李紅偉，陳　圓，鮑　淼，田慶慶，賀　揚(yáng), 蘇耀輝, 鄒志冠

(1.惠州學(xué)院生命科學(xué)系，廣東　惠州　 516007；2. 廣東金種農(nóng)牧科技股份有限公司, 廣東　惠州　 516007)

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惠陽(yáng)胡須雞LPL、FASN基因多態(tài)性的研究

李紅偉1，陳圓1，鮑淼1，田慶慶1，賀揚(yáng)1, 蘇耀輝2, 鄒志冠2

(1.惠州學(xué)院生命科學(xué)系，廣東惠州 516007；2. 廣東金種農(nóng)牧科技股份有限公司, 廣東惠州 516007)

以惠陽(yáng)胡須雞為研究對(duì)象, 分別以L(fǎng)PL、FASN基因?yàn)橹拘誀钕嚓P(guān)的候選基因, 采用限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)檢測(cè)這2個(gè)候選基因在惠陽(yáng)胡須雞中的多態(tài)性。研究結(jié)果表明，(1) 用限制性?xún)?nèi)切酶HinfⅠ對(duì)LPL 基因第8 內(nèi)含子進(jìn)行RFLP分析，發(fā)現(xiàn)76.3%為已報(bào)道的BB型，另發(fā)現(xiàn)了兩種新的基因型，分別占1.7%和22%，無(wú)AA型; (2) 用限制性?xún)?nèi)切酶HaeⅢ對(duì)FASN基因進(jìn)行RFLP分析,發(fā)現(xiàn)BB基因型比例為64.8%，BC型12.24%，CC型基因型比例23.4%。B等位基因頻率為0.7041，C等位基因頻率為0.2959，B等位基因頻率明顯高于C等位基因頻率。

惠陽(yáng)胡須雞；LPL基因;FASN基因; 限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性

惠陽(yáng)胡須雞，又名三黃胡須雞、龍崗雞、龍門(mén)雞、惠州雞，具有胸肌發(fā)達(dá)、肉質(zhì)佳但生長(zhǎng)速度慢等特點(diǎn)。研究表明，脂肪酸合成酶(FASN)與脂肪性狀緊密相關(guān),在很大程度上決定肉的嫩度、風(fēng)味和多汁性[1]。Graciela等[2]在Campero肉雞品系群體中對(duì)FASN基因進(jìn)行測(cè)序、PCR-RFLP分析，提出FASN是脂肪性狀的候選基因。歐陽(yáng)建華等[3]研究了FASN基因單核苷酸多態(tài)性與雞體重、脂肪沉積性狀的關(guān)系，表明2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與雞體重、脂肪沉積性狀存在一定的相關(guān)性。

脂蛋白酯酶(Lipoprotein Lipase, LPL)是參與脂肪代謝的關(guān)鍵酶[4]。已有研究表明, 肌內(nèi)脂肪含量與肉的嫩度和風(fēng)味密切相關(guān), 是影響雞肉質(zhì)一個(gè)重要因素[5]。LPL 在脂類(lèi)代謝過(guò)程中有著重要的生理和生物學(xué)功能, 可能是影響肌內(nèi)脂肪含量的候選基因。

本研究旨在通過(guò)研究胡須雞中LPL、FASN基因多態(tài)性，為今后基因型選擇以及提高胡須雞的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

雞血樣采自廣東金種農(nóng)牧科技股份有限公司惠陽(yáng)胡須雞保種場(chǎng)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1總DNA的提取采用北京匯天東方科技有限公司小量全血基因組DNA快速提取試劑盒提取, 提取步驟按試劑盒說(shuō)明。

1.2.2電泳檢測(cè)用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA樣品及PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，電泳體系如下：瓊脂糖凝膠濃度1.2%(1.2 g瓊脂糖，100 mL 1×TBE，2 μL Goldview染料)，電泳液1×TBE(108 g Tris，55 g硼酸，0.5 mol·L-1EDTA(pH8.0)40 mL加蒸餾水至1 000 mL后稀釋10倍)，6×Loading buffer 1 μL與DNA樣品1 μL混勻點(diǎn)樣，電壓100 V，電泳80 min后，在WD-9413A凝膠成像分析儀下觀(guān)察電泳條帶。

1.2.3PCR反應(yīng)采用北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司的2×TaqPCR Green Mix試劑盒進(jìn)行PCR， PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCR Green Mix 12.5 μL；DNA模板 0.5μL；上游引物 0.25μL；下游引物 0.25μL；Nuclease-Free 水 11.5 μL。

