劉梁，余熙前，陳彬，胡小貞，陳新

（1.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023；2.農(nóng)產(chǎn)品加工湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430023）

米糠多糖鐵的制備及其與ctDNA的相互作用

劉梁1，2，余熙前1，陳彬1，胡小貞1，陳新1，2

（1.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023；2.農(nóng)產(chǎn)品加工湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430023）

在堿性條件下用米糠多糖與三氯化鐵制備米糠多糖鐵（RBPIC）。理化試驗(yàn)表明米糠多糖與三氯化鐵生成了穩(wěn)定的RBPIC，RBPIC在pH4.1～12.6的條件下可以穩(wěn)定存在，RBPIC中鐵含量為18.41%；通過紫外-可見吸收光譜研究了RBPIC與ctDNA的相互作用，結(jié)果表明RBPIC與ctDNA存在明顯的相互作用，結(jié)合常數(shù)為7.27×106L/mol；瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)表明BRPIC/DNA可以有效促進(jìn)DNA凝聚。

米糠；多糖鐵；ctDNA；紫外-可見吸收光譜

基因治療被認(rèn)為有希望治愈如血友病、囊性纖維化等遺傳和傳染類疾病的一種新型技術(shù)[1]?；蛑委煹某晒﹃P(guān)鍵取決于核酸高效傳遞進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)并能有效表達(dá)[2]。為此，已經(jīng)開發(fā)了若干基因傳遞技術(shù)，如通過細(xì)胞電穿孔技術(shù)，顯微注射技術(shù)，利用病毒或合成載體的基因轉(zhuǎn)運(yùn)技術(shù)等。雖然非病毒載體在體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)運(yùn)效率較病毒類載體較低，但非病毒載體具有如低安全性，低免疫原性，低特異性等缺點(diǎn)[3]。

由于多糖具有天然、無毒、生物相容性和可生物降解的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，并很易被修飾以改善其物理化學(xué)性質(zhì)，因此在眾多的非病毒載體中，多糖一直被認(rèn)為是最具發(fā)展?jié)摿Φ妮d體之一[4]。目前，此類載體主要以陽離子型多糖-殼聚糖為代表，研究結(jié)果表明殼聚糖或其衍生物具有較高的基因轉(zhuǎn)運(yùn)效率。此外，其他類型的中性多糖通過修飾連接帶電分子如PEI后也具有良好的基因轉(zhuǎn)運(yùn)功能。但現(xiàn)有多糖類載體除殼聚糖外都必須經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾連接其他陽離子結(jié)構(gòu)片段后，才具備促進(jìn)核酸凝聚并將其轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)的功能。需要注意的是，多糖分子良好的生物兼容性也被引入的陽離子支鏈破壞導(dǎo)致安全性下降。因此研究更安全的多糖類載體意義重大。

多糖鐵具備化合物促進(jìn)DNA凝聚的所需必要條件-正電性，由于多糖鐵與其他有機(jī)陽離子修飾的多糖載體相比，分子中只引入了細(xì)胞毒性極低的Fe3+，未引入其他高細(xì)胞毒性的分子片段，且多糖鐵配合物具有更簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)，更好地保證了天然多糖分子的自身結(jié)構(gòu)，最大程度保持了多糖分子良好的生物兼容性，這一特性充分保證了多糖鐵作為DNA釋放載體的安全性[7-8]。本研究利用米糠多糖與三氯化鐵在堿性條件下絡(luò)合形成米糠多糖鐵配合物（Rice Bran Polysaccharide-Fe（Ⅲ）Complex，RBPIC），對(duì)其理化性質(zhì)及其與DNA的相互作用進(jìn)行研究，為將多糖鐵類化合物開發(fā)為基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體做探索。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：Lambda 25型紫外分光光度計(jì)（美國(guó)PerkinElmer公司）；STARTER 3100型pH計(jì)（美國(guó)A-haus）；DK-II型萬用電爐（天津泰斯特儀器有限公司）；HH-S1數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇醫(yī)療儀器廠）；TGL-16c型離心機(jī)（上海安亭儀器廠）；FA2004電子天平；干燥箱。

