景春娥，李萍，杜欣軍，王碩

（天津科技大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457）

硅膠表面阪崎克羅諾桿菌生物膜的形態(tài)觀察

景春娥，李萍，杜欣軍，王碩*

（天津科技大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457）

阪崎克羅諾桿菌是一種食源性條件致病菌，它能導(dǎo)致嬰幼兒罹患?jí)乃佬孕∧c結(jié)腸炎、菌血癥、腦膜炎等疾病。在硅膠表面形成生物膜，可能是導(dǎo)致阪崎克羅諾桿菌感染的重要途徑。使用結(jié)晶紫法測(cè)定阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894在食品級(jí)硅膠表面的靜態(tài)生物膜成熟曲線，并且采用掃描電子顯微鏡對(duì)其在食品級(jí)硅膠表面的靜態(tài)生物膜的形成過(guò)程進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。觀察到阪崎克羅諾桿菌在硅膠表面形成了具有三維結(jié)構(gòu)的成熟生物膜形態(tài)。在3 h能粘附到硅膠表面，并且在12h～24h已經(jīng)形成了比較成熟的生物膜。

阪崎克羅諾桿菌；生物膜；硅膠；粘附；成熟

細(xì)菌生物膜是指細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中附著于物體表面而形成的由細(xì)菌細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞外多聚物基質(zhì)等所組成的膜樣多細(xì)菌復(fù)合體，胞外多聚物主要成分包括多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂蛋白、胞外DNA等[1]。生物膜能夠增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)外界環(huán)境的耐受性[2]。細(xì)菌生物膜的形成是一種高度依賴環(huán)境信號(hào)的動(dòng)態(tài)過(guò)程，即由多細(xì)胞參與不同階段組成的一個(gè)過(guò)渡性過(guò)程，主要包括粘附、微菌落形成、成熟生物膜以及游離菌的播散與再次定植[2-3]。在食品加工環(huán)境中，食品加工器械以及餐飲器具表面的污染是病原菌傳播到食品中的主要原因之一[4]。在生物膜的保護(hù)作用下，即使通過(guò)消毒液或常規(guī)的清洗后，這些菌可能仍然存活[5]，產(chǎn)生持續(xù)的交叉污染，不但會(huì)降低食品的保質(zhì)期而且會(huì)給消費(fèi)者帶來(lái)很大的危險(xiǎn)[6-7]。阪崎克羅諾桿菌具有生存溫度范圍廣[8]、抗?jié)B透壓能力強(qiáng)[9]的特征，并且具有高效的生物膜形成能力[10-12]，這些特征是其在食品加工環(huán)節(jié)成功傳播并且成為潛在污染源的重要原因。硅膠因其具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、吸附性能強(qiáng)、熱穩(wěn)定性好、安全性等特點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，如采用食品級(jí)硅膠為原料制成的奶嘴、奶瓶以及食品蛋糕模具等[13]。

阪崎克羅諾桿菌能夠在硅膠表面形成生物膜[8，14]，并且會(huì)隨著生物膜的成熟，生物膜微菌落或游離細(xì)菌發(fā)生播散，交叉污染準(zhǔn)備配方奶粉的器具。隨后，這些成功播散的細(xì)菌生物膜團(tuán)塊會(huì)隨著食物進(jìn)入胃，并且保護(hù)其免受胃酸的傷害[10-11，15]。因此，這些細(xì)菌可能粘附到嬰幼兒的腸上皮細(xì)胞，成為易感嬰幼兒的潛在危險(xiǎn)因素。已經(jīng)有研究表明，嬰幼兒配方奶粉的人工喂養(yǎng)與其罹患?jí)乃佬越Y(jié)腸炎疾病具有正相關(guān)性[16-17]。由于阪崎克羅諾桿菌感染所導(dǎo)致的新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎，其特征為腸黏膜甚至為腸深層的壞死，本癥是新生兒消化系統(tǒng)極為嚴(yán)重的疾病[16，18]，但是，目前對(duì)于阪崎克羅諾桿菌在食品級(jí)硅膠表面的生物膜形成過(guò)程及其形成機(jī)制的研究報(bào)道很少。

