包振宇，張?jiān)平?，鄒先彪，郭曉娟，林　卉

109例尖銳濕疣患者的HPV型別特點(diǎn)分析

包振宇，張?jiān)平埽u先彪，郭曉娟，林卉

目的 了解尖銳濕疣患者人乳頭瘤病毒（human papilloma virus， HPV）感染的型別特點(diǎn)，為疾病的治療和預(yù)后的判斷提供理論依據(jù)。方法 采用流式熒光-液態(tài)芯片技術(shù)對(duì)109例尖銳濕疣患者（男76例，女33例）進(jìn)行HPV基因型別檢測，分析男女患者感染HPV基因型及感染類型特點(diǎn)。結(jié)果 尖銳濕疣患者的HPV DNA陽性檢出率為87.16％，陽性檢出率前6位的基因型分別為HPV6、HPV11、HPV16、HPV39、HPV18、HPV51。男女患者之間HPV DNA陽性檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在HPV感染類型方面， 女性多重感染率為78.57％，男性為53.73％，女性明顯高于男性（P＜0.05）；在感染型別方面，女性高危型感染率為49.21％，男性為25.20％，女性明顯高于男性（P＜0.05）。結(jié)論 尖銳濕疣患者感染的HPV以低危亞型、多重感染為主，亦有一定比例的高危型感染。不同性別的尖銳濕疣患者感染HPV的特點(diǎn)有差異，男性患者以低危型別和單一類型感染為主，而女性以高危型別和混合的多重類型感染為主。HPV感染對(duì)女性影響要大于男性，要重視對(duì)成年女性的HPV的篩查，做到及早發(fā)現(xiàn)及早治療，改善女性的生活質(zhì)量。

尖銳濕疣；人乳頭瘤病毒；基因型檢測；性別因素

尖銳濕疣（condyloma acuminata， CA）是以生殖器部位皮膚黏膜的良性增生性損害為主的一種性傳播疾病，因高復(fù)發(fā)率及強(qiáng)傳染性使其傳播非常廣，其發(fā)病率僅次于淋病，居于國內(nèi)性傳播疾病的第二位［1］。人乳頭瘤病毒（human papilloma virus， HPV）是其病原體，該病毒目前已被發(fā)現(xiàn)約有30余種亞型可以感染生殖道，20余種與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)［2］。根據(jù)致病力的不同，又將這30種亞型分為低危型、高危型兩種型別，低危型感染常引起皮膚黏膜的良性的疣狀增生，如CA等；而高危型的持續(xù)性感染可導(dǎo)致感染部位出現(xiàn)非典型增生及惡性變，如宮頸內(nèi)瘤樣變、宮頸癌等。在臨床上可發(fā)現(xiàn)不同性別CA患者的HPV感染情況有一些差異，但相關(guān)的研究資料卻不多。本研究利用流式熒光-液態(tài)芯片技術(shù)對(duì)不同性別的尖銳濕疣患者進(jìn)行HPV基因型進(jìn)行檢測，現(xiàn)將檢測結(jié)果報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 研究對(duì)象2015年10月—2016年1月在解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院皮膚科門診就診的109名CA患者，在自愿的基礎(chǔ)上對(duì)這些患者進(jìn)行HPV基因型別檢測，其中男性76例，占69.72％；女性33例，占30.28％。

1.2標(biāo)本采集 暴露疣體部位，先用生理鹽水清洗，再采用試劑盒所提供的專用小毛刷在疣體頭部反復(fù)摩擦幾次，取得脫落細(xì)胞，折斷毛刷頭，放入裝有細(xì)胞保存液的取樣管內(nèi)，然后放置于4℃的冰箱中等待檢測。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 本實(shí)驗(yàn)所需的HPV核酸分型檢測試劑盒和通用型引物、β-globin PCR 引物（具體基因序列見文獻(xiàn)［3］）和多功能流式點(diǎn)陣儀（Luminex100），均購自于上海透景生命科技有限公司?；驍U(kuò)增儀（Eppendorf Mastercylcer Gradient）由杭州博日公司提供。

1.4實(shí)驗(yàn)步驟

1.4.1樣本DNA的提取 取待測標(biāo)本200 μl，置于高速離心機(jī)上，12 000 r/min離心5 min，棄上清，在沉淀液中加DNA提取液200 μl充分混勻，100 ℃恒溫處理10 min，再次12 000 r/min離心5 min，取上清5 μl行PCR。

1.4.2PCR試劑配制 取出PCR相關(guān)試劑，根據(jù)說明書配制反應(yīng)體系混合液（每個(gè)反應(yīng)體系總體積為20.8 μl，包括5 μl核酸模板、10 μl預(yù)混液、 5 μl引物混合液、 0.8 μl聚合5種物質(zhì)），然后使用移液槍將反應(yīng)體系混合液按照15 μl/管分別裝入各個(gè)PCR反應(yīng)管中。

