蔣敏玲　江　偉　楊　鍵　范劍薇

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中醫(yī)科(桂林541515)

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加味柴芍六君方對(duì)大鼠胃癌前病變的影響及機(jī)制研究

蔣敏玲江偉楊鍵范劍薇

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中醫(yī)科(桂林541515)

目的：探討加味柴芍六君方對(duì)胃癌前病變大鼠胃竇黏膜組織的生長(zhǎng)及Sky、突變型p53與Survivin蛋白表達(dá)的影響。方法：將120只大鼠平均分為6組，采用綜合造模法獲得胃癌前病變大鼠模型，用藥物干預(yù)16周后，觀察胃竇黏膜組織的生長(zhǎng)情況，并用免疫組化法觀察胃竇黏膜組織細(xì)胞中Sky、突變型p53與Survivin蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果:藥物干預(yù)組胃竇黏膜組織腺體萎縮、腸上皮化生及不典型增生的發(fā)生率明顯較模型對(duì)照組低(P< 0.05)；藥物干預(yù)組胃竇黏膜細(xì)胞中Sky的水平顯著高于模型對(duì)照組(P< 0.05)；藥物干預(yù)組胃竇黏膜細(xì)胞中突變型p53與Survivin蛋白水平明顯低于模型對(duì)照組(P< 0.05)。 結(jié)論:加味柴芍六君方可以從病征和病因兩方面抑制或逆轉(zhuǎn)大鼠胃癌前病變的發(fā)生發(fā)展，具有標(biāo)本兼治的效果。

胃癌占消化道腫瘤首位，我國(guó)屬高發(fā)區(qū)，每年新發(fā)現(xiàn)約40萬(wàn)胃癌患者，占世界總發(fā)病人數(shù)的42%[1]，嚴(yán)重威脅著人民的健康。胃癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟的漸進(jìn)性過(guò)程，往往要經(jīng)歷多年的胃癌前病變(PLGC)階段[2]。由于胃癌病因的多樣性和復(fù)雜性，針對(duì)病因的一級(jí)預(yù)防很難阻止胃癌的發(fā)生，而針對(duì)PLGC的二級(jí)預(yù)防則被認(rèn)為是減少胃癌發(fā)生的根本措施。但PLGC的病因、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及到多種發(fā)病因素和多條信號(hào)通路的紊亂，通過(guò)使用化學(xué)藥物往往無(wú)法同時(shí)針對(duì)多種發(fā)病因素和信號(hào)通路起作用，達(dá)到預(yù)防胃癌的作用。而中藥往往能針對(duì)胃癌前病變的多種病理變化起作用[3]，不僅能改善癥狀，而且對(duì)PLGC會(huì)部分逆轉(zhuǎn)，顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本研究室參考《醫(yī)宗金鑒》自擬加味柴芍六君方，在臨床胃癌前病變中療效較佳。本研究擬采用綜合造模法，應(yīng)用免疫組化法，考察該藥方對(duì)PLGC模型大鼠胃竇黏膜組織的生長(zhǎng)及Sky、突變型p53與Survivin蛋白表達(dá)的影響，揭示其抑制或逆轉(zhuǎn)PLGC發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制，為其臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器1.1 動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠120只(體重200±20 g)，桂林醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：SCXK(桂)2010-0001。

1.2 藥物 加味柴芍六君方(黨參、白術(shù)、茯苓、甘草、陳皮、法夏、柴胡、白芍、丹參、莪術(shù)、蒲公英、白花蛇舌草、半枝蓮)，藥物由桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中藥房提供，為單味藥分裝顆粒劑；N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)，批號(hào)：87070201，購(gòu)于美國(guó)sigma aldrich公司；脫氧膽酸鈉，批號(hào)：D6750，購(gòu)于美國(guó)sigma aldrich公司；鹽酸雷尼替丁膠囊，批號(hào)：20140401，廣東逸舒制藥有限公司；胃復(fù)春片，批號(hào)：A20140524，杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司。

1.3試劑 免疫組化Syk多克隆抗體試劑盒，批號(hào)：SAB1302523；抗Survivin多克隆抗體試劑盒，批號(hào)：SAB4105536；p53免疫組化S-P試劑盒：SAB3404726。均購(gòu)于美國(guó)sigma aldrich公司。

