湯麗芝，史亞軍，劉繼平，郭東艷，劉景楠

（陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西咸陽712046）

秦皮提取物及秦皮甲素對大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的保護作用

湯麗芝，史亞軍，劉繼平，郭東艷，劉景楠

（陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西咸陽712046）

目的探討秦皮提取物及秦皮甲素對大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的保護作用，比較秦皮提取物與秦皮甲素的抗炎效果。方法分別采用角叉菜膠和弗氏完全佐劑制備大鼠急性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型，并給予秦皮提取物和秦皮甲素干預(yù)后，測量大鼠足厚度、體重變化，并記錄關(guān)節(jié)評分，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法測定大鼠血漿白細胞介素1 （IL-1 ）、腫瘤壞死因子- （TNF- ）、丙二醛（MDA）水平及超氧化物歧化酶（SOD）活性變化。結(jié)果與空白組比較，2種炎癥模型大鼠模型組的IL-1 ，TNF- ，MDA水平顯著上升，SOD活性顯著下降（P＜0.05）；與模型組比較，在2種炎癥模型中，秦皮提取物組和秦皮甲素組IL-1 ，TNF- 含量均顯著降低（P＜0.05）；在角叉菜膠模型中，秦皮甲素在致炎1，2 h表現(xiàn)出抑制作用（P＜0.05），秦皮提取物對SOD活力有顯著影響（P＜0.05），秦皮甲素組在降低大鼠TNF- 水平上較秦皮提取物組顯著（P＜0.05）；在佐劑模型中，秦皮提取物組和秦皮甲素組MDA含量顯著降低（P＜0.05），秦皮提取物組關(guān)節(jié)評分較低（P＜0.05），秦皮甲素組在降低IL-1 水平上較秦皮提取物組更顯著（P＜0.05）。結(jié)論秦皮提取物及秦皮甲素對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有一定的保護作用，秦皮甲素可能為秦皮的主要抗炎物質(zhì)，其作用機制可能與調(diào)節(jié)IL-1 和TNF- 水平有關(guān)。

秦皮提取物；秦皮甲素；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；角叉菜膠；弗氏完全佐劑

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種以關(guān)節(jié)及其周邊組織病變?yōu)橹鞯亩喟l(fā)性、對稱性、慢性全身性自身免疫疾病，目前西醫(yī)并無有效的手段和特效藥物進行治療，只能通過控制關(guān)節(jié)及其他組織的炎癥，修復(fù)關(guān)節(jié)損傷來緩解病情。秦皮是陜西道地藥材，植物基源豐富，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載其“主風(fēng)寒濕痹，洗洗寒氣，除熱，目中青翳白膜”，現(xiàn)代臨床主要用于治療多種炎癥、細菌性痢疾等［1-3］。秦皮甲素是秦皮主要的化學(xué)成分，具有抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等作用［4-5］。本研究中分別采用角叉菜膠和弗氏完全佐劑制備大鼠急性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型，對秦皮提取物及秦皮甲素治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的療效進行初步評價，為進一步深入研究提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1　儀器、動物與試藥

1.1儀器

AR1140萬分之一電子分析天平（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司）；iMark酶標(biāo)儀18485（美國BIO-RAD公司）。

1.2動物

SD大鼠，108只，雄性，SPF級，體重（165±15）g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供，動物合格證號SCXK（陜）2012-003。

1.3試藥

秦皮飲片（陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號為20150901），經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室胡本祥教授鑒定；萬通筋骨片（通化萬通藥業(yè)股份有限公司，批號為150805N）；阿司匹林腸溶片（辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號為BJ27748）；λ-角叉菜膠（美國Sigma公司，貨號為22049-5G-F）；弗氏完全佐劑（美國Sigma公司，貨號為F5881）；卡介苗凍干粉（陜西生物制品研究所）；秦皮甲素（陜西漢德興生物科技有限公司，含量為98.45%）。白細胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒均由南京森貝伽生物科技有限公司提供。