試劑：米糠多糖為本實(shí)驗(yàn)自制并純化；三氯化鐵、氫氧化鈉、檸檬酸三鈉、無水乙醇、抗壞血酸、鄰菲啰啉、硫酸亞鐵胺、硫氰酸鉀、亞鐵氰化鉀等試劑均為分析純；小牛胸腺 DNA；Tris-HCl緩沖液（pH7.4）。

鐵（II）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取0.702 3 g硫酸亞鐵銨[Fe（NH4）2（SO2）2·6H2O]溶于蒸餾水并轉(zhuǎn)入1 000 mL容量瓶中，加3 mL鹽酸，用蒸餾水定容；鐵（Ⅱ）標(biāo)準(zhǔn)液（現(xiàn)配）：吸取10.00 mL鐵（Ⅱ）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容；0.1%鄰菲啰啉顯色液：稱取鄰菲啰啉1.0 g溶解于加有2 mL鹽酸的蒸餾水中，轉(zhuǎn)入1 000 mL容量瓶中，用蒸餾水定容；10%抗壞血酸：稱取抗壞血酸50.0 g，溶于適量蒸餾水，轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容。

1.2 方法

1.2.1 米糠多糖鐵的制備

參照文獻(xiàn)，稱取米糠多糖1.0 g，檸檬酸三鈉0.5 g，溶于40 mL水中，置80℃水浴中攪拌。在攪拌下滴加2 mol/L的FeCl3溶液和20%NaOH溶液，控制兩者的滴加速度以調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH8～9。當(dāng)反應(yīng)液中產(chǎn)生的紅棕色沉淀不再溶解時(shí)，停止滴加FeCl3溶液和NaOH溶液，繼續(xù)在水浴中反應(yīng)1.5 h。反應(yīng)冷卻后，8 000 r/min離心10 min，收集上層紅棕色離心液。離心液中加入約1倍體積的無水乙醇醇沉，靜置過夜，傾去上清液，沉淀繼續(xù)用適量無水乙醇洗滌3次，8 000 r/min離心5 min，將沉淀干燥，即為產(chǎn)品，保存?zhèn)溆肹9]。

1.2.2 米糠多糖鐵的理化性質(zhì)

米糠多糖鐵與氫氧化鐵的定性比較。取干燥的RBPIC粉末0.05 g，溶于適量蒸餾水中，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中定容至刻度，制得RBPIC溶液。在50 mL沸水中滴加飽和FeCl3溶液知道溶液變成紅褐色，得氫氧化鐵溶膠。分別取RBPIC溶液和氫氧化鐵溶膠2 mL，對(duì)二者進(jìn)行定性比較。①觀察二者顏色。②加入乙醇或乙醚觀察現(xiàn)象。③加入氫氧化鈉溶液，觀察溶液變化。④加入硫氰酸鉀，觀察溶液變化。⑤加入亞鐵氰化鉀，觀察溶液變化。

米糠多糖鐵的破壞試驗(yàn)。取RBPIC溶液約3 mL于錐形瓶中，加入蒸餾水30 mL、鹽酸2 mL，加熱煮沸3 min，定性檢驗(yàn)。

米糠多糖鐵的水解試驗(yàn)。配置3.2 mg/mL的RBPIC溶液，用 0.01 mol/L 的鹽酸調(diào)節(jié) pH，用 K4[Fe（CN）6]檢驗(yàn)其水溶液，并用酸度計(jì)測(cè)定溶液pH；用0.01 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH，觀察溶液是否產(chǎn)生沉淀，并用酸度計(jì)測(cè)定溶液pH。

米糠多糖鐵的還原試驗(yàn)。取RBPIC溶液1.0mL，置于50mL容量瓶?jī)?nèi)，加入10%抗壞血酸溶液2.5mL，0.1%的鄰菲啰啉溶液5.0 mL，定容，37℃下反應(yīng)，以不加RBPIC的溶液為空白樣，每隔0.5小時(shí)在510 nm處測(cè)定一次吸光度，直到吸光度值基本不變。

1.2.3 米糠多糖鐵的鐵含量測(cè)定

采用鄰菲啰啉比色法，原理是抗壞血酸在酸性條件下把Fe3+還原成Fe2+，F(xiàn)e2+與鄰菲啰啉結(jié)合生成橙紅色的螯合物，由紫外分光光度計(jì)測(cè)得其吸光度值，計(jì)算鐵的含量。