1.4.3PCR擴(kuò)增 將提取出的樣品核酸按5 μl/管的量逐一加入到相應(yīng)的PCR反應(yīng)管中，以2000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 s，然后將PCR反應(yīng)管放入PCR儀，設(shè)定好熱蓋功能，并按照以下的熱循環(huán)條件進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為： 95 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，進(jìn)行5個(gè)循環(huán)；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 3 min，1個(gè)循環(huán)。

1.4.4核酸雜交 取微球雜交液，以每孔22 μl的劑量加入到雜交板的微孔中，再從待測樣本中抽取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3 μl依次加入到上述的雜交孔中，并剪取相應(yīng)大小的透明封口膜覆蓋封口；將雜交板再次置于PCR儀進(jìn)行變性和雜交，基本過程如下：95 ℃ 5 min；變性；48 ℃ 30 min；雜交；48 ℃ 15 min，孵育；然后取下封口膜，再在每個(gè)微孔中加入藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉親合素75 μl，然后在48 ℃繼續(xù)孵育15 min。

1.4.5上機(jī)檢測 將微孔雜交板快速轉(zhuǎn)移至預(yù)熱好的多功能流式點(diǎn)陣儀，電腦讀取微球編碼及其對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)弱信號(hào)［4］，經(jīng)配套分析軟件判讀檢測結(jié)果。陽性內(nèi)對(duì)照珠蛋白的信號(hào)＞150即代表實(shí)驗(yàn)成功，任何HPV型別特異性探針的信號(hào)＞150，且≥ 2.5倍背景信號(hào)值，即判斷為該探針對(duì)應(yīng)的亞型陽性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，2組間計(jì)數(shù)資料比較用四格表χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1HPV DNA檢測陽性率及基因分型 109例CA患者參加檢測，檢出HPV DNA陽性95例，陽性率為87.16％。在本次實(shí)驗(yàn)中，共檢測出了20種亞型，其中低危型有5種，包括HPV6、11、40、43、61；高危型有15種，包括HPV16、18、31、33、35、39、51、52、53、56、58、59、66、68、82。陽性率前6位感染亞型分別為HPV6、HPV11、HPV16、HPV39、HPV18、HPV51，見表1。

表1　患者HPV基因型Table 1 Distribution of infected HPV gene subtypes

2.2感染類型 95例HPV檢測陽性的病例中，單一型感染的有37例，占38.95％（37/95），多重感染58例，占61.05％（58/95）。感染類型分布情況見表2。

表2　患者感染類型Table 2 Infectious types of patients

單一型別感染的37例中，主要的型別為HPV6有23例，占62.16％；HPV11為5例，占13.51％；HPV18和HPV16各2例，均占5.41％；而HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV61各有1例，均占2.70％。在多重型別感染的58例中，其中二重感染有34例，占58.62％，主要基因型為HPV6+11 20例；三重感染18例，占31.03％，主要基因型為HPV6+11+16、HPV6+11+31、HPV6+11+39、HPV6+11+51、HPV6+16+39各2例；而四重以上感染共有6例，占10.34％，基因型分別為HPV6+11+16+18、HPV6+11+18+39、HPV11+16+18+53、HPV11+40+43+61、HPV6+11+39+52+68和HPV6+11+31+35+51+58。

2.3男女感染情況 95例HPV DNA陽性患者中，男性陽性率為88.15％（67/76），女性陽性率為84.84％（28/33），男女陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.225，P=0.635）。在感染類型方面，男性單一感染率為46.27％（31/67），多重感染率為53.73％（36/67），女性單一感染率為21.43％（6/28），多重感染率為78.57％（22/28），女性多重感染率高于男性（P＜0.05），見表3。在感染型別方面，男性高危型感染率為25.20％（31/123），低危感染率為74.80％（92/123）；女性高危型感染率為49.21％（31/63），低危感染率率為50.79％（32/63），女性高危型感染率高于男性（P＜0.05），見表4。

表3　男女患者感染類型比較（例）Table 3 Comparison of the infectious types between the male and female（cases）

表4　男女患者感染型別比較（例）Table 4 Comparison of the clinical types between the male and female（cases）

4 討 論

CA的病原體是HPV，它是一種球形DNA病毒，具有嚴(yán)格的嗜上皮特性，不感染其他動(dòng)物，人是其惟一的宿主，能引起人體皮膚黏膜的鱗狀上皮增殖。根據(jù)病毒的基因組特征進(jìn)行分類，目前已分離出130多種基因亞型，其中有30余種可以感染生殖道，20余種與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)［2］。根據(jù)致病力的不同可分為高危型和低危型。有國外研究表明，90％的生殖器疣是由HPV低危型中的HPV6和HPV11型所引起的，約73％的宮頸癌的發(fā)生與高危型中的HPV16和HPV18型有關(guān)［5］。本研究對(duì)27種常見的HPV基因型進(jìn)行檢測，其中低危型10種、高危型17種，包含了能引起生殖器疣的常見HPV類型。