由于阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894是從與新生兒重癥監(jiān)護(hù)室疾病爆發(fā)有關(guān)的配方奶粉中分離的菌株[19]，也是克羅諾桿菌屬中第一個(gè)通過(guò)全基因組測(cè)序的菌株[20]。本研究利用食品級(jí)硅膠材質(zhì)來(lái)研究阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894在材料表面靜態(tài)生物膜的形成過(guò)程，以便模擬研究食品加工環(huán)境中阪崎克羅諾桿菌生物膜的形成特點(diǎn)。采用掃描電子顯微鏡對(duì)阪崎克羅諾桿菌在食品級(jí)硅膠片表面的生物膜的形成過(guò)程進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察。因此，對(duì)于阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894在硅膠表面生物膜形成過(guò)程的研究對(duì)于防止嬰兒配方奶粉調(diào)制過(guò)程中的交叉污染的發(fā)生具有現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌株（C.sakazakii ATCC BAA-894）：購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心，是已經(jīng)測(cè)序菌株；細(xì)菌粘附材料（食品級(jí)硅膠）：東莞市鴻凱橡膠制品有限公司。

1.2 儀器與試劑

SU-1510掃描式電子顯微鏡：購(gòu)自日本日立公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板與24孔細(xì)胞培養(yǎng)板：購(gòu)自美國(guó)Corning公司；結(jié)晶紫：購(gòu)自天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；LB培養(yǎng)基：購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌懸液的制備

平板劃線挑取單菌落于盛有5 mL液體LB培養(yǎng)基的試管中，37℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12 h得到種子液，4℃，3 000 r/min，離心5 min棄上清，收集菌體沉淀；然后用無(wú)菌的PBS緩沖液重懸菌體，4℃，3 000 r/min，離心5 min，重復(fù)3次，收集菌體沉淀，用無(wú)菌新鮮的液體LB培養(yǎng)基重懸菌液；按照比例，菌液 ∶甘油（4∶1）加入到1.5 mL Eppendorf管中混勻，用封口膜封口，-20℃保存?zhèn)溆?。培養(yǎng)均采用以下條件：按1∶100（體積比）的比例將休止細(xì)菌懸液接種于液體LB培養(yǎng)基中，于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)（150 r/min）過(guò)夜；按1%的接種量轉(zhuǎn)接后同樣條件培養(yǎng)2 h，菌液在600 nm處測(cè)OD值，并用無(wú)菌新鮮的液體LB培養(yǎng)基將菌液OD值調(diào)至0.1，取1.0 mL菌液離心3 000 r/min,5 min，棄上清，加入1mL液體LB培養(yǎng)基用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 阪崎克羅諾桿菌生物膜形成能力測(cè)定方法

在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上測(cè)定阪崎克羅諾桿菌生物膜形成能力，具體方法步驟如下[21-23]：在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中分別加入40 μL菌液和160 μL的LB培養(yǎng)基，在恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h，以未接種菌體的LB培養(yǎng)基為對(duì)照；用酶標(biāo)儀在600 nm讀數(shù)，測(cè)菌體吸光度；用PBS洗3次，劇烈搖動(dòng)去除未黏附細(xì)菌，在室溫下干燥固定生物膜15 min；加入200 μL 0.1%的結(jié)晶紫染料染色30 min；用無(wú)菌水沖洗至對(duì)照孔為無(wú)色；用200 μL 95%乙醇溶解生物膜中的染料，室溫靜置10 min；將溶解的液體轉(zhuǎn)入新的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定吸光值。

