黃雅娟，杜　峰，魏玲麗

(江西省婦幼保健院乳腺科　330006)

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miR-335通過靶向生存素對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的調(diào)控作用

黃雅娟，杜峰，魏玲麗

(江西省婦幼保健院乳腺科330006)

目的探討miR-335通過靶向生存素對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的調(diào)控作用。方法(1)選取乳腺癌組織及癌旁正常組織，分別采用RT-PCR、Western blot檢測(cè)組織中miR-335及生存素蛋白表達(dá)。(2)選取乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，分別轉(zhuǎn)染miR-335 mimic及mimic對(duì)照組，采用RT-PCR、Western blot檢測(cè)組織中miR-335及生存素蛋白表達(dá)。(3)選取乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，分別將野生型survivin 3′-UTR質(zhì)粒(survivin-wt)和突變型survivin 3′-UTR質(zhì)粒(survivin-Mut)與miR-335 mimic或模擬物陰性對(duì)照(NC)共轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性。(4)選取乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，分別轉(zhuǎn)染mimic對(duì)照組、miR-335 mimic及miR-335 mimic+survivin，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性。結(jié)果(1)與癌旁組織相比較，乳腺癌組織中miR-335表達(dá)顯著降低(P<0.05)，同時(shí)生存素蛋白表達(dá)顯著增高(P<0.05)。(2)與轉(zhuǎn)染mimic對(duì)照組相比較，轉(zhuǎn)染miR-335 mimic可使乳腺癌細(xì)胞MCF-7中miR-335表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，同時(shí)生存素蛋白表達(dá)表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。(3)與轉(zhuǎn)染NC相比較，共轉(zhuǎn)染miR-335 mimic與survivin-wt可使MCF-7熒光素酶活性降低(P<0.05)，而共轉(zhuǎn)染miR-335 mimic與survivin-Mut則MCF-7熒光素酶活性無顯著性變化(P>0.05)。(4)轉(zhuǎn)染miR-335mimic后，MCF-7增殖活性較轉(zhuǎn)染mimic對(duì)照組顯著降低(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染miR-335 mimic+survivin后，MCF-7增殖活性較單純轉(zhuǎn)染miR-335 mimic顯著提高(P<0.05)，但仍顯著低于轉(zhuǎn)染mimic對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論在乳腺癌組織中miR-335呈現(xiàn)低表達(dá)，生存素呈現(xiàn)高表達(dá)；而miR-335可通過靶向生存素抑制乳腺癌細(xì)胞系MCF-7增殖。

微RNAs;乳腺腫瘤；細(xì)胞增殖；miR-335；生存素

近年來，我國乳腺癌發(fā)病率逐年上升，并有年輕化發(fā)展趨勢(shì)[1]。乳腺癌根治術(shù)是治療早期乳腺癌的可靠手段，但由于起病隱匿，大多數(shù)患者臨床確診時(shí)已為晚期，從而錯(cuò)失實(shí)施根治手術(shù)的最佳時(shí)機(jī)。包括放療、化療及內(nèi)分泌治療在內(nèi)的輔助治療手段雖已廣泛應(yīng)用于乳腺癌臨床治療，但其所致的毒副反應(yīng)及耐藥性也不容忽視[2]。因此，尋求更安全、高效的乳腺癌治療方法是臨床亟待解決的重點(diǎn)及難點(diǎn)問題。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，其可通過調(diào)控一個(gè)或多個(gè)靶基因翻譯，參與惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[3]。miR-335定位于人類7q32.2[4]。研究證實(shí)，乳腺癌細(xì)胞系BT474、T47D、MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231中miR-335表達(dá)均顯著低于正常乳腺細(xì)胞系MCF-10A(P<0.05)，而過表達(dá)miR-335則可對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性產(chǎn)生影響，提示miR-335可能參與乳腺癌的進(jìn)展過程[5]。但miR-335對(duì)其下游靶基因的調(diào)控作用及機(jī)制尚未明確。Yang等[6]研究發(fā)現(xiàn)，miR-335可通過靶向生存素(survivin)實(shí)現(xiàn)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力的抑制。而miR-335靶向生存素對(duì)乳腺癌的影響尚未可知。針對(duì)上述問題，本研究擬選取乳腺癌組織樣本及乳腺癌細(xì)胞系MCF-7為研究對(duì)象，觀察miR-335靶向生存素對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7增殖的調(diào)控作用，旨在為乳腺癌細(xì)胞的分子靶向治療提供理論依據(jù)。