2　方法與結(jié)果

2.1方法

2.1.1造模與給藥

角叉菜膠模型［6-7］：SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機分為6組，即空白組、模型組、秦皮甲素組、秦皮提取物組、阿司匹林組、萬通筋骨組，各8只。稱重并按以下劑量給予λ-角叉菜膠，秦皮甲素組0.10 g/kg（折合生藥量7.2 g/kg），秦皮提取物組7.2 g/kg（生藥量），阿司匹林組0.225 g/kg（去薄膜包衣），萬通筋骨組0.3 g/kg（去薄膜包衣），模型組和空白組灌胃10 mL/kg生理鹽水，每天灌胃1次，連續(xù)7 d。末次灌胃1 h后，除空白組外，其余大鼠右足趾部皮下注射0.1 mL的1%角叉菜膠溶液致炎，空白組注射0.1 mL生理鹽水，標(biāo)記右足測量部位，分別在致炎前與致炎后1，2，3，4，5 h測量右足厚度，計算足腫脹度。足腫脹度=致炎后足厚度-正常足厚度。

佐劑模型［8-9］：SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機分為6組，即空白組、模型組、秦皮甲素組、秦皮提取物組、阿司匹林組、萬通筋骨組，各10只。給空白組大鼠右足趾注射0.1 mL生理鹽水，其余大鼠注射9 mg/mL的弗氏完全佐劑0.1 mL致炎，致炎后第8天開始灌胃，連續(xù)灌胃2周，給藥劑量同角叉菜膠模型項下方法。在末次灌胃后記錄大鼠全身病變的四肢關(guān)節(jié)評分：無紅腫計為0分，小趾關(guān)節(jié)紅腫計為1分，趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹計為2分，踝關(guān)節(jié)下足腫脹計為3分，踝關(guān)節(jié)內(nèi)全部足趾腫脹計為4分，最高可計16分。體重增長率=（末次給藥體重-給藥前體重）/給藥前體重×100%。

2.1.2樣本采集及指標(biāo)測定

兩組均在試驗結(jié)束后麻醉大鼠，取血，離心血樣，取上清液，放入4℃冰箱中保存，備用。采用ELISA法嚴(yán)格按照試劑盒說明書測定IL-1β，TNF-α，MDA含量及SOD活性。

2.1.3統(tǒng)計學(xué)處理

2.2結(jié)果

2.2.1對角叉菜膠模型大鼠足腫脹的影響

與模型組比較，秦皮甲素組在致炎后1，2 h，表現(xiàn)出對足腫脹的抑制作用（P＜0.05）；秦皮提取物組及萬通筋骨組在致炎后5 h出現(xiàn)抑制作用（P＜0.05）；阿司匹林組在致炎后1，2，3，4，5 h均有明顯的抑制效果（P＜0.05）。詳見表1。

表1　各組給藥后對角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響（±s，cm，n=8）

表1　各組給藥后對角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響（±s，cm，n=8）

注：與模型組比較， P＜0.05。表3同。

組別模型組阿司匹林組萬通筋骨組秦皮甲素組秦皮提取物組1 h 0 . 1 8 ± 0 . 0 2 0 . 1 0 ± 0 . 0 4 0 . 1 5 ± 0 . 0 5 0 . 1 2 ± 0 . 0 4 0 . 1 5 ± 0 . 0 4 2 h 0 . 3 0 ± 0 . 0 6 0 . 2 0 ± 0 . 0 7 0 . 2 7 ± 0 . 0 8 0 . 2 1 ± 0 . 0 8 0 . 2 5 ± 0 . 0 5 3 h 0 . 3 7 ± 0 . 0 7 0 . 2 1 ± 0 . 0 7 0 . 3 3 ± 0 . 0 9 0 . 3 0 ± 0 . 0 8 0 . 3 2 ± 0 . 0 7 4 h 0 . 3 5 ± 0 . 0 8 0 . 2 2 ± 0 . 0 5 0 . 3 0 ± 0 . 0 6 0 . 2 8 ± 0 . 0 7 0 . 2 9 ± 0 . 0 7 5 h 0 . 3 3 ± 0 . 0 7 0 . 2 3 ± 0 . 0 4 0 . 2 4 ± 0 . 0 6 0 . 2 8 ± 0 . 0 7 0 . 2 4 ± 0 . 0 7

