張志超，余輝攀，楊玉琴，肖順麗，曹丹亮，張宏桂

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京100102；2.菏澤金豐魯?shù)律锟萍加邢薰?，山東菏澤274000）

菏澤鳳丹牡丹花花青素提取工藝研究

張志超1，余輝攀1，楊玉琴1，肖順麗1，曹丹亮2，張宏桂1

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京100102；2.菏澤金豐魯?shù)律锟萍加邢薰?，山東菏澤274000）

目的以花青素含量為指標(biāo)優(yōu)選菏澤鳳丹牡丹花的最佳提取工藝。方法采用比色法測(cè)定其含量，比較乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、超聲頻率等因素對(duì)花青素提取率的影響。采用單因素水平考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（10%～90%）、料液比（1∶10～1∶40）、提取時(shí)間（10～40 min）、超聲頻率（16～40 kHz）對(duì)花青素提取率的影響，以確定花青素最佳提取工藝。結(jié)果在單因素考察中，乙醇最佳體積分?jǐn)?shù)范圍為70%～90%，最佳料液比范圍為1∶15～1∶25，最佳超聲頻率范圍為16～32 kHz，最佳提取時(shí)間范圍為10～25 min；正交試驗(yàn)極差結(jié)果分析表明，所考察的因素中，對(duì)鳳丹牡丹花花青素提取率的影響程度依次為超聲頻率＞溶劑體積分?jǐn)?shù)＞液料比＞提取時(shí)間；花青素的最佳提取工藝為25倍70%乙醇，24 kHz超聲提取12 min；按優(yōu)化后的提取工藝，花青素的提取率為0.42%。結(jié)論該提取工藝可行，具有工藝流程簡(jiǎn)單和提取率高的優(yōu)點(diǎn)。

鳳丹牡丹花；花青素；比色法；提取工藝

牡丹Paeonia suffruticosa Andr.屬芍藥科芍藥屬植物，為我國(guó)特有。牡丹花作為觀賞性花卉，享譽(yù)古今中外，并被尊為“花中之王”和“國(guó)花”［1］。其藥用功效記載于《淄博本草》，牡丹花味苦、淡，性平，無(wú)毒，有調(diào)經(jīng)活血的功效，主治婦女月經(jīng)不調(diào)，經(jīng)行腹痛［2］。2013年，菏澤鳳丹牡丹花被國(guó)家衛(wèi)生部批準(zhǔn)為食品新原料。花青素是牡丹花色形成的物質(zhì)基礎(chǔ)，花色苷是花青素與糖以糖苷鍵結(jié)合而成的一類化合物，存在于植物的花、果實(shí)和葉中，使其呈現(xiàn)由紅、紫紅到藍(lán)等不同的顏色?；ㄇ嗨貜V泛應(yīng)用于治療微循環(huán)失調(diào)、抗?jié)?、抗炎癥等，其含量測(cè)定主要有高效液相色譜（HPLC）法、對(duì)照品法和pH示差法，HPLC法主要用于測(cè)花青素單體的含量，對(duì)照品法和pH示差法均可用于測(cè)花青素總含量［3-4］。但花色素對(duì)照品很不穩(wěn)定，限制了HPLC法的應(yīng)用；pH示差法誤差較大，且樣品易渾濁。故本研究中采用對(duì)照品法來(lái)測(cè)定鳳丹牡丹花花瓣中花青素的含量，對(duì)照品法以矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷為對(duì)照品，且通過(guò)單因素考察和正交試驗(yàn)優(yōu)化了花青素的提取工藝，為開(kāi)發(fā)利用牡丹花提供了依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1　儀器與試藥

1.1儀器

KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；U-2000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵；B-220型恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）；BS11OS型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；DZ-2BC型烘箱（天津市麥斯特儀器有限公司）。

1.2試藥

矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷對(duì)照品（月旭科技有限公司，批號(hào)為10428，純度大于98%）；牡丹花采自山東省菏澤市，經(jīng)曹丹亮工程師鑒定為鳳丹牡丹Paeoniaostii T.Hong et J.X.Zhang，5℃保存。

2　方法與結(jié)果

2.1花青素含量測(cè)定

2.1.1檢測(cè)波長(zhǎng)確定

用甲醇配制的對(duì)照品溶液和少量牡丹花提取液，在UV-2401PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)的200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，分別得到對(duì)照品溶液和牡丹花提取液吸收光譜圖，見(jiàn)圖1 A和圖1 B。綜合分析后，選擇536 nm波長(zhǎng)作為牡丹花提取物中花青素吸光度的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1　光譜掃描曲線圖

2.1.2方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：稱取矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇溶解，定容至10 mL容量瓶中，配制成1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，備用。分別精密吸取0.10，0.75，1.00，1.25，1.50 mL貯備液置5 mL容量瓶中，用甲醇定容。在536 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖2。

