＜0.05）.The inhibition rate were presented to be escalated accompanied by escalating BaP time exposure（6，12，24，36 and 48 h），and 24 h BaP

Benzo（a）pyrene；Schizandrin；Schizandrin B；Trophoblast；Trophoblastcell；Colorimetry（JInt Obstet Gynecol，2016，43：585-589，封三）

國家自然科學基金（81273977）

300162天津，中國人民武裝警察部隊后勤學院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科（董渠龍，侯海燕，陳俊，高秀霞，陳亞瓊）；中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院（侯海燕）

陳亞瓊，E-mail：chenyq82@hotmail.com

2016-02-26）

#共同第一作者exposure were presented to be a saturation，especially for 20μmol/L BaP with 24 h exposure which presented a suitable inhibition rate（24.95%）.Besides，0.01，0.1 and 1μmol/LSch B did not inhibitHTR-8/SVneo cell proliferation（P＞0.05），but the levelof SchB higher than 10μmol/L inhibited HTR-8/SVneo cellproliferation（P＜0.05）.0.25，0.5，1 and 2μmol/LSch B all attenuated the cytotoxicity induced by BaP in HTR-8/SVneo cellswith a dose-effect relationship，especially for 2μmol/L Sch Bwhich presented a highestprotection rate（17.84%）.Conclusions:BaP can directly induce cytotoxicity in HTR-8/SVneo cells，while certain Sch B can attenuate the cytotoxicity.