于志偉　姚曉偉　潘軍強(qiáng)

陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)二科(西安710069)

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丹紅注射液對(duì)兔主動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)脂聯(lián)素表達(dá)的影響

于志偉姚曉偉潘軍強(qiáng)

陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)二科(西安710069)

目的：觀察丹紅注射液對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)脂聯(lián)素表達(dá)的影響。方法：新西蘭兔36只，隨機(jī)分為高膽固醇飲食加丹紅注射液組、高膽固醇飲食組及對(duì)照組。喂養(yǎng)12周后處死實(shí)驗(yàn)兔，取出實(shí)驗(yàn)兔主動(dòng)脈，觀察脂聯(lián)素在各組兔主動(dòng)脈內(nèi)膜中的表達(dá)。結(jié)果：內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜/中膜厚度比、斑塊面積/血管內(nèi)膜面積均在高膽固醇飲食組最高，高膽固醇飲食加丹紅注射液組次之，對(duì)照組最低，組間比較差異有顯著性(P<0.05)；免疫組化染色及Western blot結(jié)果均提示動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)脂聯(lián)素蛋白表達(dá)在對(duì)照組最高、高膽固醇飲食加丹紅注射液組次之、高膽固醇飲食組最低，組間比較差異有顯著性(P<0.05)。結(jié)論：丹紅注射液可上調(diào)高脂飲食所致動(dòng)脈粥樣硬化兔主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)脂聯(lián)素蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。

動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)及其相關(guān)疾病是臨床常見病、多發(fā)病，隨著老齡化社會(huì)的發(fā)展，其致殘率逐步上升，同時(shí)也是世界公認(rèn)的人類主要死亡原因[1]。脂聯(lián)素(Adiponectin，APN)是由脂肪組織分泌的一個(gè)與胰島素抵抗密切相關(guān)的細(xì)胞因子，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有延緩動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的功能[2]。丹紅注射液主要由兩種傳統(tǒng)中藥材丹參和紅花的有效成分組成，具有活血化淤、通經(jīng)舒絡(luò)的功效[3]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可延緩、抑制家兔AS發(fā)生、發(fā)展。本研究擬從分子生物學(xué)角度探討丹紅注射液對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)ANP表達(dá)的影響。

1材料1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立及主動(dòng)脈標(biāo)本的留取自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買新西蘭兔36只，兔齡2個(gè)月,體重1.5～2.0kg，均為雄性。將實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為：高膽固醇飲食加丹紅注射液組(A組)、高膽固醇飲食組(B組)及對(duì)照組(C組)，每組均為12只。對(duì)照組飼喂正常飼料150 g/d；高膽固醇飲食者飼喂高膽固醇飼料(購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)150 g/d；高膽固醇飲食加丹紅注射液組給予高膽固醇飼料150g/d+丹紅注射液15ml/kg/d(經(jīng)耳緣靜脈注射)。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均喂養(yǎng)12周后處死，取出主動(dòng)脈，去除血管外組織，生理鹽水沖洗后用中性甲醛液固定。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器及試劑脂聯(lián)素抗體(Anti-Adiponectin)，購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。步長(zhǎng)制藥有限公司提供丹紅注射液(20ml/支)。免疫酶標(biāo)組織化學(xué)染色檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢轉(zhuǎn)導(dǎo)生物科技發(fā)展有限公司。光學(xué)顯微鏡(BX-51型)OLYMPUS，Japan。病理圖文分析系統(tǒng) PIPS2000(重慶天海醫(yī)療設(shè)備有限公司)。

2試驗(yàn)方法 2.1免疫組化特異性染色APN蛋白的表達(dá)陽(yáng)性為血管壁染成棕黃色。免疫組化染色后用顯微鏡顯影系統(tǒng)自動(dòng)采集圖像，隨機(jī)取6個(gè)視野(×400)，系統(tǒng)自動(dòng)測(cè)量并計(jì)算出陽(yáng)性信號(hào)積分光密度(A值)。

2.2Western-blot法測(cè)定主動(dòng)脈APN蛋白組織溶漿后先提取總蛋白，后用BCA試劑盒測(cè)定蛋白總濃度。總蛋白50ug/孔上樣，行SDS-PAGE凝膠電泳，分離蛋白后轉(zhuǎn)膜，加入一抗(1：500鼠抗兔ANP單克隆抗體或者1：1000鼠抗兔β-actin)4℃孵育過(guò)夜。TBST浸洗后加入二抗(羊抗鼠IgG，1:1000稀釋)4℃孵育過(guò)夜。應(yīng)用凝膠掃描成像系統(tǒng)中進(jìn)行掃描分析，以β-actin作為內(nèi)參。

3結(jié)果3.1三組間動(dòng)脈粥樣硬化程度的比較 用內(nèi)膜厚度(μm)、內(nèi)膜/中膜厚度比(%)、斑塊面積/血管內(nèi)膜面積(%)觀察動(dòng)脈粥樣硬化程度。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)：內(nèi)膜厚度(μm)、內(nèi)膜/中膜厚度比(%)、斑塊面積/血管內(nèi)膜面積(%)均在高膽固醇飲食組(A組)最高，高膽固醇飲食加丹紅注射液組(B組)次之，對(duì)照組(C組)最低，組間比較差異有顯著性(P<0.05)，見表1。

