黃　蓉　劉　劍　熊洪平　葉尚勉

?

復發(fā)性生殖器皰疹sHLA-G及外周血T細胞亞群和NK細胞的表達

黃蓉劉劍熊洪平葉尚勉

目的：明確復發(fā)性生殖器皰疹(RGH)患者治療前后外周血T細胞亞群和NK細胞及sHLA-G水平變化。方法：采用酶聯(lián)免疫吸附法和流式細胞儀分別檢測60例RGH患者治療前后血漿sHLA-G水平及外周血T細胞亞群和NK細胞表達。結(jié)果： RGH患者血漿sHLA-G水平治療前后分別為(11.03±14.57) U/mL和(0.41±0.45) U/mL，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)； NK細胞治療前后分別為(15.01±5.89)% 和(17.72±5.56)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞及CD4+/CD8+治療前后差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論：外周血sHLA-G及NK細胞表達可能與RGH患者病情發(fā)展有關(guān)。

復發(fā)性生殖器皰疹；sHLA-G；T細胞亞群；NK細胞

生殖器皰疹(genital herpes，GH)由單純皰疹病毒(herpes simplex virus, HSV)感染泌尿生殖器及肛周皮膚黏膜引起的一種慢性、復發(fā)性、難治愈的性傳播疾病，其臨床表現(xiàn)為紅斑、水皰及糜爛[1]。目前大量研究已證實復發(fā)性與HSV感染時的免疫功能紊亂有密切關(guān)系。本研究主要通過對復發(fā)性生殖器皰疹(Recurrent genital herpes，RGH)患者治療前后的外周血T細胞亞群、NK細胞表達水平及sHLA-G水平的測定，了解RGH患者免疫功能的變化，有助于臨床醫(yī)生評估RGH患者的細胞免疫功能狀態(tài)及評價治療的療效。

1　資料與方法

1.1臨床資料收集2012年1月至2014年6月我院皮膚性病科就診的60例復發(fā)性生殖器皰疹患者，其中男24例，女36例，年齡21～62歲，平均(37.4±9.97)歲，病程3個月～3年，平均(1.8±0.4)年。所有患者均有典型的癥狀、皮損及反復發(fā)作史，且復發(fā)次數(shù)在3～6次/年，所有患者均排除自身免疫性疾病及其它系統(tǒng)性疾病，且半年內(nèi)未接受任何免疫調(diào)節(jié)劑治療；所有患者治療前肝、腎功能檢查、血常規(guī)檢查無異常；同時收集42例我院健康體檢者作為對照組，其中男15例，女27例，年齡23～62歲,平均(36.5±10)歲，兩組性別、年齡比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2研究方法采集60例RGH患者和42例健康體檢者空腹肝素抗凝血2 mL各兩份，2 mL分離成血漿、2 mL抗凝血，并放置-30℃保存?zhèn)溆茫?0例患者開始服用鹽酸伐昔洛韋(麗科分，湖北科益藥業(yè)股份有限公司)0.3 g，每日2次，連續(xù)服用15天；匹多莫德片(萬適寧，太陽石藥業(yè)有限公司)0.8 g，每日2次，連續(xù)服用30天，為一療程；所有患者服用3個療程后隨訪，同時采集患者空腹肝素抗凝血2 mL各兩份，2 mL分離成血漿、2 mL抗凝血，并放置-30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3外周血T細胞亞群測定采用美國BECKMAN公司Cytomics FC 500 MCL流式細胞儀，試劑采用BECKMAN公司淋巴細胞亞群檢測試劑盒。按照試劑說明書中的步驟操作后上機，Cytomics FC 500 MCL流式細胞儀軟件自動分析，得出結(jié)果。

1.4血漿sHLA-G檢測血漿sHLA-G的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，試劑盒購自四川新創(chuàng)生物科技有限公司(產(chǎn)品批號：2013-01-22)，操作按試劑盒說明書中的步驟進行。

2　結(jié)果

2.1患者組與對照組外周血T細胞亞群活性和血漿sHLA-G水平的檢測結(jié)果CD3+T細胞(總T細胞)數(shù)量在健康對照組為(72.91±7.46)%，在RGH患者組為(69.17±7.66)%，兩者的差異具有統(tǒng)計學意義(t=2.453，P=0.016,P<0.05)，說明RGH患者CD3+T細胞數(shù)量低于健康對照組；血漿sHLA-G水平在健康對照組為(0.29±0.37)U/mL，在RGH患者組為(11.03±14.57)U/mL，兩者的差異具有統(tǒng)計學意義(t=4.769，P=0.000,P<0.05)，說明RGH患者血漿sHLA-G水平高于健康對照組；其他指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1　RGH患者組與對照組外周血T細胞亞群活性和血漿sHLA-G水平的比較±s)

表2　RGH治療前與治療后外周血T細胞亞群活性和血漿sHLA-G水平的比較±s)

