劉俊平，劉仁貴，崔學(xué)斌，蘇　娟，秦　燕△

(1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)教研室，云南大理 671000；2.大理大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，云南大理 671000)

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論著·基礎(chǔ)研究

肝缺血再灌注誘導(dǎo)大鼠肝纖維化動物模型的建立*

劉俊平1，劉仁貴2，崔學(xué)斌2，蘇娟1，秦燕1△

(1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)教研室，云南大理 671000；2.大理大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，云南大理 671000)

目的建立肝缺血再灌注誘導(dǎo)大鼠肝纖維化動物模型。方法將16只SD雄性大鼠分為假手術(shù)組(Sham組)及肝纖維化模型組(HF組)，每組8只。HF組用無創(chuàng)動脈夾夾閉大鼠肝左葉和中葉的肝動脈、門靜脈，造成70%的肝臟缺血，夾閉90 min后，開夾，繼續(xù)飼養(yǎng)4周。Sham組僅行肝蒂部騷擾。4周后處死動物，檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、放射免疫法測定血清透明質(zhì)酸(HA)及層粘連蛋白(LN)水平；測定肝組織羥脯氨酸(Hyp)水平；Western blot檢測α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達(dá)量；蘇木素-伊紅(HE)染色觀察肝纖維化的程度。結(jié)果與Sham組比較，HF組血清ALT、AST、HA 及LN水平明顯升高(P<0.05)，肝組織Hyp水平升高(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，HF組α-SMA蛋白的表達(dá)量明顯高于Sham組(P<0.05)。光鏡下HF組肝細(xì)胞變性和壞死程度較Sham組明顯加重，炎性細(xì)胞浸潤明顯，部分有纖維隔的形成。結(jié)論肝缺血再灌注操作可以成功誘導(dǎo)大鼠肝纖維化動物模型。

肝硬化；模型，動物；肝缺血再灌注

肝纖維化是肝組織受損后的一種損傷修復(fù)反應(yīng),是慢性肝病發(fā)展為肝硬化必經(jīng)的病理過程。由肝纖維化導(dǎo)致的肝硬化在全球呈現(xiàn)高發(fā)病率和高病死率，嚴(yán)重威脅著公眾健康[1-3]。目前的研究證實肝纖維化是可以逆轉(zhuǎn)的，但一旦進(jìn)展至肝硬化則是不可逆性病變，因此延緩、阻斷乃至逆轉(zhuǎn)肝纖維化是目前治療各種慢性肝病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。肝纖維化動物模型是研究肝纖維化的前提之一，但現(xiàn)有的肝纖維化動物模型與人類諸多因素形成的肝纖維化有很大差別,迄今為止沒有一種肝纖維化動物模型與人類疾病完全相似[4-5]。因此，有必要進(jìn)一步探尋符合人類病因病理的肝纖維化動物模型。

肝缺血再灌注損傷(hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI)在肝移植、休克復(fù)蘇、嚴(yán)重肝外傷及肝葉切除等過程中均不可避免，是影響治療效果和預(yù)后的重要原因之一。多種細(xì)胞因子釋放、枯否細(xì)胞活化、氧化應(yīng)激與HIRI的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，而這些因素都可以激活肝星狀細(xì)胞(hepatic satellite cell，HSC)，從而啟動和促進(jìn)肝纖維化[6-8]。基于此，本研究利用肝缺血再灌注操作，誘導(dǎo)一種新型的大鼠肝纖維化動物模型。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物SD大鼠，雄性，SPF級，體質(zhì)量210～250 g，購自昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[SCXK(滇)2011-0004]。

1.1.2藥物與試劑血清透明質(zhì)酸(HA)試劑盒及層粘連蛋白(LN)試劑盒(北京北方生物技術(shù)有限公司)；考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒及羥脯氨酸(Hyp)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；小鼠抗大鼠α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(北京中杉生物技術(shù)有限公司);其他試劑均為分析純。