1.3.3 阪崎克羅諾桿菌在硅膠表面生物膜形成過(guò)程

硅膠的準(zhǔn)備和清洗：參照文獻(xiàn)[14-15]方法，將食品級(jí)硅膠（1 cm×1 cm）樣片浸泡在含有15%磷酸溶液（phosphoric acid solution）燒杯中進(jìn)行超聲波處理20 min，用蒸餾水沖洗，用中性洗滌劑洗1 min后用蒸餾水洗滌。將清洗干凈的樣片置于55℃干燥2 h，置于封閉的離心管中（用50 mL離心管），高壓蒸汽滅菌121℃，15 min。

在硅膠表面阪崎克羅諾桿菌生物膜培養(yǎng)：參照文獻(xiàn)[11，24]，將無(wú)菌的樣片浸泡在含有菌懸液2.0 mL的24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)，0、3、5、7、12、18、24、48h，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出培養(yǎng)好的樣片，進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

1.3.4 阪崎克羅諾桿菌生物膜的掃描電鏡觀察

參照文獻(xiàn)[25]的方法，用無(wú)菌水洗去硅膠樣片表面未粘附的細(xì)菌，用2%戊二醛固定液4℃固定過(guò)夜，用0.1 mol/L的PBS（pH 7.2）沖洗 2次，再用1%的鋨酸（室溫）固定2h，用 0.1 mol/L PBS（pH 7.2）洗 2次，用25%、50%、70%、80%、90%系列濃度乙醇脫水各10 min，100%乙醇脫水兩次，每次15 min，通風(fēng)櫥干燥，噴金，掃描電鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 阪崎克羅諾桿菌在食品級(jí)硅膠表面生物膜的形成過(guò)程

阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894在食品級(jí)硅膠片表面生物膜形成的變化過(guò)程，如圖1。

圖1 硅膠表面阪崎克羅諾桿菌生物膜形成Fig.1 C.sakazakii biofilm formation on silicone surfaces

食品級(jí)硅膠片對(duì)照組與在含有菌液的培養(yǎng)液中培養(yǎng)了 3、5、7、12、18、24、48 h 的硅膠片之間的 OD595值都具有顯著性差異。結(jié)果表明，從3 h開(kāi)始，在硅膠表面已經(jīng)有菌體粘附，具體分析如下：3 h與5 h之間的OD595值有顯著性差異，5 h與7 h之間的OD595值有顯著性差異，生物膜曲線呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，這個(gè)階段浮游菌粘附于硅膠表面并且菌體數(shù)量劇增。7 h與12 h之間的OD595值無(wú)顯著性差異，12 h與18 h之間的OD595值無(wú)顯著性差異。7 h與18 h之間的OD595值具有顯著性差異，從菌株ATCC BAA-894的生物膜形成曲線的趨勢(shì)可以看到，這是個(gè)逐漸遞增的過(guò)程，生物膜的產(chǎn)量在不斷的增加，并且比較平穩(wěn)。18 h與24 h之間的OD595值有顯著性差異，從曲線可以看出，培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到24 h時(shí)菌株ATCC BAA-894的生物膜達(dá)到了最大生長(zhǎng)量。24 h與48 h之間，生物膜形成量呈現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì)。

2.2 阪崎克羅諾桿菌在食品級(jí)硅膠片表面生物膜形成的形態(tài)學(xué)觀察

阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894在LB液體培養(yǎng)基中于食品級(jí)硅膠片表面的生物膜形成的過(guò)程中幾個(gè)關(guān)鍵階段的掃描電鏡形態(tài)圖片，如圖2。

圖2 阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894在食品級(jí)硅膠片表面生物膜發(fā)育不同階段的掃描電鏡圖片F(xiàn)ig.2 Scanning microscope imaging of C.sakazakii ATCC BAA-894 biofilm developmental stages on silicone