2.2.2對角叉菜膠模型大鼠血漿IL-1β，TNF-α，MDA，SOD的影響

與模型組比較，空白組大鼠的IL-1β，TNF-α，MDA水平均明顯降低，而SOD活性顯著升高（P＜0.05），表明角叉菜膠誘導(dǎo)大鼠足腫脹模型成功；與模型組比較，秦皮甲素組大鼠的IL-1β和TNF-α水平均顯著降低（P＜0.05），秦皮提取物組大鼠的IL-1β和TNF-α水平均顯著降低，而SOD活性顯著升高（P＜0.05）；與兩組陽性藥物組比較，秦皮甲素組大鼠的TNF-α水平較萬通筋骨組降低顯著（P＜0.05），秦皮提取物組大鼠的TNF-α水平較阿司匹林組顯著升高（P＜0.05），且IL-1β水平較萬通筋骨組顯著降低（P＜0.05）；秦皮甲素組大鼠的TNF-α水平降低較秦皮提取物組顯著（P＜0.05）。詳見表2。

2.2.3佐劑模型大鼠關(guān)節(jié)炎評分和體重增長率

與模型組比較，阿司匹林組與秦皮提取物組關(guān)節(jié)炎評分明顯降低（P＜0.05）；萬通筋骨組體重增長最顯著（P＜0.05）。詳見表3。

2.2.4佐劑模型大鼠血漿IL-1β，TNF-α，MDA，SOD的含量

與模型組比較，空白組大鼠的IL-1β，TNF-α，MDA水平均降低，而SOD活性升高（P＜0.05），表明佐劑模型大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型成功。與模型組比較，秦皮甲素組和秦皮提取物組大鼠血漿IL-1β，TNF-α，MDA水平均顯著降低（P＜0.05），而SOD活性差異不明顯（P＞0.05）；與兩組陽性藥物組比較，秦皮甲素組大鼠的IL-1β水平較阿司匹林組及萬通筋骨組降低均更顯著（P＜0.05），秦皮提取物組大鼠的MDA水平較阿司匹林組降低顯著（P＜0.05），秦皮甲素組IL-1β水平降低較秦皮提取物組更顯著（P＜0.05）。詳見表4。

表2　各組角叉菜膠模型大鼠血漿IL-1 ，TNF- ，MDA，SOD比較（±s，n=8）

表2　各組角叉菜膠模型大鼠血漿IL-1 ，TNF- ，MDA，SOD比較（±s，n=8）

注：與模型組比較， P＜0.05；與阿司匹林組比較， P＜0.05；與萬通筋骨組比較，#P＜0.05；與秦皮提取物組比較， P＜0.05。表4同。

組別空白組模型組阿司匹林組萬通筋骨組秦皮甲素組秦皮提取物組I L -1 （p g / m L）1 2 . 0 6 ± 1 . 1 8 2 8 . 7 4 ± 1 . 9 8 2 0 . 3 2 ± 3 . 1 6 2 3 . 2 9 ± 2 . 6 0 2 3 . 2 2 ± 4 . 3 5 1 8 . 3 2 ± 6 . 1 7#T N F - （p g / m L）9 8 . 8 9 ± 5 . 8 8 1 4 1 . 1 5 ± 4 . 3 8 1 1 9 . 4 9 ± 5 . 5 4 1 4 1 . 8 6 ± 7 . 7 8 1 2 0 . 5 5 ± 7 . 8 6#1 3 4 . 2 2 ± 4 . 0 5 M D A（n m o l / m L）6 . 3 9 ± 0 . 5 3 7 . 2 5 ± 0 . 4 0 6 . 7 8 ± 0 . 4 6 6 . 7 7 ± 0 . 3 6 7 . 0 8 ± 0 . 3 6 7 . 1 7 ± 0 . 4 9 S O D（U / m L）1 5 7 . 2 8 ± 6 . 2 4 1 5 0 . 1 3 ± 3 . 5 3 1 5 6 . 1 1 ± 7 . 7 8 1 5 4 . 9 4 ± 7 . 9 7 1 5 4 . 2 9 ± 8 . 9 9 1 5 9 . 3 6 ± 8 . 4 1