1　資料與方法

1.1一般資料2015年7～12月30例女性乳腺癌組織及癌旁正常組織，由江西省婦幼保健院提供，均為手術(shù)切除的新鮮樣本，術(shù)前告知患者并簽訂知情同意書，研究經(jīng)江西省婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。30例患者中，年齡27～65歲，平均(52.4±6.5)；WHO分級(jí)：1+2級(jí) 4例，3級(jí) 26例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期9例，Ⅲ期21例。Her-2陰性24例，陽性6例；ER陰性11例，陽性19例；PR陰性14例，陽性16例；復(fù)發(fā)21例，未復(fù)發(fā)9例。

1.2材料乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，購于美國ATCC細(xì)胞庫；RNA提取試劑盒、PCR試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、miR-335模擬物(miR-335 mimic)、模擬物陰性對(duì)照(NC)、survivin 3′-UTR質(zhì)粒，購于美國Invitrogen公司；Dual luciferase assays，購于美國Promega公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、鏈霉素、青霉素，購于美國Sigma公司；一抗survivin、β-actin，購于大連Santa Cruz公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，購于碧云天生物試劑有限公司；miR-335、U6引物，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)復(fù)蘇乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，用含有10%胎牛血清和1%雙抗(青鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)液重懸浮細(xì)胞，并置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液1次，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA及總蛋白待進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，用含有10%胎牛血清和1%雙抗(青鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)節(jié)至2×105cell/well，后接種于6孔板中，共9孔，將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；將上述9孔細(xì)胞隨機(jī)分為3組，每組3孔，即mimic對(duì)照組、miR-335 mimic 組及miR-335 mimic+survivin組，根據(jù)上述分組不同，利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染miR-335mimic(50 nmol/L)、相應(yīng)的mimic對(duì)照組(50 nmol/L)及survivin表達(dá)質(zhì)粒(50 nmol/L)；轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h；收集細(xì)胞總RNA及總蛋白待進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)分別構(gòu)建含有野生型survivin 3′-UTR序列的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(survivin-wt)和含有突變型survivin 3′-UTR序列的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(survivin-Mut)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，用含有10%胎牛血清和1%雙抗(青鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)節(jié)至2×105cell/well，后接種于24孔板中，將survivin-wt質(zhì)粒與miR-335 mimic或NC共轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，將survivin-Mut質(zhì)粒與miR-335 mimic或NC共轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，將細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h；采用雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性，以海腎質(zhì)粒熒光值作為內(nèi)參。

1.3.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，按方法1.3.2對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組并轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染結(jié)束后每孔加入MTT(5 mg/mL)20μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)4 h；利用MTT法檢測(cè)HSC增殖活性，即培養(yǎng)結(jié)束后，800 r/min離心10 min，棄上清液，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱4 h進(jìn)行顯色實(shí)驗(yàn)，后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入100 μL DMSO終止顯色，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶液，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)測(cè)A490nm吸光值。

1.3.5Real-time PCR檢測(cè)miR-335表達(dá)采集經(jīng)處理后的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、乳腺癌組織標(biāo)本及癌旁組織樣本，參照Trizol試劑盒說明書提取細(xì)胞或組織中的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄總RNA至cDNA，取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入SYBR Green法行RT-PCR。miR-335以U6為內(nèi)參，miR-335相對(duì)表達(dá)量為miR-335與U6拷貝數(shù)比值。miR-335序列 (5′-3′)：上游5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC G-3′；下游5′-AGG TAT TCG CAC TGG ATA CGA CA-3′。U6序列 (5′-3′)：上游5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′；下游5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。

1.3.6Western blot法檢測(cè)survivin蛋白表達(dá)采集經(jīng)處理后的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、乳腺癌組織標(biāo)本及癌旁組織樣本，常規(guī)提取蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)樣品蛋白濃度，取適量樣品行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，5%封閉液4 ℃封閉4 h，后依次加入一抗(1∶2 000)、二抗(1∶500)孵育，按ECL試劑盒說明書行電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

2　結(jié)　果

2.1乳腺癌組織、癌旁正常組織中miR-335、survivin表達(dá)及相關(guān)性RT-PCR結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比較，乳腺癌組織中miR-335表達(dá)顯著降低(P<0.05)，見圖1。 Western blot結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比較，乳腺癌組織中survivin蛋白表達(dá)顯著增高(P<0.05)，見圖2。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，乳腺癌組織中miR-335與survivin蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.327，P=0.014)。