1.4儀器 冷凍切片機(jī)，徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海島析實(shí)業(yè)有限公司；電熱保溫箱，上海上器集團(tuán)試驗(yàn)有限公司；醫(yī)用冰箱，歐雪制冷設(shè)備有限公司；不銹鋼壓力鍋，美的電器有限公司；1000瓦電爐，江蘇恒力爐業(yè)有限公司；光學(xué)顯微鏡，美國(guó)bruker公司；圖像分析軟件，美國(guó)bruker公司。

2方法2.1藥物制備將MNNG用去離子水溶解，配制成濃度為1 g/L的儲(chǔ)備液，于4℃下的冰箱中避光保存，臨用時(shí)用雙蒸水配成100 μg/ml的濃度；鹽酸雷尼替丁膠囊(0.15g/粒)加工成0.03%的雷尼替丁顆粒飼料以供造模；脫氧膽酸鈉用雙蒸水新鮮配制成200 mmol/L母液避光冷藏保存，用時(shí)稀釋成20mmol/L(0.85%)；用80℃的熱水溶解中藥顆粒劑，配制成濃度為2.26g/ml的混懸液，于冰箱中保存，作為高濃度中藥備用；將胃復(fù)春片研成細(xì)粉，用蒸餾水溶解，配制成濃度為52.5 mg/ml的混懸液，于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2模型制備 參考文獻(xiàn)[4]，采用改進(jìn)后的綜合造模法造PLGC模型。具體如下：造模組大鼠進(jìn)食含0.03%雷尼替丁的顆粒飼料。自第二周起每日自由飲用100 μg/ml的MNNG(飲水瓶用油漆涂黑避光)，上午用55℃15%鹽水按10 ml/kg灌胃，下午用20 mmol/L(0.85%)脫氧膽酸鈉溶液按10 ml/kg灌胃并采取禁食一天、進(jìn)食兩天的方法使大鼠處于饑飽相間的狀態(tài)，禁食當(dāng)天下午按10 ml/kg以40%酒精灌胃，灌胃前后1h禁水。每周用鉗子夾住大鼠的尾部一次，使之保持激怒、爭(zhēng)斗狀態(tài)，持續(xù)30min。同時(shí)正常組大鼠以生理鹽水按10 ml/ (Kg·d)灌胃，與其他組灌胃時(shí)間同步。采用上述方法連續(xù)造模24周。

2.3分組及實(shí)驗(yàn)干預(yù)將大鼠隨機(jī)分為6組，分別為：空白對(duì)照組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、胃復(fù)春對(duì)照組與模型對(duì)照組，平均每組20只。除空白對(duì)照組正常進(jìn)食進(jìn)水外，其他5組以上述模型制備方法進(jìn)行造模。造模成功后，對(duì)各組大鼠給予相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)干預(yù)。按模型大鼠與正常成年人的體表面積之比確定給藥劑量，中藥低劑量組每天用2 ml稀釋4倍后的高濃度中藥混懸液灌胃，實(shí)際劑量為3.77 g/(Kg·d)；中藥中劑量組每天用2 ml稀釋2倍后的高濃度中藥混懸液灌胃，實(shí)際劑量為7.53 g/(Kg·d)；中藥高劑量組每天用2 ml高濃度中藥混懸液灌胃，實(shí)際劑量為15.06 g/(Kg·d)；胃復(fù)春對(duì)照組用2 ml胃復(fù)春混懸液灌胃，實(shí)際劑量為0.35 g/( Kg·d)；模型對(duì)照組和空白對(duì)照組每天用2 ml 0.9%氯化鈉溶液灌胃。連續(xù)實(shí)驗(yàn)干預(yù)16周后，所有大鼠禁食不禁水1d，斷頭處死。

2.4指標(biāo)檢查及方法2.4.1胃竇黏膜病理組織學(xué)觀察:迅速解剖處死后的各組大鼠，取胃，沿胃大彎切開(kāi)，用生理鹽水清洗干凈，取約0.5cm×0.5 cm大小的胃竇組織，用10%甲醛溶液固定。用石蠟包埋并連續(xù)切片，采用HE染色法進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察是否有腸上皮化生、腺體萎縮及不典型增生的情況。