0 h（圖A）時(shí)為無(wú)菌生長(zhǎng)的硅膠表面結(jié)構(gòu)。3 h（圖B）時(shí)硅膠表面有少量菌體粘附在了硅膠表面，菌體零散分布，形態(tài)正常。12 h（圖C）時(shí)硅膠表面的部分區(qū)域以“微菌落（microcolony）”形態(tài)存在，菌體簇狀聚集，菌體之間有多根鞭毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)相互連接，菌體分泌的胞外多聚物質(zhì)（extracellular polymeric substances，EPS）包繞在微菌落周圍，并與硅膠表面牢固結(jié)合，使黏附更加牢靠。18 h時(shí)（圖D）硅膠表面的大部分區(qū)域生物膜微菌落更加密集，形成了大片的生物膜，并且厚度增加，出現(xiàn)了大量胞外聚合物將部分菌體以及微菌落包裹其中，并且從菌體的形態(tài)可以得知，菌體長(zhǎng)度大多數(shù)在2 μm左右，細(xì)菌生長(zhǎng)旺盛，菌體之間鞭毛或菌毛樣結(jié)構(gòu)相互交錯(cuò)，便于菌體之間的“交流”，基本形成了成熟的生物膜體系。24 h（圖E）時(shí)生物膜系統(tǒng)中微菌落之間的連接變得松散，并且生物膜表面有一些菌體形態(tài)發(fā)生了變化，菌體開(kāi)始固縮，從桿狀變成了球狀。48 h（圖F）時(shí)硅膠表面菌體形態(tài)發(fā)生了很大的變化，部分菌體從桿狀變成了球狀，此外，在生物膜整個(gè)體系中由于菌體的死亡以及胞外聚合物的瓦解，瓦解后的生物膜系統(tǒng)骨架呈現(xiàn)出來(lái)，其上面粘附了大量死亡的菌體，“隔板”狀的結(jié)構(gòu)縱橫交錯(cuò)。

3 結(jié)論與討論

細(xì)菌生物膜的形成過(guò)程主要包括粘附、微菌落形成、成熟生物膜以及游離菌的播散與再次定植，這些階段貫穿了細(xì)菌生物膜生態(tài)系統(tǒng)的整個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程[2-3]。根據(jù)掃描電子顯微鏡的觀察，我們發(fā)現(xiàn)阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894在硅膠表面的靜態(tài)生物膜的形成過(guò)程。在3 h，我們認(rèn)為阪崎克羅諾桿菌處在起始粘附階段（attachement）。在 5 h～12 h期間，可以界定為微菌落形成（microcolony）階段，菌體數(shù)量劇增并且定植于材質(zhì)表面，菌體菌毛或鞭毛樣結(jié)構(gòu)變得更多，菌體之間連接更緊密，并且開(kāi)始分泌胞外多粘物質(zhì)，相互吸引而聚集形成小菌落，并與材料表面牢固結(jié)合，使黏附更加牢靠。在12 h～24 h期間，可以界定為成熟生物膜（mature biofilm）階段，在硅膠的表面已經(jīng)具有了成熟生物膜的雛形，從比較獨(dú)立的小菌落連成了成片的相互交錯(cuò)的大菌落，在體系中出現(xiàn)了“隔板”樣的結(jié)構(gòu)，這些“隔板”或許就是生物膜系統(tǒng)中的“水通道”，能夠運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)排泄代謝廢物，并且能夠保持濕潤(rùn)的生物膜生態(tài)系統(tǒng)的正常運(yùn)。從理論上來(lái)說(shuō)，播散期（dispersal）是成熟生物膜可由活躍生長(zhǎng)的細(xì)胞子代脫落、胞外聚合物或密度感應(yīng)系統(tǒng)的自身程序化過(guò)程解聚，或者其他因素導(dǎo)致生物膜微菌落的分離，游離的細(xì)胞尋找新的定植環(huán)境[2-3]，但是這個(gè)動(dòng)態(tài)的播散過(guò)程，無(wú)法在電鏡下面看到，我們的電鏡圖片觀察到，在24 h～48 h菌體形態(tài)發(fā)生了變化，在硅膠表面從桿狀固縮成了球狀，附著在隔板結(jié)構(gòu)表面，我們推測(cè)，這可能與實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的生物膜培養(yǎng)環(huán)境有關(guān)，在這個(gè)時(shí)間段，由于培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡，代謝廢物大量積累，環(huán)境pH值變化等等因素，導(dǎo)致了菌體的死亡與溶解。