在本次研究中，入組的109例CA患者參加了HPV基因型別檢測，檢出HPV DNA陽性患者95例，陽性率為87.16％；這與曹嬿等［6］所得結(jié)果基本一致。對(duì)14例陰性病例進(jìn)行病理檢查，均有典型凹空樣細(xì)胞，且發(fā)病前均有CA患者的親密接觸史，可以診斷為CA，其檢測陰性的原因可能為：①本研究取材的為疣體部位脫落細(xì)胞，由于刷取的部位不同，其脫落細(xì)胞的病毒載量亦不同，可能會(huì)影響檢測的結(jié)果；②與CA有關(guān)的HPV基因型有40余種，在本實(shí)驗(yàn)中僅檢測27種，而這些陰性患者的感染的基因型或不在這27種之中；③由于誤差（如實(shí)驗(yàn)儀器自身的系統(tǒng)誤差等）導(dǎo)致出現(xiàn)的假陰性。

HPV感染與患者性別因素的關(guān)系非常密切，在不同性別上的發(fā)病率有明顯不同。國內(nèi)一項(xiàng)針對(duì)3489例CA患者的流行病學(xué)調(diào)查顯示，男性患者的發(fā)病率明顯高于女性患者，但女性的HPV檢出率卻高于男性［7］，這可能與女性生殖道（陰道、宮頸等）特殊的生理構(gòu)造有關(guān)，女性生殖道經(jīng)常處于潮濕狀態(tài)，易致HPV感染。但在本研究中，二者之間的陽性檢測率卻無顯著差異，考慮可能與樣本量較少有關(guān)。本研究結(jié)果表明，CA患者感染的基因型以低危HPV6、11為主，男性患者低危型別感染率達(dá)到74.80％，明顯高于女性的50.79％，而高危型別的感染情況正相反，女性患者感染率為49.21％，高于男性的25.20％，基因型以HPV16、18、39為主，這與Potocnik［8］所得出的結(jié)果基本一致。而在HPV感染的類型中，女性患者以混合的多重感染為主，而男性患者感染則以單一型別為主。HPV的感染不僅能引起皮膚黏膜的良性增生，也與肛門癌、陰莖癌、陰道癌、宮頸癌等惡性病變有關(guān)，目前已經(jīng)證實(shí)，持續(xù)性高危型HPV感染是引起宮頸癌的常見病因之一，以上結(jié)果說明，HPV感染對(duì)女性影響要大于男性，因此要將成年女性做為高危型HPV感染的易感人群，更要重視女性CA患者的HPV篩查檢測，加強(qiáng)HPV 感染的預(yù)防和健康教育，預(yù)測惡性病變的發(fā)生和發(fā)展，指導(dǎo)臨床采取有效的治療措施，改善女性患者的生活質(zhì)量。

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（2016-04-21收稿 2016-06-29修回）

（責(zé)任編委 王永怡 本文編輯 張?jiān)戚x）

Analysis of HPV type characteristics in 109 patients with condyloma acuminatum

BAO Zhen-yu， ZHANG Yun-jie， ZOU Xian-biao*， GUO Xiao-juan， LIN Hui
Department of Dermatoloy， the First Affiliated Hospital of PLA General Hospital， Beijing 100048， China

， E-mail: xbzou@126.com

Objective To analyze the characteristics of HPV genotypes of patients infected with condyloma acuminatum （CA）and provide theoretical basis for the treatment and prognosis of diseases. Methods HPV genotype was detected by flow cytometry in 109 CA cases （76 males and 33 females）， and the characteristics of HPV genotype and infection type were analyzed. Results The HPV positive rate of CA patients was 87.16％. The main subtypes were HPV6， HPV11， HPV16， HPV39， HPV18 and HPV51. There were no statistically significant differences in the positive rate of HPV between male and female patients （P＞0.05）； In HPV infection types， the multiple infection rate was 78.57％ in female， 53.73％ in male， and the multiple infection rate of female was significantly higher than that in male （P＜0.05）； In HPV infection genotypes， infection rate of high-risk type was 49.21％ in female， 25.20％ in male， and female’s was significantly higher than that in male （P＜0.05）. Conclusions The HPV of patients with CA is mainly low-risk and multiple infection， and there is a certain proportion of high risk type. There are differences in the characteristics of HPV infection among patients with different genders. The infection of male patients is mainly low-risk and single type， and the infection of female patients is mainly high-risk and mixed multiple types .This shows that the impact of HPV infection on women is greater than that of men， so it is necessary to pay much attention to the HPV screening of adult women and to improve their life quality by early detection and early treatment.

condyloma acuminatum； human papilloma virus； genotype detection； gender factor

R752.5

A

1007-8134（2016）05-0276-04

10.3969/j.issn.1007-8134.2016.05.005

100048 北京，解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院皮膚科（包振宇、張?jiān)平?、鄒先彪、郭曉娟、林卉）；024000 武警赤峰市森林支隊(duì)衛(wèi)生隊(duì)（包振宇）

鄒先彪，E-mail: xbzou@126.com