LPL基因擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，經(jīng)35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。FASN基因擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸2 min，經(jīng)35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。

1.2.4LPL基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的HinfⅠ酶切酶切體系為12 μL，包括以下成分：8 μL PCR產(chǎn)物，1.2 μL 10×Buffer，2.3 μL 滅菌水，0.5 μL HinfⅠ酶。37℃恒溫水浴鍋40 min，80℃10 min滅活酶。酶切產(chǎn)物用1.2%凝膠瓊脂糖電泳檢測(cè)，觀(guān)察結(jié)果。

1.2.5FASN基因PCR產(chǎn)物的HaeⅢ酶切酶切體系為20 μL，包括以下成分：10.0 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，2 μL 10×Buffer，1 μL HaeⅢ酶，7 μL 滅菌水。37℃恒溫消化3 h，用2%凝膠瓊脂糖電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物。

2　結(jié)果與分析

2.1DNA提取結(jié)果

采用北京匯天東方科技有限公司小量全血基因組DNA快速提取試劑盒，取20 μL血樣提取基因組 DNA。如圖1 所示，電泳條帶較為清晰，說(shuō)明本試驗(yàn)提取的DNA 完整性較好，純度和濃度都較高，可用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增。

2.2PCR擴(kuò)增結(jié)果

從圖2 可知，LPL基因 PCR擴(kuò)增目的片段約為1.5 kb，與潘愛(ài)鑾等[4]研究報(bào)道一致。并且每一個(gè)膠孔的DNA熒光帶都很明顯，說(shuō)明PCR效果比較理想，所得到的PCR產(chǎn)物可用于下一步酶切試驗(yàn)。由圖3可以看出，F(xiàn)ASN基因片段，擴(kuò)增片段較清晰，可以確定本次PCR擴(kuò)增結(jié)果，長(zhǎng)度與預(yù)期結(jié)果一致，產(chǎn)物無(wú)雜帶，可以做下一步的酶切反應(yīng)。

2.3酶切結(jié)果分析

用HinfⅠ的酶對(duì)LPL基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切結(jié)果如圖4。在59個(gè)樣品中有45個(gè)樣品為已知基因型種類(lèi)BB型，分別是1～20、22～54以及44，共占76.3%。并未發(fā)現(xiàn)AA型。

HaeⅢ酶切結(jié)果電泳圖，如圖5所示, FASN基因有3種基因型。參照歐陽(yáng)建華等的鑒定方法[3]BB基因型具有780、340、305 bp 3條帶; CC基因型具有780、340、240、65 bp 4條帶; BC基因型具有780、340、305、240、65 bp 5條帶，其中65 bp條帶在凝膠上不可見(jiàn)。

2.4LPL基因型頻率分析

LPL的基因型存在3種基因型，其中已知BB型，新發(fā)現(xiàn)2種基因型，因此，表明惠陽(yáng)胡須雞中LPL基因不處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

2.5FASN基因型頻率分析

惠陽(yáng)胡須雞的FASN的基因型應(yīng)用Hardy-Weinberg遺傳平衡吻合度檢驗(yàn)方法，結(jié)果如表1所示，按自由度=2，查x2界值表得P<0.05，表明惠陽(yáng)胡須雞群體中的FASN基因不處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

表1　FASN基因型的卡方檢驗(yàn)

3　討　論

在本研究中，通過(guò)LPL基因的RCR-RFLP分析發(fā)現(xiàn)，主要為BB型個(gè)體，共占76.3%，并未發(fā)現(xiàn)AA型個(gè)體。而在潘愛(ài)鑾等[4]6個(gè)品種雞LPL基因的RCR-RFLP分析發(fā)現(xiàn)A基因頻率占優(yōu)勢(shì)，并且與其他品種間的基因型分布差異達(dá)到了極顯著水平。說(shuō)明了本次試驗(yàn)結(jié)果和潘愛(ài)鑾等研究結(jié)果不一致。這可能是遺傳背景不同造成，說(shuō)明在該公司惠州胡須雞保種群體B基因頻率占優(yōu)勢(shì)。第21號(hào)樣品出現(xiàn)未知基因型一，其基因頻率占1.7%；這可能是突變導(dǎo)致的新基因型，這與AA、AB、BB型都不一樣，需要進(jìn)一步測(cè)序檢測(cè)分析，才能了解該基因型。第40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53號(hào)樣品呈現(xiàn)未知基因型二，其基因頻率占22%，從電泳結(jié)果表明這些個(gè)體的DNA的PCR產(chǎn)物用HinfⅠ酶切不開(kāi), 這可能是新的突變導(dǎo)致酶切位點(diǎn)的改變，需要進(jìn)一步深入研究。