圖2　矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

精密度試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液1.0 mL，按擬訂條件進(jìn)樣測(cè)定6次。結(jié)果的RSD=0.96%（n=6），表明該儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液1.5 mL，分別于0，2，4，6，8，10 h時(shí)測(cè)定吸光度值。結(jié)果的RSD= 1.39%（n=6），表明該溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：稱取保存在5℃的牡丹花瓣1.014 6 g 6份，乙醇濃度為70%，液料比為1∶10，16 kHz超聲波下提取1次，提取時(shí)間為0.5 h。結(jié)果的RSD=1.63%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：分別精密吸取0.5，0.8，1.0，1.5，1.8，2.0 mL質(zhì)量濃度為10 μg/mL的對(duì)照品溶液加入至6份已知含量為0.008 8%的牡丹花瓣，依法測(cè)定含量并計(jì)算回收率。結(jié)果的RSD=1.21%（n=6），表明該方法回收率良好。

2.2提取工藝單因素試驗(yàn)

2.2.1提取方法

溫浸提?。悍Q取5℃保存的牡丹花瓣1.014 6 g，加入10倍量70%乙醇，水浴60℃，浸泡0.5 h，濾過(guò)，提取濾液，減壓回收溶劑，殘?jiān)蛹状级ㄈ葜?0 mL容量瓶。結(jié)果花青素含量為0.088%。

回流提取：稱取5℃保存的牡丹花瓣1.014 6 g，加入10倍量70%乙醇，水浴60℃，回流提取0.5 h，濾過(guò)，提取濾液，減壓回收溶劑，殘?jiān)蛹状级ㄈ葜?0 mL容量瓶。結(jié)果花青素含量為0.096%。

超聲提取：稱取保存在5℃的牡丹花瓣1.014 6 g，加入10倍量70%乙醇，水溫60℃，16 kHz超聲提取0.5 h，濾過(guò)，提取濾液，減壓回收溶劑，殘?jiān)蛹状级ㄈ葜?0 mL容量瓶。結(jié)果花青素含量為0.167%。

可見(jiàn)，超聲提取效果最佳。

2.2.2提取溶劑

稱取5℃保存的牡丹花瓣1.014 6 g，在料液比為1∶15，16 kHz超聲波下提取1次，提取時(shí)間為0.5 h，考察水及不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)花青素提取率的影響。結(jié)果經(jīng)水和10%，30%，50%，70%，90%乙醇提取后，花青素含量分別為0.086%，0.117%，0.134%，0.155%，0.169%，0.150%。可見(jiàn)，乙醇提取效果較好，且乙醇的體積分?jǐn)?shù)在50%～70%效果最佳。

2.2.3提取時(shí)間

稱取5℃保存的牡丹花瓣1.014 6 g，在料液比為1∶10，70%乙醇，16 kHz超聲波下提取1次，考察不同提取時(shí)間對(duì)花青素提取率的影響。結(jié)果提取10，15，20，25，30，40 min后，花青素含量分別為0.151%，0.175%，0.171%，0.165%，0.165%，0.157%?？梢?jiàn)，提取時(shí)間在15～20 min最佳。

2.2.4液料比

稱取5℃保存的牡丹花瓣1.014 6 g，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，16 kHz超聲波下提取1次，提取時(shí)間為0.5 h，考察不同液料比對(duì)花青素含量的影響。結(jié)果料液比為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40時(shí)，花青素含量分別為0.162%，0.180%，0.181%，0.183%?？梢?jiàn)，隨著溶劑量的增加，花青素含量提高，溶劑量超過(guò)20倍時(shí)，溶劑量增加但提取率提高并不多，且液料比增大，給后期處理工序增加困難，增加生產(chǎn)成本，故料液比不宜太高，宜選擇1∶15～1∶25。

2.2.5超聲頻率

稱取5℃保存的牡丹花瓣1.014 6 g，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，在料液比為1∶10，不同超聲頻率下提取0.5 h。結(jié)果超聲頻率在16，24，32，40 kHz時(shí)，花青素含量分別為0.165%，0.179%，0.171%，0.163%?？梢?jiàn)，花青素的提取率開(kāi)始先隨超聲頻率增加而增加，隨后又隨頻率增加而減少，這與文獻(xiàn)［5］的報(bào)道一致。這可能是因?yàn)殡S超聲頻率的增加，場(chǎng)內(nèi)所產(chǎn)生的空化效應(yīng)、粉碎等作用減弱，導(dǎo)致提取率變低，故選擇頻率為16～32 kHz。

2.3正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

以乙醇體積分?jǐn)?shù)（因素A）、提取時(shí)間（因素B）、料液比（因素C）、超聲頻率（因素D）等因素作為考察對(duì)象，分別單因素考察，找到相應(yīng)合適的條件，然后對(duì)4因素、3水平進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，以獲取最佳工藝參數(shù)。根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，因素A，B，C，D對(duì)花青素提取率具有重要影響。采用L9（34）因素水平表選用最佳提取參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1和表2。以花青素含量為考察指標(biāo)。由表2中極差R值大小顯示，超聲頻率極差最大，其次為提取次數(shù)和液料比，提取時(shí)間極差相差最小。對(duì)于牡丹花花青素而言，各因素對(duì)提取效果影響的大小順序?yàn)镈＞A＞C＞B。通過(guò)直觀分析方法，篩選出最佳提取方案A2B1C3D2，即稱取適量牡丹花，加入25倍70%乙醇，24 kHz超聲提取12 min。