3　討論

HLA-G(human leucocyte antigen-G)是非經(jīng)典HLA-l類分子，包括膜結(jié)合型的(mHLA-G)和可溶型(sHLA-G)。主要表達于胎盤組織、男性生殖細胞、移植組織、皮膚及感染組織等[2]。HLA-G對免疫的調(diào)節(jié)作用包括：(1)與自然殺傷細胞(NK)表面的殺傷細胞Ig樣受體(killer cell Ig-like receptor，KIR)直接作用，抑制NK細胞的溶細胞功能；通過凋亡機制導致NK細胞死亡進而抑制NK細胞的溶細胞功能[3]。(2)與KIRs相互作用下調(diào)CD4+及CD8+T細胞的活性。抑制CD4+T細胞增殖和誘導CD8+T細胞凋亡；在靶細胞表面的表達可以直接抑制CD8+T細胞的殺傷溶解作用。(3)與CD8+T細胞結(jié)合上調(diào)Fas配體(FasL)的表達及可溶性Fas的分泌，通過Fas/FasL途徑來誘導活化的CD8+T細胞和NK細胞凋亡[4,5]。

已報道HCMV、HSV-1、HIV-1、狂犬病毒、HCV等病毒感染中，HLA-G具有逃逸免疫監(jiān)視的作用[6,7]。而在HSV病毒感染中，HSV誘導感染神經(jīng)元和相鄰神經(jīng)元高度表達HLA-G來逃逸宿主免疫監(jiān)控。HSV感染所導致的自發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛膜外細胞滋養(yǎng)層細胞選擇性也表達HLA-G[8,9]。

RGH主要是由HSV所導致的復發(fā)性、難治性性傳播疾病，研究已證實，免疫因素在該病發(fā)展過程中至關(guān)重要，尤其在細胞免疫方面，表現(xiàn)為患者外周血T細胞亞群失衡，CD4+T細胞減少，CD8+T細胞不變或稍微減少，NK細胞的活性降低，進一步證明了細胞免疫功能紊亂在GH發(fā)病中的重要地位[10,11]。

本研究通過對60例RGH患者治療前后外周血T細胞亞群活性和血漿sHLA-G水平的檢測，了解RGH患者通過抗病毒藥物和免疫調(diào)節(jié)劑治療前后的細胞免疫狀況及sHLA-G水平的變化，結(jié)果顯示：RGH患者治療前存在免疫紊亂，與健康人群比較CD3+T細胞(總T細胞)數(shù)量減少(t=2.453，P<0.05)；CD4+T細胞數(shù)量、CD3+T細胞、CD8+T細胞和NK細胞數(shù)量變化不大(P>0.05)，表明RGH患者存在免疫功能降低的現(xiàn)象，但T細胞亞群變化并不大，結(jié)果與前述報道不一致，這一結(jié)果可能與我們觀察周期短有關(guān)；而RGH患者血漿sHLA-G水平高于健康人群(t=4.769，P<0.05)，據(jù)此推測：HSV感染時所致的sHLA-G在RGH患者體內(nèi)的高表達，可能會導致T細胞亞群活性發(fā)生改變。

目前臨床治療RGH普遍采用抗病毒藥物和免疫調(diào)節(jié)劑聯(lián)合治療方案，伐昔洛韋是一種特異性皰疹病毒抑制劑，為阿昔洛韋的L-纈氨酸酯，在體內(nèi)通過伐昔洛韋水解酶迅速并完全轉(zhuǎn)化為阿昔洛韋和纈氨酸來發(fā)揮病毒抑制作用，具有利用率高、半衰期長、見效快等優(yōu)點，可以選擇性的抑制病毒DNA聚合酶使其失去活性，從而阻止病毒復制，臨床運用已取得滿意的療效[12]。匹多莫德是一種新型的免疫促進劑，是焦谷氨酸和硫代脯氨酸合成的類二肽。匹多莫德具有調(diào)節(jié)非特異性和特異性免疫功能的作用，能激活NK細胞，促進有絲分裂原引起的淋巴細胞增殖，增強其介導的細胞毒活性，從而提高單核細胞的吞噬能力，增強中性粒細胞的趨化作用，并能抑制胸腺細胞的凋亡，促進淋巴細胞增殖，復原CD4+/CD8+比值，使細胞免疫功能低下時下降的CD4+/CD8+比值回升到正常，促進IL-2、IFN-γ的分泌，并增加淋巴細胞對IL-2的敏感性，誘導Th0向Thl轉(zhuǎn)化，有利于增強免疫系統(tǒng)對抗病毒的能力[13,14]。因此兩藥聯(lián)用治療RGH患者的病情和控制復發(fā)具有良好的治療優(yōu)勢，本研究中對RGH患者口服鹽酸伐昔洛韋聯(lián)合匹多莫德片治療3個月后檢測發(fā)現(xiàn)，患者NK細胞的數(shù)量高于治療前的水平(t=2.592，P<0.05)，而CD3+T細胞數(shù)量、CD4+T細胞及CD8+T細胞的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；血漿sHLA-G水平低于治療前(t=5.643，P<0.05)，表明治療后RGH患者NK細胞活性增高，sHLA-G表達水平下調(diào)，這一結(jié)果可能是藥物通過抑制病毒復制和激發(fā)淋巴細胞活性兩個方面的作用，降低RGH患者療后血漿sHLA-G表達水平，使sHLA-G對免疫細胞的抑制作用不能發(fā)揮，來達到NK細胞活性增高，提升RGH患者體內(nèi)免疫細胞的免疫監(jiān)視功能，從而控制RGH患者病情和減少復發(fā)，因此本研究結(jié)果在理論上為臨床治療RGH提供了依據(jù)。

