高勇　李強　趙小磊　張娟麗　周靜

1 河南省食品藥品審評查驗中心　（鄭州　450004）

2 河南省醫(yī)療器械檢驗所?。ㄠ嵵荨?50003）

麻醉面罩的體外細(xì)胞毒性試驗研究

高勇1李強1趙小磊1張娟麗2周靜2

1 河南省食品藥品審評查驗中心（鄭州450004）

2 河南省醫(yī)療器械檢驗所（鄭州450003）

麻醉面罩是醫(yī)院手術(shù)室最常用的耗材之一，麻醉面罩的質(zhì)量直接影響到患者全身麻醉的程度以及手術(shù)的質(zhì)量，目前國內(nèi)制造麻醉面罩的原材料主要是聚氯乙烯（PVC），本研究依據(jù)《ISO10993-5∶2009醫(yī)療器械生物學(xué)評價 體外細(xì)胞毒性試驗》的要求，我們選擇了浸提液法中的MTT比色試驗和間接接觸法中的瓊脂擴散試驗對麻醉面罩進行體外細(xì)胞毒性評價［1］。

1.試驗材料與試劑

小鼠成纖維細(xì)胞L-929（購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫），胎牛血清（Hyclone公司），胰蛋白酶（美國Thermo公司），MTT溶液（Sigma公司），RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司），瓊脂（Sigma公司），中性紅（美國Amresco公司），麻醉面罩（來自生產(chǎn)企業(yè)送樣），陰性對照為高密度聚乙烯，陽性對照為5%二甲基亞砜（DMSO）。

2.樣品制備

在無菌條件下，按照3cm2/ml的浸提比例加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，放置于37?C的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24h。陽性對照用5%二甲基亞砜（DMSO），陰性對照材料用高密度聚乙烯，稱取高密度聚乙烯4g，按0.2g/mL的浸提比例加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基20mL，置于37?C培養(yǎng)箱孵育24 h，分別取陰性對照、陽性對照及供試品浸提液用于MTT比色試驗［2］；將麻醉面罩剪成直徑為5mm的圓片，用于瓊脂擴散試驗。

3.試驗方法

3.1四唑鹽（MTT）比色法

取生長旺盛的小鼠成纖維細(xì)胞L929，用胰蛋白酶消化成細(xì)胞懸液后，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×104個細(xì)胞/mL，將配置好的細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，分別設(shè)陰性對照組、陽性對照組和供試品組，每組各設(shè)6孔，每孔接種100μL細(xì)胞懸液，然后將96孔板放置于CO2培養(yǎng)箱（含體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳?xì)怏w）37?C培養(yǎng)24h后，棄去原培養(yǎng)液。陰性對照組加入高密度聚乙烯（HDPE）浸提液，陽性對照組加入5%DMSO溶液。供試品組加入試驗樣品浸提液，每孔100μL，置于37?C5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72h，更換培養(yǎng)液后的72h后，將96孔板放置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，然后每孔加入質(zhì)量濃度為5g/L的MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄去孔內(nèi)液體，每孔加入150μLDMSO，置振蕩器上振蕩10min，在酶標(biāo)儀570nm和630nm波長下測定吸光度OD值，計算相對增殖率（relative growth rate，RGR，RGR =實驗組OD值/陰性對照組OD值×100%）［3］。

3.2瓊脂擴散法

將生長旺盛的細(xì)胞用胰蛋白酶消化分散細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2.5×105細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液。吸取10mL細(xì)胞懸液于培養(yǎng)皿中，在37?C含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24h，吸出每一培養(yǎng)皿中的生長培養(yǎng)液，用Hank's緩沖液淋洗單層細(xì)胞后，加10mL新制備的瓊脂培養(yǎng)基，待瓊脂培養(yǎng)基在室溫下凝固（約30min）后，加入10mL中性紅活體染色液并在暗處避光保存15～20min，棄去多余的中性紅溶液，每只實驗材料做兩只培養(yǎng)皿，每一個培養(yǎng)皿放置三個試樣，每個樣品盡量彼此遠(yuǎn)離，并遠(yuǎn)離培養(yǎng)皿壁。用倒置顯微鏡觀察試驗材料和對照的周圍褪色區(qū)域，并按下列指標(biāo)計算每一件樣品的平均褪色指數(shù)和溶解指數(shù)［4～5］，并按下式表示細(xì)胞反應(yīng)：

細(xì)胞反應(yīng)=褪色指數(shù)/溶解指數(shù)

3.3統(tǒng)計學(xué)處理

實驗組數(shù)據(jù)以x±s表示，各試驗組與陰性對照組組間比較采用t檢驗。

4.試驗結(jié)果

4.1四唑鹽（MTT）比色法

MTT比色法結(jié)果表明，麻醉面罩A和B的細(xì)胞毒性均為2級，麻醉面罩A的相對增值率（RGR）為59%，與陰性對照組有顯著性差異（P＜0.05）；麻醉面罩B的相對增值率（RGR）為68%，與陰性對照組有顯著性差異（P＜0.05）。 見表1。

4.2瓊脂擴散法

瓊脂擴散法結(jié)果顯示，陰性對照組細(xì)胞毒性為0級，陽性對照組細(xì)胞毒性為2級，兩種麻醉面罩的細(xì)胞毒性均為1級，具有輕度細(xì)胞毒性反應(yīng)（表2）。