2.2轉(zhuǎn)染miR-335 mimic對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7中miR-335、survivin表達(dá)的影響RT-PCR結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染mimic對(duì)照組相比較，轉(zhuǎn)染miR-335 mimic可使乳腺癌細(xì)胞MCF-7中miR-335表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖3。Western blot結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染mimic對(duì)照組相比較，轉(zhuǎn)染miR-335 mimic可使乳腺癌細(xì)胞MCF-7中survivin表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖4。

a：P<0.05，與癌旁組織相比較。

圖1乳腺癌組織及癌旁正常組織中miR-335表達(dá)

1～5：乳腺癌組織；6～10：癌旁正常組織；A：Western bllot蛋白條帶；B：蛋白定量分析結(jié)果；a：P<0.05，與癌旁組織相比較。

圖2乳腺癌組織及癌旁組織中survivin蛋白表達(dá)

a：P<0.05，與mimic對(duì)照組相比較。

圖3轉(zhuǎn)染miR-335 mimic對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7中miR-335表達(dá)的影響

2.3miR-335對(duì)survivin 3′-UTR的靶向作用雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-335 mimic與survivin 3′-UTR野生質(zhì)粒后，乳腺癌細(xì)胞MCF-7熒光素酶活性較NC組顯著降低(P<0.05)；共轉(zhuǎn)染miR-335 mimic與survivin 3′-UTR突變質(zhì)粒后，乳腺癌細(xì)胞MCF-7熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖5。

2.4轉(zhuǎn)染miR-335 mimic、survivin乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖活性的影響MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-335mimic 24 h、48 h及72 h后，乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖活性較轉(zhuǎn)染mimic對(duì)照組顯著降低(P<0.05)；而共轉(zhuǎn)染miR-335 mimic、survivin后，乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖活性較單純轉(zhuǎn)染miR-335 mimic顯著提高(P<0.05)，但仍顯著低于轉(zhuǎn)染mimic對(duì)照組(P<0.05)，見圖6。

1～5：轉(zhuǎn)染miR-335 mimic；6～10：轉(zhuǎn)染mimic對(duì)照組；A：Western blot 蛋白條帶；B：蛋白定量分析結(jié)果；a：P<0.05，與mimic對(duì)照組相比較。

圖4轉(zhuǎn)染miR-335 mimic對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7中survivin蛋白表達(dá)的影響

a：P<0.05，與NC組相比較。

圖5雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞MCF-7中miR-335

a:P<0.05，與mimic對(duì)照組相比較；b：P<0.05，與miR-335 mimic組相比較。

圖6轉(zhuǎn)染miR-335 mimic、survivin對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖活性的影響

3　討　論

既往研究表明，miRNA參與了眾多病理生理過程，尤其是通過發(fā)揮類似抑癌或促癌基因的作用，參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[7]。miR-335已被證實(shí)在多種惡性腫瘤中差異表達(dá)。但不同惡性腫瘤中miR-335表達(dá)趨勢(shì)并不相同。王鶴等[8]研究證實(shí)，miR-335在非小細(xì)胞肺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，而抑制miR-335表達(dá)可起到抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞SPCA-1遷移、侵襲及增殖能力的作用，提示miR-335在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)揮類似促癌基因功能。而王勇等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miR-335在骨肉瘤組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，并可通過靶向rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶1(ROCK1)發(fā)揮類似抑癌基因功能。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌中miR-335表達(dá)顯著低于癌旁組織(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染miR-335 mimic可使乳腺癌細(xì)胞MCF-7中miR-335表達(dá)上調(diào)，并對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖活性起到一定程度的抑制作用，提示miR-335在乳腺癌的進(jìn)展過程中發(fā)揮著類似抑癌基因的功能[10]。