表3　佐劑模型大鼠關(guān)節(jié)炎評分與體重增長率比較（n=10）

表4　佐劑模型大鼠血漿IL-1 ，TNF- ，MDA，SOD的含量比較（±s，n=10）

表4　佐劑模型大鼠血漿IL-1 ，TNF- ，MDA，SOD的含量比較（±s，n=10）

組別空白組模型組阿司匹林組萬通筋骨組秦皮甲素組秦皮提取物組I L -1 （p g / m L）8 . 9 7 ± 1 . 2 8 2 3 . 6 2 ± 2 . 9 2 1 9 . 2 9 ± 1 . 5 7 1 8 . 8 0 ± 1 . 7 9 1 6 . 7 2 ± 1 . 1 4#2 0 . 0 4 ± 2 . 0 3 T N F - （p g / m L）9 1 . 1 6 ± 1 0 . 4 2 1 8 4 . 0 4 ± 8 . 8 8 1 6 3 . 2 4 ± 1 0 . 6 7 1 6 5 . 1 8 ± 8 . 8 4 1 6 4 . 1 6 ± 1 0 . 4 2 1 6 1 . 7 1 ± 9 . 3 0 M D A（n m o l / m L）6 . 4 4 ± 0 . 5 4 9 . 6 0 ± 2 . 1 5 7 . 8 9 ± 1 . 0 8 6 . 5 6 ± 1 . 0 2 7 . 0 6 ± 1 . 4 4 6 . 9 3 ± 0 . 5 4 S O D（U / m L）1 0 8 . 1 0 ± 4 . 9 6 9 7 . 3 1 ± 6 . 2 9 1 0 7 . 7 9 ± 8 . 4 5 1 1 1 . 2 6 ± 3 . 3 6 9 9 . 2 4 ± 5 . 9 1#9 8 . 3 1 ± 3 . 4 6#

3　討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是基于炎癥刺激的滑膜細胞增殖，進而導(dǎo)致具有侵襲性的血管翳形成，血管翳的擴張可促進軟骨和骨的破壞，導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能喪失的自身免疫疾病［10］。目前，臨床并無有效的治愈藥物，控制關(guān)節(jié)及其他組織的炎癥以緩解癥狀是重要治療手段。

TNF-α和IL-1β是促進類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜炎發(fā)生的重要炎性因子。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中，TNF-α主要產(chǎn)生于其滑膜中的滑膜巨噬細胞，可刺激纖維母細胞增殖及淋巴細胞的活性［11］。IL-1β在免疫調(diào)節(jié)及炎癥進程中具有重要影響，與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的活動性和組織形態(tài)學(xué)特征密切相關(guān)［12］。阻斷TNF-α和IL-1β對治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有重要意義。MDA是脂質(zhì)過氧化重要產(chǎn)物，其損傷能加速膜損傷，通過測定MDA可間接反映膜系統(tǒng)受損程度。SOD是體內(nèi)重要的氧化酶，能清除氧自由基，是對抗氧自由基損傷的首要物質(zhì)。阿司匹林和萬通筋骨片治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎臨床療效確切。本研究中選用TNF-α和IL-1β水平對秦皮在非特異性和特異性關(guān)節(jié)炎模型的抗炎效果進行評價，選用MDA水平和SOD活性對秦皮保護機體因炎癥導(dǎo)致的氧化損傷情況進行評價，并分別與治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的阿司匹林和萬通筋骨片進行對比。