1.2.3.1 繪制鐵的標(biāo)準(zhǔn)曲線

取8個(gè)25 mL的容量瓶，分別加入鐵的標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1、2、3、4、5、6、7 mL，再分別加入 10%的抗壞血酸1.75 mL、0.1%的鄰菲啰啉2.5 mL，蒸餾水定容搖勻，放置10 min，在510 nm處測(cè)定吸光度，以鐵的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制鐵的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2 米糠多糖鐵含量的測(cè)定

取RBPIC溶液1.0 mL，置于50 mL容量瓶?jī)?nèi)，加入10%抗壞血酸溶液2.5 mL，0.1%的鄰菲啰啉溶液5.0 mL，用蒸餾水定容，搖勻，在37℃下反應(yīng)若干時(shí)間，測(cè)定吸光度值，計(jì)算鐵的含量。

1.2.4 米糠多糖鐵的結(jié)構(gòu)表征

紫外光譜測(cè)定：蒸餾水做對(duì)照，在200 nm～400 nm范圍內(nèi)掃描其紫外吸收光譜。

紅外光譜測(cè)定：KBr壓片，在400 cm-1～4 000 cm-1范圍內(nèi)掃描其紅外光譜。

1.2.5 米糠多糖鐵與DNA的相互作用

在一批比色管中準(zhǔn)確加入500 μL pH7.4的Tris-HCl緩沖溶液，50 μL DNA 溶液，2 050 μL 蒸餾水，不同量RBPIC溶液，混合均勻，放置0.5 h，以相應(yīng)濃度未加DNA的RBPIC溶液作參比，在200 nm～400 nm掃描吸收光譜。

1.2.6 米糠多糖鐵促進(jìn)DNA凝聚

在總體水平上,物質(zhì)追求維度得分最高，這可能和學(xué)生的生源地來源及其家庭經(jīng)濟(jì)水平低有緊密的聯(lián)系。黃星、劉霞等人的研究也證實(shí)了這一點(diǎn) [5,6]。

20 mmol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液（最適反應(yīng)體系 pH）中加入 75 μmol/L pBR322 DNA（堿基對(duì)濃度），然后分別加入一定濃度梯度的RBPIC，反應(yīng)體系的總體積為10 μL，37℃反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，向體系中加入 2 μL 6×DNA loading buffer（溴酚藍(lán)），混勻后上樣于1%瓊脂糖凝膠中，室溫下，在1×的TAE電泳緩沖液中以80 V的電壓電泳65 min。電泳結(jié)束后，將凝膠在1.0 μg/mL的溴化乙錠（EtBr）染色液中浸泡30 min進(jìn)行染色，最后在Bio-Rad凝膠成像儀上觀察并成像分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 米糠多糖鐵的理化性質(zhì)

2.1.1 米糠多糖鐵的物理性質(zhì)

米糠多糖鐵的產(chǎn)量為1.177 g。米糠多糖鐵為棕色無定形粉末，無臭無味，易溶于水，其水溶液呈弱堿性，不溶于乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑。用亞鐵氰化鉀檢驗(yàn)其水溶液，不顯示Fe3+的特殊效應(yīng)，證明其水溶液中無游離的三價(jià)鐵離子（Fe3+），鐵與米糠多糖絡(luò)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物。米糠多糖鐵粉末在空氣中放置24 h后性狀未發(fā)生改變，其水溶液在空氣中敞口放置24 h，未發(fā)生聚沉，且保持均一透明，進(jìn)一步說明米糠多糖鐵及其溶液的穩(wěn)定性。

2.1.2 米糠多糖鐵與氫氧化鐵的定性比較

米糠多糖鐵與氫氧化鐵的定性比較見表1。

表1 米糠多糖鐵與氫氧化鐵的定性比較Table 1 Qualitative comparison of RBPIC and iron hydroxide

RBPIC溶液與氫氧化鐵溶膠性質(zhì)比較的結(jié)果表明，兩者在理化性質(zhì)方面有顯著區(qū)別；同時(shí)還說明，RBPIC中的三價(jià)鐵并未以游離的形式存在，而是與米糠多糖配合生成了穩(wěn)定的復(fù)合物。