表1　三組間動(dòng)脈粥樣硬化程度的比較

注:與B組及C組相比*P<0.05；與C組相比△P<0.05

3.2免疫組還染色觀察三組間APN的表達(dá)通過(guò)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)脂聯(lián)素蛋白在高膽固醇飲食組(A組)、高膽固醇飲食加丹紅注射液組(B組)、對(duì)照組(C組)的表達(dá)A值分別為：0.265±0.035、0.446±0.064、0.843±0.083，組間比較差異有顯著性(P<0.05)，見圖1。

圖1　主動(dòng)脈AS斑塊脂聯(lián)素蛋白的表達(dá)(×400)

3.3Western blot檢測(cè)三組間AS斑塊內(nèi)APN的表達(dá)Western blot檢測(cè)三組間AS斑塊內(nèi)APN的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)AS斑塊內(nèi)APN蛋白表達(dá)分別為：高膽固醇飲食組(A組)最低為(0.265±0.015)，高膽固醇飲食加丹紅注射液組(B組)次之為(0.863±0.083)，對(duì)照組(C組)最高為(1.510±0.273)，組間比較差異有顯著性(P<0.05)，見圖2。

圖2　三組間聯(lián)素蛋白Western blot檢測(cè)結(jié)果比較

4討論APN是由成熟脂肪細(xì)胞分泌出一種蛋白質(zhì)，因其具有抗炎、保護(hù)血管內(nèi)皮、改善胰島素抵抗及動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展等生物學(xué)活性，故又有“內(nèi)源性生物活性多肽”之稱[4]。我們前期的研究結(jié)果提示APN在高脂飲食所致動(dòng)脈粥樣硬化兔主動(dòng)脈斑塊內(nèi)表達(dá)明顯減低，驗(yàn)證了其在抗動(dòng)脈粥樣硬化中的作用[5]。丹紅注射液是由傳統(tǒng)中藥丹參、紅花有效提取物的主要成分組成的復(fù)合劑，其主要成分為丹參酮、丹參素、紅花黃色素、紅花苷等[6]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為丹紅注射液具有活血化淤、通經(jīng)舒絡(luò)之功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)：丹紅注射液具有降低血脂、抑制血小板聚集、改善內(nèi)皮功能等作用，從而在臨床上廣泛用于心、腦血管疾病及外周血管等疾病的治療[7]。

高脂飲食所致兔嚴(yán)重動(dòng)脈粥樣硬化模型是經(jīng)典的研究動(dòng)脈粥樣硬化及其相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制、治療方法的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚8]。此次研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食所誘發(fā)嚴(yán)重AS發(fā)生，而高膽固醇飲食加丹紅注射液組內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜/中膜厚度比、斑塊面積/血管內(nèi)膜面積均顯著低于高膽固醇飲食組，這說(shuō)明丹紅注射液具有明顯抑制高脂血癥所致動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的作用。此外本研究從分子生物學(xué)角度出發(fā)，利用免疫組化技術(shù)及Western blot技術(shù)，更深層次探討了丹紅注射液在抗動(dòng)脈粥樣硬化中的

作用，發(fā)現(xiàn)：高膽固醇飲食加丹紅注射液組主動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)APN的表達(dá)顯著高于高膽固醇飲食組。這提示：丹紅注射液除了通過(guò)降低血脂、抑制血小板聚集、改善內(nèi)皮功能等抗動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制之外，其可能通過(guò)上調(diào)APN的基因表達(dá)從而抑制炎癥反應(yīng)、改善胰島素抵抗，進(jìn)而在抗動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮重要作用。至于丹紅注射液在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中上調(diào)APN的確切機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

[1]Ho SS.Current status of carotid ultrasound in atherosclerosis[J]. Quant Imaging Med Surg, 2016 ,6(3):285-296.

[2]Caselli C. Role of adiponectin system in insulin resistance[J]. Mol Genet Metab,2014,113(3):155-160.

[3]丹紅注射液對(duì)介入治療ST段抬高型急性心肌梗塞的療效觀察[J].陜西中醫(yī),2014,35(6):648-650.

[4]Skurk C, Wittchen F, Suckau L,et al.Description of a local cardiac adiponectin system and its deregulation in dilated cardiomyopathy[J]. Eur Heart J,2008,29(9):1168-1180.

[5]潘軍強(qiáng),姚曉偉,周鑫，等. 鹽酸吡咯列酮對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化兔主動(dòng)脈脂聯(lián)素表達(dá)的影響[J]. 西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2014, 35(2):227-230.

[6] 付嬋, 羅娟敏, 王義明，等.多波長(zhǎng)高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定丹紅注射液中7種成分含量[J]. 中國(guó)新藥雜志,2012,21(23):2817-2820.

[7]Lv Y, Pan Y, Gao Y, et al.Effect of Danhong Injection Combined with Naoxintong Tablets on Prognosis and Inflammatory Factor Expression in Acute Coronary Syndrome Patients Undergoing Percutaneous Coronary Intervention[J]. Zhonghua Minguo Xin Zang Xue Hui Za Zhi, 2015,31(4):301-307.

[8]Dornas WC, Oliveira TT, Augusto LE, et al. Experimental atherosclerosis in rabbits[J]. Arq Bras Cardiol, 2010,95(2):272-278.

(收稿2016-04-17；修回2016-05-18)

*陜西省社會(huì)發(fā)展攻關(guān)項(xiàng)目資助(2004K17-G22)

腦脈粥樣硬化脂聯(lián)素@丹紅注射液動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)兔

R743.1

A doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.10.082

?陜西省富平縣人民醫(yī)院(富平711700)