在生物膜形成的整個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程中，菌體的粘附能力可能決定著生物膜不斷擴(kuò)張的命運(yùn)。菌體粘附能力的大小與被粘附材料的表面性質(zhì)、菌體表面性質(zhì)以及周圍生長(zhǎng)環(huán)境的一些參數(shù)有關(guān)。通常，粘附可能發(fā)生在5 s～30 s，主要可以界定為可逆與不可逆粘附[26]。可逆粘附可能與范德華力和靜電力和疏水作用有關(guān)，在此階段，細(xì)菌容易被外界剪切力從表面清除。細(xì)菌的不可逆粘附發(fā)生在細(xì)菌表面附屬結(jié)構(gòu)的錨定和細(xì)胞外多聚物質(zhì)的產(chǎn)生[27]，如脂多糖的結(jié)構(gòu)，粘附素和其他蛋白以及脂磷壁酸[3，28]。這些結(jié)構(gòu)可能會(huì)有助于細(xì)菌粘附到非生物材料的表面[29-30]。一些研究表明，不可逆粘附在4℃～20℃時(shí)通常發(fā)生在20 min到4 h內(nèi)[31-32]。要清除不可逆粘附的細(xì)胞是比較困難，需要借助于更強(qiáng)剪切力（擦洗或刮）和化學(xué)類清除劑，如酶，洗滌劑，表面活性劑，殺菌劑以及加熱作用[33-34]。硅膠具有較大的表面積及空容[15]，通常具有很大的吸附性。這種吸附性使得細(xì)菌更容易粘附在上面，并且形成成熟的生物膜。

由于食品加工環(huán)境的復(fù)雜性，本研究無(wú)法從靜態(tài)的電鏡圖片來(lái)說(shuō)明生物膜的形成過(guò)程，但是，從形態(tài)的變化上，為生物膜的形成過(guò)程的研究提供了一點(diǎn)資料。通過(guò)以上分析，阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894在3 h已經(jīng)能粘附到硅膠表面，因此，在食品加工環(huán)境以及日常的食品制備結(jié)束后，要盡快清洗加工器械，以免產(chǎn)生食品污染的隱患。此外，應(yīng)該結(jié)合其他更先進(jìn)的生物膜培養(yǎng)技術(shù)和檢測(cè)技術(shù)，實(shí)時(shí)觀察或模擬食品加工環(huán)境中生物膜的動(dòng)態(tài)形成過(guò)程，為能夠更好的控制食品加工環(huán)境中的生物膜尋找更好的策略。

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Morphological Observation of Cronobacter sakazakii Biofilm on the Surfaces of Silicone

JING Chun-e，LI Ping，DU Xin-jun，WANG Shuo*
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Cronobacter sakazakii is an emerging pathogen which causes a life-threatening syndrome of meningitis，necrotizing colitis and meningoencephalitis in neonates and infants.Biofilm formed on the surface of silicone is an important possible source of clinical infections caused by this pathogen.Crystal violet staining method was employed to determine biofilm maturation curves of C.sakazakii ATCC BAA-894 on silicone.The processes of static biofilm formation on the silicone were investigated using the scanning electron microscope（SEM）.The bacteria on the surface had been observed to aggregate and grow into microcolonies，form 3-dimensional structures and communal relationships，resulting in a complex biofilm.In addition，the SEM revealed biofilm morphologies with variable amounts of extracellular polymeric substances，the presence of microcolonies and the mature biofilm formed between 12 h and 24 h.

Cronobacter sakazakii；biofilm；silicone；attachment；maturation

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.14.037

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃課題（2014BAD04B03）作者簡(jiǎn)介：景春娥（1985—），女（漢），博士研究生，研究方向：食品安全與檢測(cè)技術(shù)。

*通信作者：王碩（1969—），男（漢），教授，博士，研究方向：食品安全和免疫學(xué)檢測(cè)。

2015-07-28