葉振源，涂云華，薛月萃，榮冬蕓，昝雪娟，潘軍玲，曹　煜

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚性病科　550004)

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論著·基礎(chǔ)研究

姜黃揮發(fā)油對黑色素瘤wm9細(xì)胞增殖與凋亡的影響*

葉振源，涂云華，薛月萃，榮冬蕓，昝雪娟，潘軍玲，曹煜

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚性病科550004)

目的研究姜黃揮發(fā)油對黑色素瘤wm9細(xì)胞增殖與凋亡的影響。方法應(yīng)用不同濃度的姜黃揮發(fā)油作用于黑色素瘤的wm9細(xì)胞。用細(xì)胞增殖計數(shù)試劑盒(CCK8)檢測增殖抑制率，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，ELISA法檢測Caspase-3酶活性，流式細(xì)胞檢測細(xì)胞周期和凋亡。結(jié)果姜黃揮發(fā)油在不同濃度下，對黑色素瘤wm9細(xì)胞作用表現(xiàn)不同，當(dāng)藥物濃度達(dá)到40 mg/L，倒置顯微鏡下可見到典型的凋亡細(xì)胞；Caspase-3酶活性隨著藥物濃度的遞增，呈現(xiàn)藥物濃度-酶活性正相關(guān)性；經(jīng)姜黃揮發(fā)油作用后的wm9細(xì)胞被阻滯在G2/M期。結(jié)論 姜黃揮發(fā)油誘導(dǎo)黑色素瘤wm9細(xì)胞凋亡的機(jī)制與細(xì)胞周期G2/M期阻滯、Caspase酶活化參與凋亡有關(guān)。

凋亡；增殖；姜黃揮發(fā)油；wm9細(xì)胞

黑色素瘤是來源于皮膚及其他器官黑素細(xì)胞產(chǎn)生的惡性腫瘤，近年來研究結(jié)果顯示中國發(fā)病率為0.53/10 0000，且隨年齡增加而增加[1]。本病惡性程度較高，轉(zhuǎn)移發(fā)生早，病死率高，因此及時治療很重要。目前治療方式包括手術(shù)治療和藥物治療。藥物方面化療藥物仍然是臨床一線治療的首選[2]，但其在殺死腫瘤細(xì)胞的同時，也對正常細(xì)胞造成了影響，從而導(dǎo)致了一系列不良反應(yīng)。姜黃是芭蕉目和姜科類植物，在臨床上有降血脂、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用[3-5]，且不良反應(yīng)少，有較大的臨床應(yīng)用價值，姜黃揮發(fā)油主要通過氣相色譜-質(zhì)譜從姜黃植物提取[6]。本實驗主要研究姜黃揮發(fā)油對黑色素瘤wm9細(xì)胞增殖、凋亡的影響，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1材料與試劑姜黃揮發(fā)油(貴陽舒美達(dá)藥廠有限公司，以100∶1比例與二甲基亞砜混合，使藥物充分溶解，稀釋至1 mg/mL，濾過除菌，置于4 ℃冰箱存放)，黑色素瘤wm9細(xì)胞(貴州中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室贈予)，胎牛血清(杭州四季青有限公司)，RPMI1640培養(yǎng)基(上海浩然生物技術(shù)有限公司)，CCK8(上海前塵生物科技有限公司)，倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS IX53-A12PH)，Caspase-3酶試劑盒(北京寶賽生物技術(shù)有限公司)，BD FACS Verse流式細(xì)胞儀(美國BD Biosciences公司)，ELX800酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Biotech公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)黑色素瘤wm9用RPMI1640培養(yǎng)基(含1%青霉素、1%鏈霉素雙抗、10%胎牛血清)，置于5%CO2恒溫37 ℃條件下，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天傳代1次，待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期。