1.1.3主要儀器7060全自動生化分析儀(日本日立公司)；自動放射免疫計數(shù)機(jī)(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)中佳公司)；JY88-Ⅱ超聲細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝科器研究所)；T6紫外分光光度計(北京普析)；TGL-18R高速冷凍離心機(jī)(珠海黑馬)；免疫印跡電泳系統(tǒng)(北京六一儀器廠)。

1.2方法

1.2.1分組與模型制備16只SD雄性大鼠分為假手術(shù)組(Sham組)及肝纖維化模型組(HF組)，每組8只。HF組行腹部正中切口，游離肝蒂部的膽管、門靜脈及肝動脈，用無創(chuàng)動脈夾夾閉門靜脈及肝動脈分支，以阻斷入肝約70%的血流；夾閉90 min，繼續(xù)飼養(yǎng)4周。Sham組行肝蒂部騷擾，90 min后關(guān)腹。

1.2.2Western blot檢測肝組織α-SMA表達(dá)提取蛋白樣品，用考馬斯亮藍(lán)法檢測蛋白濃度，每泳道50 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，將聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)平衡后濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印3 h(冰浴)，之后5%脫脂奶粉封閉1 h，小鼠抗大鼠α-SMA單克隆抗體(抗體濃度1∶300) 4 ℃孵育過夜，3次漂洗后以HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(抗體濃度1∶500)室溫下震蕩孵育1 h,免疫印跡化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色,暗室曝光。

1.2.3肝組織蘇木素-伊紅(HE)染色固定好的肝組織標(biāo)本經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋組織制作切片(4 μm),行HE染色觀察肝組織病理學(xué)變化。

1.2.4指標(biāo)檢測全自動生化分析儀檢測肝功能指標(biāo)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)。放射免疫法測定血清HA及LN水平。制備10%的肝組織勻漿，嚴(yán)格按照試劑盒說明書提供的方法進(jìn)行操作，采用T6紫外分光光度計檢測Hyp。

2　結(jié)　　果

2.1大鼠肝功能指標(biāo)的變化與Sham組比較，HF組大鼠血清ALT、AST水平明顯升高(P<0.05)。見圖1。

*：P<0.05，與Sham組比較。

圖1大鼠血清ALT、AST水平的變化

2.2大鼠血清HA及LN水平的變化與Sham組比較，HF組大鼠血清HA及LN水平均明顯升高(P<0.05)。見圖2。

*：P<0.05，與Sham組比較。

圖2大鼠血清HA、LN水平的變化

2.3大鼠肝組織Hyp水平的變化與Sham組比較，HF組大鼠肝組織Hyp水平明顯升高(P<0.05)。見圖3。

*：P<0.05，與Sham組比較。

圖3大鼠肝組織Hyp的水平變化

2.4大鼠肝組織α-SMA蛋白表達(dá)水平Sham組肝組織α-SMA蛋白的表達(dá)量極低，而HF組α-SMA蛋白表達(dá)量明顯高于Sham組(P<0.05)。見圖4、5。

圖4　　Western blot檢測大鼠肝組織α-SMA蛋白表達(dá)

*：P<0.05，與Sham組比較。

圖5　　大鼠肝組織α-SMA蛋白表達(dá)相對灰度比值

2.5肝組織病理形態(tài)學(xué)變化Sham組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞索排列整齊，肝細(xì)胞大小均勻，無變性、壞死和纖維增生改變。HF組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝索排列紊亂，肝細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)透亮，氣球樣變性、壞死,部分有炎細(xì)胞浸潤，匯管區(qū)結(jié)締組織有不同程度增生。見圖6、表1。

圖6　　大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)變化

3　討　　論

肝纖維化是各種慢性肝病最重要的病理特征,是發(fā)生肝硬化的病理基礎(chǔ),也是原發(fā)性肝癌發(fā)病的危險因素之一。因此延緩、阻斷乃至逆轉(zhuǎn)肝纖維化是目前治療各種慢性肝病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。而建立肝纖維化動物模型是研究肝纖維化發(fā)生機(jī)制的一個重要基礎(chǔ)。目前,復(fù)制肝纖維化動物模型的方法主要有以下幾種:肝毒物誘導(dǎo)的肝纖維化、免疫性纖維化、乙醇誘導(dǎo)的纖維化及復(fù)合因素誘導(dǎo)的纖維化。但是沒有一種肝纖維化的動物模型與人類肝纖維化的發(fā)病特征完全一致,因此有必要進(jìn)一步探尋理想的肝纖維化動物模型，為肝纖維化的研究奠定基礎(chǔ)。