表1. 試驗樣品的細(xì)胞相對增值率

表2. 試驗樣品的細(xì)胞毒性試驗結(jié)果

5.討論

麻醉面罩是醫(yī)院手術(shù)室最常見的耗材之一，在臨床使用過程中與人體皮膚直接接觸。為了觀察麻醉面罩對人體組織、細(xì)胞的影響，我們選取了體外細(xì)胞毒性試驗，細(xì)胞毒性試驗主要是通過倒置顯微鏡直接觀察高分子材料對細(xì)胞的形態(tài)、增殖和抑制的影響，來定性或定量地評價實驗材料對體外細(xì)胞的毒性作用。體外細(xì)胞毒性試驗常用的主要有以下兩種試驗方法：浸提液試驗和間接接觸試驗。

四唑鹽（MTT）比色法是浸提液法的一種，依據(jù)GB/T16886.12-2005規(guī)定的浸提比例，對供試品材料進行浸提，然后將浸提液直接加入到細(xì)胞中，定量地觀察供試品材料溶出物對細(xì)胞狀態(tài)的影響。由于MTT比色法具有操作簡便、敏感性高、重復(fù)性好等優(yōu)點，在生物醫(yī)用材料的生物學(xué)評價中應(yīng)用十分廣泛。其工作原理是當(dāng)黃色水溶性的MTT加入細(xì)胞后，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原成為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶物甲瓚（Formazan），二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚（Formazan），用酶標(biāo)儀可以測定溶液的吸光度，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量及活力，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比［6］。因此，通過MTT比色法，可以計算出供試品的細(xì)胞增殖率，定量的評估細(xì)胞毒性大小。

本實驗中采用的瓊脂擴散法是間接接觸法的一種，該方法是將供試品直接放在瓊脂層上面，通過瓊脂層的擴散，觀察對細(xì)胞形態(tài)的影響，該方法受溶出物在瓊脂層上擴散程度的影響，當(dāng)溶出物分子量小，易溶于水，其敏感性高，反之，當(dāng)溶出物分子量大，難溶于水，其敏感性低。缺點是褪色區(qū)域指標(biāo)及溶解指標(biāo)都是通過實驗人員的鏡下觀察得出，結(jié)果判斷時易受實驗人員主觀因素的影響。

本實驗中MTT比色法檢測時兩種麻醉面罩的細(xì)胞毒性均為2級，即輕度細(xì)胞毒性，用瓊脂擴散法檢測時細(xì)胞毒性均為1級，即輕度細(xì)胞毒性。以上結(jié)果說明這兩種麻醉面罩均具有輕度的細(xì)胞毒性，可能與PVC的生產(chǎn)過程中添加塑化劑有關(guān)。而麻醉面罩是醫(yī)院手術(shù)室使用頻率很高的醫(yī)療耗材，因此建議生產(chǎn)企業(yè)改進生產(chǎn)工藝，選用質(zhì)量穩(wěn)定、優(yōu)質(zhì)的PVC材料，或選用新型環(huán)保材料聚丙烯（PP）和熱塑性彈性體TPE，在國外醫(yī)療領(lǐng)域已經(jīng)開始取代PVC。

［1］ ISO 10993-5：2009， Biological evaluation of medical devices -Part 5∶ Tests for in vitro cytotoxicity［S］.

［2］ 國家藥品監(jiān)督管理局.GB/T16886.12-2005《醫(yī)療器械生物學(xué)評價第12部分∶樣品制備與參照樣品》［S］.北京∶中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2005.

［3］ 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局、中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T14233.2-2005 醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法.第2部分∶生物學(xué)試驗方法.2005，8～9.

［4］ 賈文英， 史弘道.細(xì)胞毒性試驗評價醫(yī)用裝置生物相容性的研究概況.實用美容整形外科雜志， 2001，12（5）∶253～255.

［5］ YY/T 0127. 9-2009口腔醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第2單元 試驗方法 細(xì)胞毒性試驗：瓊脂擴散法及濾膜擴散法［S］

［6］ 呂曉迎.牙科材料細(xì)胞毒性評定的新方法（MTT試驗）.中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，1995， 30（6）∶377～379.

In Vitro Cytotoxicity Test of Anaesthetic Mask

GAO Yong1LI Qiang1ZHAO Xiao-lei1ZHANG Juan-li2ZHOU Jing2
1 Henan Provincial Food and Drug Evaluation and Inspection Center（Zhengzhou450004）
2 Medical Instrument Testing Institute of Henan（Zhengzhou450003）

According to the method of ISO 10993-5∶2009 Biological evaluation of medical devices-Part5∶ Tests for in vitro cytotoxicity， the cytotoxicity of anaesthetic masks was tested by MTT assay and agar diffusion test. The results showed the cytotoxicity of two kinds of anaesthetic masks was both 2 grade by MTT assay. The RGR of two kinds of anaesthetic masks was 59% and 68%， respectively. By agar diffusion test， The cytotoxicity of two kinds of anaesthetic masks was both 1 grade. The anaesthetic masks have slight cytotoxicity.

anaesthetic mask，MTT assay，agar diffusion test

1006-6586（2016）09-0060-03

R318.08

A內(nèi)容提要： 參考ISO10993-5∶2009的體外細(xì)胞毒性評價方法要求，用MTT比色法和瓊脂擴散法檢測麻醉面罩的體外細(xì)胞毒性。MTT比色法結(jié)果表明，兩種麻醉面罩的細(xì)胞毒性均為2級，其中麻醉面罩A的相對增值率（RGR）為59%，麻醉面罩B的相對增值率（RGR）為68%；瓊脂擴散法結(jié)果顯示，兩種麻醉面罩的細(xì)胞毒性均為1級，具有輕度的細(xì)胞毒性。

麻醉面罩MTT比色法瓊脂擴散法

2016-08-10

高勇，工程師，研究方向：醫(yī)療器械檢測，技術(shù)審評。