1.2.2細(xì)胞增殖抑制率檢測在96孔板中加入100 μL的細(xì)胞懸液，并調(diào)整其細(xì)胞密度為2.0×105/mL將培養(yǎng)板置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,向培養(yǎng)板加入不同濃度的姜黃揮發(fā)油，參考涂云華濃度梯度方法[7]，最終使其濃度分別到5、10、20、40 mg/L，同時設(shè)置細(xì)胞對照組和空白對照組,且每孔設(shè)6個復(fù)孔，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育24、48、72 h，在培養(yǎng)結(jié)束時間前1.5 h向每孔加入10 μL CCK8溶液，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度值(A值)，細(xì)胞增殖抑制率(%)=(對照組-實驗組)/(對照組-空白對照組)×100%。

1.2.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整使其對數(shù)生長期細(xì)胞密度為1.5×105/mL，

表1　　姜黃揮發(fā)油作用WM9細(xì)胞增殖抑制率比較±s)

*：P<0.05，與對照組比較；-：此項無數(shù)據(jù)。

接種于6孔板，置于5%CO237 ℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12 h孵育過夜，分別加入終濃度為5、10、20、40 mg/L姜黃揮發(fā)油培養(yǎng)液，對照組則加入10%FBS RPMI1640培養(yǎng)基同步培養(yǎng)，置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.4Caspase-3酶活性檢測取處于對數(shù)生長期的黑色素瘤wm9細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，接種于6孔板，每孔1 mL，培養(yǎng)12 h，加入不同體積藥物，總體積為2 mL，使其終濃度為5、10、20、40 mg/L，同時設(shè)細(xì)胞對照組，培養(yǎng)48 h，胰酶消化，離心收集細(xì)胞，取50 μL裂解液加入，均勻吹打，置冰上裂解30 min，其間渦旋振蕩3～4次，每次10 s，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，小心吸取上清液，將上清液轉(zhuǎn)移到96孔板中，按照Caspase-3酶活性檢測試劑盒使用說明書操作方法，取細(xì)胞提取液5 μL，加入含熒光底物Ac-DEVD-AMC的Caspase-3反應(yīng)緩沖液每孔45 μL，37 ℃避光，孵育4 h，用酶標(biāo)儀在波長為460 nm測定A值。Caspase-3活化程度=實驗組A460/正常對照A460。

1.2.5細(xì)胞周期測定細(xì)胞培養(yǎng)方法同1.2.4，加入不同體積藥物，使其終濃度分別為5、10、20、40 mg/L，總體積2 mL，同時設(shè)細(xì)胞陰性對照組，并收集細(xì)胞，培養(yǎng)48 h，用PBS洗滌細(xì)胞1次(2 000 r/min離心5 min)，使其細(xì)胞濃度為1×106/mL，離心后去除上清液，加入70%乙醇500 μL固定2 h，4 ℃保存，染色前用PBS洗去固定液,加入100 μL RnaseA 37 ℃水浴30 min，再加入400 μL PI染色混勻，4 ℃避光30 min，上機(jī)檢測。

1.2.6細(xì)胞凋亡檢測細(xì)胞培養(yǎng)方法同1.2.4，加入姜黃揮發(fā)油，藥物濃度設(shè)置同1.2.4，總體積2 mL，設(shè)置細(xì)胞對照組，培養(yǎng)48 h，4 ℃離心5 min收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，4 ℃離心5 min，調(diào)整使其細(xì)胞濃度1×105/mL，加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞、5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI Staining Solution 輕輕混勻。避光、室溫10 min，加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻，用BD FACS Verse流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡。

2　結(jié)　　果

2.1細(xì)胞增殖抑制率檢測不同濃度姜黃揮發(fā)油作用黑色素瘤wm9細(xì)胞不同時間段后，均有抑制作用，且隨著藥物濃度的增高，抑制率呈增高趨勢，且其作用方式呈現(xiàn)時間-劑量相關(guān)性。作用48 h時，增殖抑制作用較為明顯，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察正常黑色素瘤wm9呈多種細(xì)胞形態(tài)，貼壁生長，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，深染，核仁小、核漿豐富，胞質(zhì)少。加入藥物后，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞增殖速度明顯變慢。當(dāng)藥物濃度濃度達(dá)到20 mg/L，細(xì)胞核固縮，部分腫瘤細(xì)胞膜開始破裂，可見部分細(xì)胞內(nèi)容物釋放，當(dāng)藥物濃度達(dá)到40 mg/L，已不能見到正常腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可見大量的細(xì)胞碎片。見圖1。