表1　因素水平表

2.4最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

稱取適量牡丹花，在最佳提取條件下重復(fù)試驗(yàn)3次，取平均值，結(jié)果見(jiàn)表3。可見(jiàn)，牡丹花中花青素提取率平均達(dá)0.42%，該提取工藝穩(wěn)定，提取率高。

2.5不同品種牡丹花花青素的含量測(cè)定

結(jié)果見(jiàn)表4。

3　討論

本研究結(jié)果顯示，采用超聲方法提取，乙醇為提取溶劑有多種影響因素。通過(guò)單因素考察結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲頻率、提取時(shí)間對(duì)提取率有較大影響；正交試驗(yàn)結(jié)果表明，各因素對(duì)提取效果影響順序?yàn)镈＞A＞C＞B；通過(guò)直觀分析方法，篩選出最佳提取方案A2B1C3D2，即稱取適量鳳丹牡丹花，加入25倍70%乙醇，24 kHz超聲提取12 min。該方法鳳丹牡丹花中花青素提取率平均達(dá)0.42%，該提取工藝穩(wěn)定，提取率高。與醇提法相比，水提花青素明顯不夠徹底，故不宜采用水提法。

表2　L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3　驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

表4　不同品種牡丹花花青素的含量

4個(gè)品種的鳳丹牡丹花花瓣的花青素含量依次為紅色牡丹（0.174%）、淡紅色牡丹（0.154%）、紫色牡丹（0.778%）、黃色牡丹（0.083%）。

牡丹花除了作為觀賞性花卉外，還有潛在的尚未開(kāi)發(fā)的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本文對(duì)鳳丹牡丹花花青素的提取工藝和花青素含量測(cè)定方法的建立，為開(kāi)發(fā)利用牡丹花提供了依據(jù)。

［1］郭少霞，張玉剛，任茹.中國(guó)牡丹研究進(jìn)展［J］.萊陽(yáng)農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，20（2）：116-121.

［2］趙亦成，蔣紀(jì)洋.淄博本草［M］.北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，1995：12.

［3］楊兆艷.pH示差法測(cè)定桑椹紅色素中花青素含量的研究［J］.食品科技，2007，32（4）：201-203.

［4］吐?tīng)柡椋挝撵o，堵年生.紫外分光光度法測(cè)定木賽萊斯酒中花青素的含量［J］.中國(guó)民族醫(yī)藥雜志，2006，12（4）：54-55.

［5］郭孝武，張福成，林書(shū)玉，等.超聲提取對(duì)黃連素提出率的影響［J］.中國(guó)中藥雜志，1995，20（11）：673-675.

Study on Optimum Extraction Technology of Anthocyanidin in Paeoniaostii Flower

Zhang Zhichao1，Yu Huipan1，Yang Yuqin1，Xiao Shunli1，Cao Danliang2，Zhang Honggui1
（1.College of Chinese Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing，China100102；2.Heze Jinfeng Lude Biotechnology Co.，Ltd.，Heze，Shandong，China274000）

ObjectiveTo optimize the extraction technology of anthocyanidin inPaeoniaostii Flower.M ethodsThe contents of anthocyanidin were detected by colorimetric determination and the factors（ethanol concentration，solid-liquid ratio，extraction time and ultrasonic wave）were studied to compare their influence on the extraction ratio of anthocyanidin.Single factor tests were studied to compare the influence of ethanol concentration（10%-90%），solid-liquid ratio（1∶10-1∶40），extraction time（10-40 min），ultrasonic wave（16-40 kHz）on the extraction ratio of anthocyanidin.The influence of each factor was analyzed and the best extraction technology was determined.ResultsSingle factor tests gave the optimized arrange of factors as follows：ethanol concentration（70%-90%），solidliquid ratio（1∶15-1∶25），extraction time（10-25 min），ultrasonic wave（16-32 kHz）.Range analysis of orthogonal experiment showed that the influence of each factors in the extraction of anthocyanidin was ultrasonic wave＞ethanol concentration＞solid-liquid ratio＞extraction time.The best extraction condition was ratio of solid-liquid 1∶25，70%ethanol as solvent，24 kHz ultrasonic waveextractwith 12mineachtime.By theoptimizedextraction technology，theextractionratioof anthocyanidinwas0.42%. ConclusionThe extraction technology is feasible with efficient and simple process.

Paeoniaostii Flower；anthocyanidin；colorimetric determination；extraction technology

TQ461；R284．2；R282．71

A

1006－4931（2016）16－0014－04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：31070328。

張志超（1992-），男，碩士研究生，研究

方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)，（電子信箱）zhangzc5@ 163.com；張宏桂（1955-），男，教授，主要研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)的應(yīng)用及體內(nèi)代謝，本文通訊作者，（電話）010-84738642（電子信箱）bzy714@163.com。

（2016－05－01）