2.4.2Syk蛋白、突變型p53蛋白的檢測(cè) :采用免疫組化S-P法檢測(cè)：病理切片按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行染色后，觀察Syk與突變型p53蛋白的表達(dá)情況，并使用顯微圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：于光學(xué)顯微鏡下觀察，存在胞膜、胞漿或胞核為棕黃色顆粒者即為陽(yáng)性。

2.4.3 Survivin蛋白的檢測(cè):采用免疫組化S-P染色方法檢測(cè)：用抗Survivin多克隆抗體試劑盒按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行S-P免疫組織化學(xué)染色后，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行檢測(cè)： 根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的比例與染色的強(qiáng)度分別記0-3分，具體為：陽(yáng)性細(xì)胞<10%記0分，10%-45%記1分，46%-70%記2分，>70%記3分；染色強(qiáng)度以多數(shù)細(xì)胞的染色反應(yīng)為準(zhǔn)，不著色記0分，淺黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分。將兩項(xiàng)指標(biāo)的記分相加，分為4級(jí)：0-1分為陰性(-)，1～2分為弱陽(yáng)性(+)，3～4分為陽(yáng)性(++)，5～6分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS21.0軟件處理，計(jì)數(shù)資料用百分比的形式表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料用形式表示，進(jìn)行雙側(cè)t檢驗(yàn)。P< 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1各組大鼠胃竇黏膜組織生長(zhǎng)情況比較經(jīng)過(guò)24周造模與16周實(shí)驗(yàn)干預(yù)后，模型對(duì)照組20例胃竇黏膜組織全部出現(xiàn)腺體萎縮、腸上皮化生及不典型增生的情況，而空白對(duì)照組20例胃竇黏膜組織全部生長(zhǎng)正常，表明造膜成功。而中藥組隨著劑量的遞增，腺體萎縮、腸上皮化生及不典型增生的發(fā)生率明顯降低(各組間χ2檢驗(yàn)，均有P< 0.05)，且呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)性。中藥高劑量組胃竇黏膜組織異常生長(zhǎng)的發(fā)生率與胃復(fù)春對(duì)照組相當(dāng)，數(shù)據(jù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P> 0.05)，見(jiàn)表1 。

表1　各組大鼠胃黏膜組織生長(zhǎng)異常

3.2各組大鼠胃竇黏膜組織中Syk蛋白表達(dá)情況比較實(shí)驗(yàn)干預(yù)16周后，模型對(duì)照組Syk蛋白陽(yáng)率僅為30.0%，顯著低于空白對(duì)照組的100.0%；中藥組隨著劑量升高，Syk蛋白陽(yáng)率明顯升高(各組間χ2檢驗(yàn)，均有P< 0.05)，呈現(xiàn)劑量相關(guān)性；中藥高劑量組Syk蛋白陽(yáng)率略高于胃復(fù)春對(duì)照組，數(shù)據(jù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P> 0.05)，見(jiàn)表2。

表2　各組大鼠胃竇黏膜組織中Syk蛋白陽(yáng)

3.3 各組大鼠胃竇黏膜組織中突變型p53蛋白表達(dá)情況比較 實(shí)驗(yàn)干預(yù)16周后，模型對(duì)照組突變型p53蛋白陽(yáng)性率為70.0%，而空白對(duì)照組不表達(dá)突變型p53蛋白；中藥組隨著劑量升高，突變型p53蛋白陽(yáng)性率明顯降低(各組間χ2檢驗(yàn)，均有P< 0.05)，呈現(xiàn)劑量相關(guān)性；中藥高劑量組突變型p53蛋白陽(yáng)性率與胃復(fù)春對(duì)照組相當(dāng)，數(shù)據(jù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)(見(jiàn)表3)。

3.4各組大鼠胃竇黏膜組織中Survivin蛋白表達(dá)情況比較 干預(yù)16周后，模型對(duì)照組胃竇黏膜組織Survivin蛋白的表達(dá)為強(qiáng)陽(yáng)性，而空白對(duì)照組為陰性；中藥組隨著劑量升高，Survivin蛋白的表達(dá)由陽(yáng)性減少到弱陽(yáng)性(各組間雙側(cè)t檢驗(yàn)，均有P< 0.05)，呈現(xiàn)劑量相關(guān)性；中藥高劑量組Survivin蛋白的表達(dá)與胃復(fù)春對(duì)照組相當(dāng)，均為弱陽(yáng)性，數(shù)據(jù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表4 。