2.1.3 米糠多糖鐵的破壞試驗(yàn)

2.1.4 米糠多糖鐵的水解試驗(yàn)

滴加HCl溶液調(diào)節(jié)RBPIC溶液pH到4.1時(shí)，用K4[Fe（CN）6]檢驗(yàn)其水溶液不顯示 Fe3+特殊效應(yīng)。Fe3+和Fe2+在pH 6～7的水溶液中均會(huì)生成氫氧化物沉淀，用NaOH溶液調(diào)節(jié)RBPIC溶液pH值到12.6時(shí)，仍無渾濁現(xiàn)象。說明米糠多糖鐵在pH4.1～12.6穩(wěn)定，復(fù)合物中的三價(jià)鐵不會(huì)被水解成游離的Fe3+。

2.1.5 米糠多糖鐵的還原性試驗(yàn)

吸光度與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系見表2。

表2 吸光度與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系Table 2 Relationship between absorbance and reaction time

由表2可知，RBPIC中的鐵在3.5 h內(nèi)基本被抗壞血酸還原。

2.2 米糠多糖鐵的鐵含量測(cè)定

鐵的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制數(shù)據(jù)見表3，曲線見圖1。

表3 鐵離子標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)Table 3 Data of iron solution standard curve

圖1 鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of iron standard solution

37℃下米糠多糖鐵與抗壞血酸反應(yīng)3.5 h，在紫外可見吸收光譜儀上測(cè)得樣品在510 nm處的吸光度為0.734 8，將此結(jié)果代入回歸方程計(jì)算得鐵含量為18.41%。

2.3 米糠多糖鐵的結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 米糠多糖鐵的紫外光譜分析

紫外圖譜如圖2。

圖2 紫外光譜分析Fig.2 Ultraviolet spectrum of RBPIC solution

由圖2米糠多糖與米糠多糖鐵的紫外掃描曲線對(duì)比可以看出，米糠多糖鐵在紫外區(qū)的吸收強(qiáng)度明顯增加，說明米糠多糖與鐵反應(yīng)生成了復(fù)合物。米糠多糖鐵中的生色基有羰基、羧基、酯基，助色基是-OH，在米糠多糖與鐵發(fā)生反應(yīng)后紫外吸收變強(qiáng)推測(cè)助色基發(fā)生了改變，從而使得紫外吸收強(qiáng)度發(fā)生了變化，說明助色基-OH發(fā)生了絡(luò)合反應(yīng)。

2.3.2 米糠多糖鐵的紅外光譜分析

米糠多糖鐵的紅外光譜分析見圖3。

圖3紅外光譜圖顯示，米糠多糖鐵特征吸收與文獻(xiàn)報(bào)道的β-FeOOH的特征吸收一致，表明米糠多糖鐵中的鐵核是聚合的β-FeOOH結(jié)構(gòu)。在3 500 cm-1～3 400 cm-1附近有一強(qiáng)吸收峰，這是由于米糠多糖分子中有多個(gè)-OH，且分子中有較強(qiáng)的氫鍵作用，它們屬于米糠多糖中羥基伸縮振動(dòng)的吸收峰，此外，由米糠多糖與米糠多糖鐵的紅外光譜對(duì)照可見，金屬離子的絡(luò)合沒有使米糠多糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

圖3 紅外光譜分析Fig.3 IR spectrum of RBPIC

2.4 米糠多糖鐵與DNA的相互作用

米糠多糖鐵與DNA作用的紫外吸收光譜圖見圖4。

圖4 米糠多糖鐵與DNA作用的紫外吸收光譜圖Fig.4 UV-Vis absorption spectrum of rice bran polysaccharide iron and DNA

從圖4中看出，隨著米糠多糖鐵濃度的增加，DNA 260 nm處的特征吸收峰無明顯位移，但有明顯的減色效應(yīng)，表明復(fù)合物可能以嵌插方式與DNA結(jié)合。減色效應(yīng)可認(rèn)為是米糠多糖鐵的π*共軛體系與DNA堿基的大π共軛體系之間發(fā)生強(qiáng)烈作用，產(chǎn)生π電子堆積，使復(fù)合物π*空軌道與堿基的π電子軌道發(fā)生偶合，偶合后的復(fù)合物π*軌道因部分填充電子使π-π*躍遷幾率減小，從而產(chǎn)生減色效應(yīng)。減色效應(yīng)的強(qiáng)弱與分子的嵌插作用能力有關(guān)，減色效應(yīng)越明顯，插嵌作用能力越強(qiáng)[1]?？梢愿鶕?jù)雙倒數(shù)公式求得米糠多糖鐵與DNA相互作用的結(jié)合常數(shù)K。小分子化合物與DNA相互作用的結(jié)合常數(shù)與其紫外吸光度值有以下關(guān)系[2]：