A:對照組；B：5 mg/L姜黃揮發(fā)油處理細(xì)胞；C:10 mg/L姜黃揮發(fā)油處理細(xì)胞；D：20 mg/L姜黃揮發(fā)油處理細(xì)胞；E：40 mg/L姜黃揮發(fā)油處理細(xì)胞。

圖1不同濃度姜黃揮發(fā)油對wm9細(xì)胞形態(tài)變化的影響(×200)

2.3Caspase-3酶活性檢測姜黃揮發(fā)油對黑色素瘤wm9具有促凋亡作用，且隨著藥物濃度的增加，呈藥物濃度-酶活性正相關(guān)，當(dāng)藥物濃度濃度達(dá)到40 mg/L，此時酶活性達(dá)到最大值。見表2。

表2　　不同濃度姜黃揮發(fā)油作用wm9細(xì)胞

*：P<0.05，與對照組比較；-：此項無數(shù)據(jù)。

2.4細(xì)胞凋亡檢測姜黃揮發(fā)油作用于細(xì)胞48 h后，黑色素瘤wm9細(xì)胞均有不同程度的凋亡，隨著藥物濃度的增加，凋亡率亦增加，呈現(xiàn)藥物濃度-凋亡率正相關(guān)性，早期凋亡率分別為(12.30±0.01)、(11.95±0.04)、(14.63±0.12)、(25.74±0.20)%，晚期凋亡率(10.18±0.02)、(13.74±0.13)、(35.68±0.21)、(58.14±0.13)%。早期凋亡率和晚期凋亡率在藥物濃度為40 mg/L達(dá)到最大值，且在同等藥物濃度下，晚期凋亡率較早期凋亡率更高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

A:自然凋亡；B～E：藥物濃度分別5、10、20、40 mg/L。

圖2不同濃度姜黃揮發(fā)油誘導(dǎo)wm9細(xì)胞凋亡

2.5細(xì)胞周期檢測細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)G1、S期細(xì)胞隨著藥物濃度的增高，細(xì)胞數(shù)目呈現(xiàn)遞減趨勢，呈現(xiàn)藥物-細(xì)胞數(shù)目負(fù)相關(guān)性。而G2期細(xì)胞隨著藥物濃度的增高，該期細(xì)胞數(shù)目呈現(xiàn)遞增趨勢。見圖3。

A:對照組；B～E：藥物濃度分別5、10、20、40 mg/L。

圖3不同濃度姜黃揮發(fā)油對細(xì)胞周期的影響

3　討　　論

姜黃為姜科植物姜黃的干燥根莖，作為一種中藥在現(xiàn)代研究廣泛，現(xiàn)在對其藥理作用已做了相關(guān)的研究，表明其在腫瘤、慢性肝病、腎病、糖尿病、皮膚病等疾病的治療上有一定的優(yōu)勢[8]。其中姜黃的主要成分姜黃素對于抗腫瘤已有相關(guān)研究，如乳腺癌、結(jié)腸癌[9-10]。姜黃的另一種成分姜黃揮發(fā)油在抗腫瘤方面的研究卻鮮有報道，相關(guān)文獻(xiàn)表明姜黃揮發(fā)油對抗急性單核細(xì)胞白血病THP-1細(xì)胞具有增殖抑制劑促凋亡作用[7]，然而對于其抗黑色素瘤細(xì)胞方面尚無研究。