肝纖維化是多種因素、多種機(jī)制共同作用的結(jié)果，肝組織損傷引起炎癥相關(guān)因子、各種生長因子的釋放，氧化應(yīng)激，HSC的激活等，這些因素相互影響、相互促進(jìn)，形成一個復(fù)雜的動態(tài)網(wǎng)絡(luò)，最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的質(zhì)和量發(fā)生變化，形成肝纖維化。其中HSC的活化被認(rèn)為是肝纖維化發(fā)生的核心事件[9-10]。HIRI時，受損的肝組織也會釋放大量的生長因子、炎癥相關(guān)因子及發(fā)生氧化應(yīng)激，這些因素均可導(dǎo)致HSC激活，啟動和促進(jìn)肝纖維化的形成。

實驗結(jié)果顯示， HF組大鼠血清ALT、AST水平較Sham組明顯升高。血清ALT、AST的水平在一定程度上反映肝細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，與細(xì)胞的受損情況有關(guān)。說明HF組大鼠肝臟經(jīng)缺血再灌注操作處理后，肝細(xì)胞受到不同程度的損傷，因此血清ALT、AST水平明顯升高。ECM在肝內(nèi)的異常和過度沉積是肝纖維化的主要特征[10-11]。膠原蛋白是ECM中的主要成分，Hyp則是膠原蛋白結(jié)構(gòu)中特有的氨基酸，因此肝組織中Hyp水平可以直接反映肝纖維化的程度。HF組大鼠肝組織Hyp的水平高于Sham組，說明肝組織內(nèi)有大量的膠原增生和沉積。同時HF組大鼠血清中HA和LN水平也較Sham組升高，HA和LN都是ECM的組成成分，在慢性肝損傷過程中血清HA水平與HSC合成、分泌增加及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞攝取、降解減弱有關(guān)，是判斷慢性肝組織炎癥壞死和肝纖維化程度的重要指標(biāo)。LN主要存在于基膜結(jié)構(gòu)中，是基膜所特有的非膠原糖蛋白。血清HA及LN水平升高，說明肝組織中非膠原成分的量是增多的。由此可見，HF組大鼠肝組織中膠原成分及非膠原成分的量都是明顯增加的，說明了經(jīng)HIRI處理的大鼠發(fā)生了肝纖維化。

HSC的活化是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵，α-SMA是HSC活化的特異性標(biāo)志物[11-12]。Western blot結(jié)果顯示HF組α-SMA的蛋白表達(dá)水平較Sham組明顯升高。說明肝組織中有大量的HSC被活化， 活化的HSC可以合成和分泌大量的ECM，這與上述所獲得的結(jié)果相一致。肝臟病理學(xué)的結(jié)果也顯示，HF組大鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞腫脹、胞質(zhì)透亮，氣球樣變性及壞死,匯管區(qū)結(jié)締組織有不同程度增生,呈現(xiàn)出典型的肝纖維化的病理學(xué)特點。

綜上所述，經(jīng)肝缺血再灌注操作處理可以成功誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，利用該方法建立的動物模型更加符合疾病的發(fā)生和發(fā)展規(guī)律,符合臨床實際，為肝纖維化機(jī)制及其他方面的研究提供了一個理想的動物模型。

[1]Hernandez-Gea V，F(xiàn)riedman SL.Pathogenesis of liver fibrosis[J].Annu Rev Pathol,2011,6(5):425-456.

[2]Chirapongsathorn S,Talwalkar JA,Kamath PS.Readmission in cirrhosis:a growing problem[J].Curr Treat Options Gastroenterol,2016,14(2):236-246.