[1] 張學軍.皮膚性病學[M].第8版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2013.232-233.

[2] Alvaro G, Vera R, LeMaoult J, et al. The immunosuppressive molecule HLA-G and its clinical implications[J]. Cri Rev Cli Lab Sci,2012,49(3):1040-8363.

[3] Zhang WQ, Xu DP, Liu D, et al. HLA-G1 and HLA-G5 isoforms have an additive effect on NK cytolysis[J]. Human Immunology,2014,75(2):182-371.

[4] Chen BG, Xu DP, Lin A, et al. NK cytolysis is dependent on the proportion of HLA-G expression[J]. Human Immunology,2013,74(3):286-575.

[5] 吳鳳霞,武麗君,羅雄燕.人白細胞抗原G 14 bp插入/缺失多態(tài)性和血漿可溶性人白細胞抗原G表達水平與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的相關(guān)性研究[J].中華臨床醫(yī)師雜志,2010,4(2):144-149.

[6] Roberta R, Daria B, Olavio R, et al. New Insights into HLA-G and inflammatory diseases[J]. Inflammation & Allergy-Drug Targets,2012,11(6):1871-5281.

[7] Marie-LF,Vincent M, Manuel RC, et al. Role for proteases and HLA-G in the pathogenicity of influenza A viruses[J]. J Cli Virol,2011,51(3):1386-6532.

[8] Mégret F, Prehaud C, Lafage M, et al. Modulation of HLA-G and HLA-E expression in human neuronal cells after rabies virus or herpes virus simplex type 1 infections[J]. Hum Immunol,2007,68(4):294-302.

[9] Lafon M, Prehaud C, Megret F, et al. Modulation of HLA-G expression in human neural cells after neurotropic viral infections[J]. J Virol,2005,79(24):15226-15237.

[10] 李萍,邵路平.復發(fā)性生殖器皰疹患者血清細胞因子的表達及機體細胞免疫功能的研究[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,2010,29(15):106-107.

[11] 莫翔,韋又銘.復發(fā)性生殖器皰疹患者免疫細胞功能研究進展[J].醫(yī)學綜述,2012,18(15):2385-2387.

[12] 鄭桂香,張玉,余蘭.伐昔洛韋聯(lián)合胸腺肽腸溶片間歇療法對復發(fā)性生殖器皰疹的預防效果[J].廣東醫(yī)學,2014,35(2):280-281.

[13] Riboldi P, Gerosa M, Meroni PL. Pidotimod: a reappraisal[J]. Int J Immunopathol Pharmacol,2009,22(2):255-262.

[14] 杜德榮,黃紹寬.伐昔洛韋聯(lián)合匹多莫德治療復發(fā)性生殖器皰疹的療效及對IL-2、IFN-γ表達的影響[J].皮膚性病診療學雜志,2014,21(1):26-28.

(收稿：2015-06-08修回：2015-09-09)

Expression of plasma sHLA-G, T lymphocyte subsets and NK cells in patients with recurrent genital herpes

HUANGRong,LIUJian,XIONGHongping,YEShangmian.

DepartmentofDermatology,SecondHospitalofChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu610041,China

LIUJian,E-mail: 409516734@qq.com

Objective: To determine the change of the level of T lymphocyte subsets, NK cells plasma and sHLA-G in the patients with recurrent genital herpes (RGH) before and after treatment. Methods: The level of plasma sHLA-G was detected by the enzyme linked immunosorbent assay and the levels of T lymphocyte subsets and NK cells were detected by the flow cytometry in 60 patients. Results: The level of NK cells in the patients before and after treatment was (15.01±5.89) % and (17.72±5.56) %, with a significant difference (P<0.05). The level of sHLA-G was (11.03±14.57) U/mL and (0.41±0.45) U/mL, with a significant difference (P<0.05). There was no significant difference in the levels of CD3+T cells, CD4+T cells, CD8+T cells and CD4+/CD8+in the patients before and after treatment. Conclusion: sHLA-G and NK cells may be related to the development of RGH.

RGH; sHLA-G; T lymphocyte subsets; NK cells

四川省教育廳重點科研項目(編號：11ZA067)

成都中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院皮膚科，成都，610041

劉劍，E-mail: 409516734@qq.com