本研究中，角叉菜膠模型研究結(jié)果顯示，秦皮甲素和秦皮提取物能在一定程度上抑制試驗性關(guān)節(jié)炎的炎性反應(yīng)，秦皮甲素在初期對炎癥表現(xiàn)出明顯的抑制作用，秦皮提取物可提高SOD活性，降低氧自由基對機體帶來的損傷。秦皮甲素與阿司匹林的抗炎效果相當(dāng)，較萬通筋骨片抗炎效果略強。佐劑關(guān)節(jié)炎模型是一種變態(tài)炎癥模型，是由遲發(fā)性超敏反應(yīng)引起的全身性病變，常作為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型進行研究。該模型研究結(jié)果顯示，秦皮提取物和秦皮甲素對試驗性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生具有抑制作用，并在一定程度上降低脂質(zhì)過氧化物對機體的影響。秦皮甲素的抗炎效果優(yōu)于秦皮提取物，與阿司匹林、萬通筋骨片效果相當(dāng)。在試驗過程中，秦皮甲素組和秦皮提取物組大鼠精神狀況較其他組活躍，且模型組與萬通筋骨組大鼠脾臟部分發(fā)生粘連。

綜上所述，秦皮提取物和秦皮甲素對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有一定的保護作用，秦皮甲素可能為秦皮的主要抗炎物質(zhì)，其作用機制可能與調(diào)節(jié)IL-1β和TNF-α水平有關(guān)。

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Protective Effects of Fraxini Cortex Extract and Aesculin on Rats with Rheumatoid Arthritis

Tang Lizhi，Shi Yajun，Liu Jiping，Guo Dongyan，Liu Jingnan
（Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang，Shaanxi，China712046）

ObjectiveTo investigate the effect of fraxini cortex extract and aesculin on rheumatoid arthritis of rats and compare the anti-inflammatory effect of fraxini cortex extract and aesculin.M ethodsTwo model groups of arthritis rats induced by adjuvant which were similar to arthritis rheumatic and acute rats induced by carrageenan which were similar to acute arthritis were made and treated with fraxini cortex extract.The paw thickness，weight changes were measured，and the joint score were recorded；the changes of IL-1β，TNF-α，MDA，and SOD in serum were detected by ELISA.ResultsCompared with the blank group，the levels of IL-1β，TNF- ，and MDA in the two model groups were significantly increased，and the activity of SOD significantly reduced（P＜0.05）；the contents of IL-1β and TNF-α fraxini in the cortex extract and aesculin group were decreased significantly（P＜0.05）；the aesculin showed inhibition effect on proinflammatory after 1，2 h（P＜0.05），fraxini cortex extract showed significant effect on SOD（P＜0.05），and aesculin showed better effect on reducing the level of TNF-α than fraxini cortex extract in the carageen model（P＜0.05）.In the adjuvant model，the MDA content decreased significantly in both groups（P＜0.05），the aesculin group had lower joint score（P＜0.05），and aesculin showed better effect on reducing the level of IL-1β than fraxini cortex extract（P＜0.05）.ConclusionFraxini cortex extract and aesculin has certain therapeutic effect on rheumatoid arthritis，and aesculin may be a major anti-inflammatory.Its mechanism may be associated with IL-1β and TNF-α levels.

fraxini cortex extract；aesculin；RA；carrageenan；freund′s complete adjuvant

R285．5；R282．71

A

1006－4931（2016）16－0027－04

國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥行業(yè)科研專題項目，項目編號：201507002；陜西省中藥制藥重點學(xué)科資助項目，項目編號：1999。

湯麗芝，女，在讀碩士研究生，研究方向為中藥制劑，（電子信箱）270662988@qq.com；史亞軍，男，博士研究生，教授，研究方向為中藥新劑型、新技術(shù)，本文通訊作者，（電子信箱）328573751@qq.com。

（2016－05－01）