[3]Elpek G.Cellular and molecular mechanisms in the pathogenesis of liver fibrosis:an update [J].World J Gastroenterol,2014,20(23):7260-7276.

[4]侯艷鋒，李暉，梁穎丹，等.肝纖維化動物模型研究進(jìn)展[J].武漢大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2015,36(1):155-158.

[5]薛改,劉建芳,閆成，等.硫代乙酰胺誘導(dǎo)大鼠持久性肝纖維化模型的制備[J].世界華人消化雜志，2015,23(12):1937-1942.

[6]Nastos C,Kalimeris K,Papoutsidakis N,et al.Global consequences of liver ischemia/reperfusion injury [J].Oxid Med Cell Longev，2014，2014:906965.

[7]Prosser CC,Yen RD,Wu J.Molecular therapy for hepatic injury and fibrosis:where are we? [J].World J Gastroenterol,2006,12(4):509-515.

[8]Lu HW,Chen YB,Li YM,et al.Role of hepatic arterial ischaemia in biliary fibrosis following liver transplantation[J].Chin Med J,2010,123(7):907-911.

[9]楊新疆,齊翠花,鄭勇,等.SB203580對肝纖維化大鼠肝臟Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的影響[J].世界華人消化雜志,2014,22(3):310-318.

[10]Toosi AE.Liver fibrosis:causes and methods of assessment,a review [J].Rom J Intern Med,2015,53(4):304-314.

[11]葉立紅,王翀奎,陳秀麗,等.利莫那班對肝纖維化C57小鼠肝組織大麻素受體1及α-SMA表達(dá)的影響[J].天津醫(yī)藥,2014,42(5)：440-442.

[12]Cheng F,Li Y,Feng L,et al.Hepatic stellate cell activation and hepatic fibrosis induced by ischemia/reperfusion injury[J].Tran Proc,2008,40(22):2167-2170.

The establishment of hepatic fibrosis model in rats induced by hepatic ischemia-reperfusion operation*

LiuJunping1,LiuRengui2,CuiXuebin2,SuJuan1,QinYan1△

(1.DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,SchoolofBasicMedicine,DaliUniversity,Dali,Yunnan671000,China;2.DepartmentofGeneralSurgery,AffiliatedHospitalofDaliUniversity,Dali,Yunnan671000,China)

ObjectiveTo establish the model of hepatic ischemia-reperfusion induced hepatic fibrosis．MethodsTotally 16 male Sprague-Dawley rats were divided into two groups:sham group(sham,n=8),hepatic fibrosis group(HF,n=8)．The animal model of hepatic fibrosis was subjected to 90 minutes of ischemia in the left/middle liver lobe to induce partial hepatic ischemia (70%) in HF group,followed by reperfusion,and continued raising for 4 weeks.The rats in sham group were only harassd the hepatic pedicle.The rats were killed at the end of 4 weeks.ALT,AST and HA,LN levels were used to assess the degree of the liver damage and hepatic fibrosis.Liver tissues were employed to measured Hyp.The expression of α-SMA was detected by Western blot.The histological changes of the liver were determined by HE staining.ResultsCompared with the sham group,the serum ALT and AST markedly increased in the HF group,so did the level of HA and LN(P<0.05);the content of Hyp in liver tissue increased in the HF group (P<0.05);the expression of α-SMA protein in the HF group was markedly higher than it in the sham group(P<0.05).The degrees of degeneration and necrosis of hepatocyte in the HF group were significantly more aggravated and infiltration of inflammatory cell were more obvious by the optical microscope,partially formed the fibrous septum compared with the Sham group.ConclusionLiver fibrosis model of rats can be successfully induced by hepatic ischemia-reperfusion operation.

liver cirrhosis;models,animal;hepatic ischemia-reperfusion

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.25.004

云南省自然科學(xué)基金項目資助(2011FZ164)。

劉俊平(1991-)，在讀碩士，主要從事消化生理與病理研究。

,E-mail:lantingxun@126.com。

R575.2

A

1671-8348(2016)25-3469-03

2016-04-18

2016-06-06)