生存素屬于凋亡抑制蛋白家族成員，是目前已知的活性最強(qiáng)的抗凋亡因子，其在惡性腫瘤的增殖、凋亡過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。生存素高表達(dá)在食管癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤組織中已得到證實(shí)[11-12]。生物信息學(xué)基因組預(yù)測(cè)提示：生存素可能是miRNA-335的靶向基因之一。但miRNA-335是否可通過靶向生存素參與乳腺癌細(xì)胞增殖及凋亡過程尚未可知。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中生存素蛋白表達(dá)顯著高于癌旁組織(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染miR-335 mimic可使MCF-7中生存素蛋白表達(dá)得到顯著抑制，提示乳腺癌中miR-335表達(dá)與生存素蛋白表達(dá)存在一定相關(guān)性，而這種相關(guān)性很可能是由miR-335負(fù)向調(diào)控生存素所致[13]。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-335 mimic與survivin-WT可使乳腺癌細(xì)胞熒光酶活性降低，而共轉(zhuǎn)染miR-335 mimic與survivin-Mut則對(duì)乳腺癌細(xì)胞熒光酶活性無影響，提示miR-335可特異性與survivin 3′-UTR結(jié)合，進(jìn)而為miR-335靶向生存素提供有力佐證。MTT法檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，單純轉(zhuǎn)染miR-335可顯著抑制MCF-7增殖，而共轉(zhuǎn)染miR-335及生存素可實(shí)現(xiàn)miR-335對(duì)MCF-7增殖抑制作用的部分逆轉(zhuǎn)，提示miR-335靶向生存素是調(diào)控MCF-7增殖活性的重要機(jī)制。但值得注意的是，轉(zhuǎn)染生存素并無法完全逆轉(zhuǎn)miR-335對(duì)MCF-7增殖的抑制，分析其原因可能與miR-335靶基因眾多有關(guān)。目前已知的miR-335靶基因包括Sp1、ROCK1、HER3等，而miR-335靶向生存素可能僅是miR-335調(diào)控乳腺癌增殖的其中一個(gè)機(jī)制[14-15]。

綜上所述，miR-335可通過靶向生存素參與乳腺癌細(xì)胞增殖過程；此外，miR-335還可能通過靶向其他下游基因參與乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展。

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miR-335 regulate cell proliferation by targeting survivin in breast cancer cells MCF-7

Huang Yajuan,Du Feng,Wei Lingli

(DepartmentofGalactophore,JiangxiProvincialMaternalandChildHealthCareHospital,Nanchang,Jiangxi330006,China)

ObjectiveTo evaluate the effect of miR-335 regulate cell proliferation by targeting survivin in breast cancer cells MCF-7.Methods(1)Chose breast cancer tissue and para-carcinoma tissue,and used RT-PCR or Western blot to detect the expression of miR-335 and survivin protein.(2)Chose breast cancer cells MCF-7,respectively transfected miR-335 mimic and mimic control.The expression of miR-335 and survivin protein were detected by RT-PCR or Western blot.(3)Chose breast cancer cells MCF-7,respectively co-transfection wild type survivin 3′-UTR(survivin-wt)or mutant type urvivin 3′-UTR(survivin-Mut)and miR-335 mimic or negative control(NC)to breast cancer cells MCF-7.The cell luciferase activity were detected by dual-luciferase report gene experiment.(4)Chose breast cancer cells MCF-7,respectively transfected mimic control,miR-335 mimic and miR-335 mimic+survivin.The cell proliferation activity of each group were detected by MTT method.Results(1)Compared with para-carcinoma tissue,the miR-335 expression of breast cancer tissue significantly decreased(P<0.05),and the survivin protein expression of breast cancer tissue significantly increased(P<0.05).(2)Compared with transfection mimic control,transfection miR-335 mimic can made the miR-335 expression of MCF-7 increased(P<0.05),and made the survivin protein expression of MCF-7 decreased(P<0.05).(3)Compared with transfection NC,co-transfection miR-335 mimic and survivin-wt can made luciferase activity of MCF-7 significantly decreased(P<0.05),but the luciferase activity of MCF-7 was not significantly changes after co-transfection miR-335 mimic and survivin-Mut (P>0.05).(4)Compared with transfection mimic control,the MCF-7 proliferative activity significantly decreased after transfection miR-335mimic(P<0.05).Compared with transfection miR-335 mimic,the MCF-7 proliferative activity significantly increased after transfection miR-335 mimic+survivin(P<0.05),but still lower than transfection mimic control(P<0.05).ConclusionIn breast cancer tissue,the miR-335 show low expression,and survivin show high expression.miR-335 can target survivin to inhibit the proliferation activity of breast cancer cells MCF-7.

microRNAs;breast neoplasms;cell proliferation;miR-335;survivin

黃雅娟(1979-)，主治醫(yī)師，本科，主要從事乳腺癌的綜合治療的研究。

·論著·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.27.003

R737.9

A

1671-8348(2016)27-3753-04

2016-02-17

2016-04-06)