FASN基因型和等位基因頻率統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，惠州胡須雞以BB基因型和B等位基因占明顯優(yōu)勢(shì)，頻率分布分別為0.642 8和0.704 1。魏伍川等[6]研究了湛江三黃雞FASN不同基因型與腹脂肪性狀的相關(guān)性, 結(jié)果表明FASN基因位點(diǎn)為CC基因型個(gè)體的腹脂率低于BB和BC基因型雞的。而以往的研究報(bào)道[2]表明，BB基因型脂肪沉積能力強(qiáng)且增重快，所以在進(jìn)一步的研究中，需要做不同基因型與胡須雞生長(zhǎng)性狀之間的關(guān)聯(lián)分析，找出增重較快的優(yōu)勢(shì)基因型，應(yīng)用于基因型選擇。

[1]魏伍川，劉欣，陳耀玲. 湛江三黃雞2個(gè)脂肪性狀相關(guān)基因的多態(tài)性及其與屠宰腹脂性狀的相關(guān)分析[ J].廣州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，(2): 95-98.

[2]GRACIELA M, FELISAROZEN, GABRIEL B D, et al. New polymorphism of FASN gene in chicken[J]. JAppl Genet, 2004, 45:453-455.

[3]歐陽(yáng)建華,謝亮, 劉杰,等.雞FASN基因2個(gè)位點(diǎn)的多樣性及其與體重、脂肪沉積性狀的相關(guān)性[ J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2007, 38(1): 25 - 30.

[4]潘愛(ài)鑾，6個(gè)品種雞LPL基因的RCR-RFLP分析[J]，中國(guó)家禽,2004，8(1)：152-154.

[5]李俊英, 李慧鋒, 姜潤(rùn)深, 等. 優(yōu)質(zhì)雞肌內(nèi)脂肪含量與屠體及肉質(zhì)性狀間的關(guān)系[ J]. 中國(guó)畜牧雜志, 2004,40(12)： 12-15.

[6]魏伍川，林麗清，楊清蓮. 鴿FASN基因的部分序列測(cè)定及其與家雞同源序列的比較[J].湛江師范學(xué)院學(xué)報(bào), 2013,3:103-108.

(責(zé)任編輯：林海清)

Restriction Fragment Length Polymorphism of LPL and FASN Genes in Huiyang Bearded Chicken

LI Hong-wei1, CHEN Yuan1, BAO Miao1, TIAN Qing-qing1, HE Yang1,SU Yao-hui2,ZOU Zhi-guan2

(1.DepartmentofLifeScience,HuizhouUniversity,Huizhou，Guangdong516007,China; 2.GuangdongJinzhongAnimalHusbandryCO.,Ltd,Huizhou，Guangdong516021,China)

Restriction fragment length polymorphism (RFLP) of LPL and fatty acid synthetase (FASN) genes in Huiyang bearded chickens was obtained to facilitate the selection for dominant genotypes associated with the high-quality meat and fast-growing characteristics in chicken. Genomic DNA was extracted from the chicken blood. The two genes of interest were amplified by PCR. The amplied product of LPL gene was digested by Hinf I,and FASN gene by Hae III, for RFLP analysis. The results showed that (1) in LPL gene,the genotype BB was76.3%,while the two newly discovered genotypes were 1.7% and 22%, with no AA type detected; (2)in FASN gene, genotype BB， CC, and BC were 64.8%, 23.4%, and 12.24%, respectively,while the frequencies of B and C genes were0.7041 and 0.2959, respectively.

Huiyang bearded chickens；LPL gene；FASN gene；restriction fragment length polymorphism；

2015-12-18初稿；2016-06-02修改稿

李紅偉(1972-),男,博士,講師,主要從事家禽遺傳育種研究(E-mail:lhwcau@163.com)

廣東省普通高校特色創(chuàng)新項(xiàng)目(自然科學(xué)類(lèi))(2014KTSCX178); 惠州學(xué)院博士啟動(dòng)基金(156020021)

S 831

A

1008-0384(2016)07-690-04

李紅偉，陳圓，鮑淼，等.惠陽(yáng)胡須雞LPL、FASN基因多態(tài)性的研究[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，31(7)：690-693.

LI H-W，CHEN Y，BAO M，et al.Restriction Fragment Length Polymorphism of LPL and FASN Genes in Huiyang Bearded Chicken[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(7)：690-693.