本研究主要探討姜黃揮發(fā)油對于黑色素瘤wm9細(xì)胞的作用效果。實驗研究結(jié)果表明，姜黃揮發(fā)油對于黑色素瘤wm9細(xì)胞生長具有抑制作用，且隨著藥物濃度的遞增，其抑制作用越明顯，呈現(xiàn)時間-濃度相關(guān)性，當(dāng)藥物濃度為40 mg/L，其對細(xì)胞的抑制作用最明顯。Caspase是凋亡信號通路中重要的蛋白酶之一，也是與凋亡密切相關(guān)的調(diào)節(jié)基因，在細(xì)胞凋亡過程中與其他蛋白共同作用調(diào)控細(xì)胞的凋亡[11]，而Caspase-3能夠切割不同的底物，經(jīng)激活后能剪切細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白和抑制DNA修復(fù)作用，同時參與凋亡啟動和凋亡程序執(zhí)行，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，是其最重要的關(guān)鍵凋亡調(diào)節(jié)基因和終末執(zhí)行酶[12]。實驗結(jié)果顯示，隨著藥物濃度遞增，酶活性增加，表明藥物對其有促凋亡作用。流式細(xì)胞儀用于檢測細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期調(diào)控是一個精細(xì)的生物學(xué)過程，涉及了多個基因和蛋白的參與，進(jìn)而形成了復(fù)雜的信號分子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，而惡性腫瘤最基本的生物學(xué)特征是腫瘤細(xì)胞失控性增殖，而其生物學(xué)基礎(chǔ)是細(xì)胞周期調(diào)控紊亂[13]。本實驗結(jié)果表明，G1、S期細(xì)胞隨著藥物濃度增加，細(xì)胞數(shù)目遞減，而G2期細(xì)胞隨著藥物濃度的增高，細(xì)胞數(shù)目呈遞增趨勢，表明細(xì)胞被阻滯在G2/M期，從而干擾了正常細(xì)胞周期，阻斷了細(xì)胞正常有絲分裂，再次論證了姜黃揮發(fā)油對于黑色素瘤wm9的增殖抑制作用。

綜上所述，姜黃揮發(fā)油誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制與細(xì)胞周期G2/M期阻滯、Caspase酶活化參與凋亡有關(guān)，在此基礎(chǔ)上，作者還將進(jìn)一步探索姜黃揮發(fā)油誘導(dǎo)黑色素瘤wm9細(xì)胞凋亡的具體信號通路，為探索黑色素瘤的新型藥物提供理論依據(jù)。

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Effect of turmeric volatile oil on proliferation and apoptosis of melanoma wm9 cells*

YeZhenyuan，TuYunhua，XueYuecui,RongDongyun，ZanXuejuan，PanJunling，CaoYu

(DepartmentofDermatology，AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity，Guiyang,Guizhou550004China)

ObjectiveTo investigate the effect of turmeric volatile oil on the proliferation and apoptosis of melanoma wm9 cells.MethodsDifferent concentration of turmeric volatile oil were applied on melanoma wm9 cells;Detection of proliferation inhibition rate by cell counting kit-8(CCK8);Morphological changes of cells were observed by inverted microscope；Caspase-3 activities were evaluated by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)；Cell cycle and apoptosis was analyzed with flow cytometry(FCM).ResultsThe effects of turmeric volatile on melanoma wm9 cells were different in different concentrations，when the drug concentration reached at 40 mg/L，typical apoptotic cells can be seen under the inverted microscope，Caspase-3 activities were positively correlated with drug concentration.Cell cycle of Wm9 cells were blocked in G2/M phase after exposed to turmeric volatile oil.ConclusionTurmeric volatile oil has capability of apoptois-inducing in Wm9 cells.Moreover,turmeric volatile oil activated the key enzyme of apoptosis pathway and arrested cell cycle in G2/M phase,which maybe the mechanism of turmeric volatile oil to inhibit proliferation and differentiation of tumor cells.

apoptosis;proliferation;turmeric volatile oil;wm9 cells

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.25.005

貴州省中藥現(xiàn)代化專項項目(黔科合中藥字[2012]5018號)。

葉振源(1988-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事中草藥方面的研究。

R751

A

1671-8348(2016)25-3472-03

2016-03-11

2016-05-21)