1/（A0-A）＝1/A0+1/（K×A0×CRBPIC）

式中：A0和A分別為加入米糠多糖鐵前后的吸光度；K為結(jié)合常數(shù)；CRBPIC為米糠多糖鐵的濃度。以1/（A0-A）對(duì)1/CRBPIC作雙倒數(shù)圖（如圖5），得到直線的斜率與截距之比即為K。計(jì)算得結(jié)合常數(shù)K為7.27×106L/mol，說明米糠多糖鐵與DNA的作用較強(qiáng)。

圖5 RBPIC-DNA體系雙倒數(shù)圖Fig.5 The double reciprocal diagram of RBPIC-DNA system

2.5 瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)

我們利用瓊脂糖分子塞阻滯作用來觀察BRPIC誘導(dǎo)DNA凝聚，并分析了BRPIC濃度對(duì)DNA的凝聚程度影響。當(dāng)DNA分子被BRPIC誘導(dǎo)凝聚后在瓊脂糖凝聚中會(huì)受到更大的阻滯作用，其遷移率顯著降低，形成凝聚體的DNA分子都聚集于加樣孔中而未發(fā)生遷移，試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

圖6 BRPIC/DNA比對(duì)DNA凝聚的影響Fig.6 The effect of Ratio of RBPIC and DNA on DNA condensation

由圖6可知，BRPIC與DNA濃度比為0.5時(shí)只有部分DNA被凝聚，而B當(dāng)BRPIC/DNA大于0.5時(shí)，化合物均能促進(jìn)DNA凝聚。

3 結(jié)論

通過三氯化鐵與米糠多糖在堿性條件下反應(yīng)合成了米糠多糖鐵復(fù)合物，對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行了研究，并對(duì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，確定復(fù)合物中的鐵（III）不是以游離的形式存在，而是與米糠多糖形成了穩(wěn)定的配合物，其在生理?xiàng)l件下不被水解，可作為新型的口服補(bǔ)鐵劑。運(yùn)用紫外吸收光譜的方法研究了復(fù)合物與DNA的作用機(jī)理，試驗(yàn)結(jié)果表明米糠多糖鐵與DNA以嵌插模式結(jié)合，計(jì)算得結(jié)合常數(shù)為7.27×106L/mol。瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)表明米糠多糖鐵在BRPIC/DNA值大于等于1.0時(shí)，可以有效促進(jìn)DNA凝聚，具有作為DNA釋放載體的可能。

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The Interaction of Rice Bran Polysaccharide Iron Complex and ctDNA

LIU Liang1，2，YU Xi-qian1，CHEN Bin1，HU Xiao-zhen1，CHEN Xin1，2
（1.School of Biological and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，Hubei，China；2.Hubei Collaborative Innovation Center for Processing of Agricultural Products，Wuhan 430023，Hubei，China）

Rice bran polysaccharide iron complex （RBPIC）was prepared with rice bran polysaccharides and ferric iron at alkaline conditions.RBPIC was stable at pH 4.1-12.6 and the iron content in RBPIC was 18.41%.The interaction between ctDNA and RBPIC was studied by UV-vis absorption spectra.The results showed that the interaction between ctDNA and RBPIC was obvious，and the binding constant was 7.27×106L/mol.

rice bran；polysaccharide iron complex（PIC）；ctDNA；UV-vis spectrum

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.14.038

湖北省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目（B2016077）；武漢輕工大學(xué)大學(xué)生科研項(xiàng)目（xsky2015008）；武漢輕工大學(xué)2015校立科研項(xiàng)目（2015d5）

劉梁（1981—），男（漢），講師，博士，研究方向：食品功能因子研究。

2015-07-01