表3　各組大鼠胃竇黏膜組織中突變型

表4　各組大鼠胃竇黏膜組織中Survivin

4討論在中醫(yī)范疇，PLGC并無(wú)相應(yīng)的名稱，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)，多以“痞滿”為主、亦可見(jiàn)于“嘈雜”、“胃痛”、“胃脹”等范疇。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，胃癌前病變發(fā)病的基礎(chǔ)是脾胃虛弱。其病機(jī)特點(diǎn)是本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜，本虛以脾胃氣虛為主，標(biāo)實(shí)則有氣滯、濕阻、血瘀、熱毒等。治療上應(yīng)以健脾益氣、理氣消脹、活血化瘀、養(yǎng)陰增液、清熱解毒、化痰軟堅(jiān)等為主[5]，其中尤其應(yīng)以健脾為主，許多胃病的治療都以健脾為先[6-7]。加味柴芍六君方(黨參、白術(shù)、茯苓、甘草、陳皮、法夏、柴胡、白芍、丹參、莪術(shù)、蒲公英、白花蛇舌草、半枝蓮等)中，以四君子湯坐鎮(zhèn)中州，益氣健脾，固護(hù)脾土；柴胡、白芍重在疏肝柔肝行氣；陳皮、半夏理氣化濕和胃；莪術(shù)、丹參活血通絡(luò)，使脾胃脈絡(luò)通暢、瘀滯消除；白花蛇舌草、半枝蓮、蒲公英清熱祛毒，促進(jìn)黏膜病變的修復(fù)。該方標(biāo)本兼治，虛實(shí)共調(diào)，正中病機(jī)，臨床顯示療效良好。

分子藥理學(xué)的研究表明，PLGC的病變過(guò)程中涉及到多種抑癌基因和癌基因的變化。其中，比較重要的有脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，Syk)，Syk為抑癌基因 ，其缺失會(huì)導(dǎo)致免疫細(xì)胞發(fā)育、成熟障礙，從而使腫瘤易于發(fā)生[8]。另外，突變型p53也被認(rèn)為是PLGC的病變過(guò)程中的一個(gè)標(biāo)志性的癌基因[9]， 它可以反映慢性萎縮性胃炎的腸上皮化生及異型增生的程度。此外，Survivin也常被用來(lái)當(dāng)作用PLGC的病變過(guò)程生物標(biāo)志分子[10]，屬于凋亡抑制蛋白，是迄今發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。

本研究的結(jié)果表明，在病征方面，加味柴芍六君方可以預(yù)防或逆轉(zhuǎn)大鼠胃竇黏膜腸上皮化生、腺體萎縮及不典型增生等病理過(guò)程。在實(shí)驗(yàn)研究中，中藥組大鼠胃竇黏膜異常生長(zhǎng)的發(fā)生率明顯低于模型對(duì)照組，而且呈現(xiàn)劑量相關(guān)性，高劑量組的效果與胃復(fù)春相當(dāng)。在病因方面，加味柴芍六君方也能針多種相關(guān)基因起作用。一方面，該方可以增加大鼠胃竇黏膜中Syk蛋白的表達(dá)，上調(diào)鼠胃竇黏膜細(xì)胞中Syk蛋白的水平。在實(shí)驗(yàn)中，中藥組大鼠胃竇黏膜細(xì)胞中的Syk水平明顯高于模型對(duì)照組，同樣是劑量相關(guān)的，高劑量組效果與胃復(fù)春相當(dāng)。另一方面，加味柴芍六君方還可以抑制大鼠胃竇黏膜細(xì)胞中突變型p53和Survivin的表達(dá)，中藥組大鼠胃竇黏膜細(xì)胞中突變型p53和Survivin水平明顯低于模型對(duì)照組，也具有劑量相關(guān)性，高劑量時(shí)與胃復(fù)春效果相當(dāng)。本研究表明，加味柴芍六君方可以從病征和病因兩方面抑制或逆轉(zhuǎn)PLGC的發(fā)生發(fā)展，具有標(biāo)本兼治的效果，為其臨床使用提供了一定的理論依據(jù)。

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(收稿2016-03-15；修回2016-04-19)

*廣西自治區(qū)桂林市科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目 (20140120-1-12)

胃腫瘤/中醫(yī)藥療法 @加味柴芍六君方 動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)大鼠

R735.2

Adoi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.10.080