劉成榮

(1.莆田學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，福建　莆田　351100；2.福建省新型污染物生態(tài)毒理效應(yīng)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建　莆田　351100)

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枇杷多糖對(duì)草金魚免疫特性的影響

劉成榮1，2

(1.莆田學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，福建莆田351100；2.福建省新型污染物生態(tài)毒理效應(yīng)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建莆田351100)

研究枇杷多糖對(duì)草金魚Carassiusauratus免疫功能的影響，為水產(chǎn)動(dòng)物病害的防治及充分利用枇杷資源提供依據(jù)。以草金魚為試材，通過(guò)注射的方式免疫草金魚，研究枇杷多糖對(duì)草金魚超氧化物歧化酶、溶菌酶、酚氧化酶、白細(xì)胞吞噬率的影響，結(jié)果表明：注射枇杷多糖質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1，免疫21 h時(shí)草金魚血液SOD、溶菌酶活性均達(dá)到最大，分別為37.8 U和128 U；注射枇杷多糖質(zhì)量濃度1.5 mg·mL-1,免疫28 h時(shí)，草金魚血清酚氧化酶活力和白細(xì)胞吞噬率均達(dá)最大，分別為4.1 U、55.68%，說(shuō)明枇杷多糖可以提高草金魚的免疫功能。

枇杷；多糖；草金魚；免疫

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，高密度養(yǎng)殖使水產(chǎn)動(dòng)物的免疫力下降，對(duì)病原體的抵抗力降低，用抗生素治療水產(chǎn)動(dòng)物的病害會(huì)發(fā)生抗藥性、藥物殘留及環(huán)境污染等問(wèn)題，雖然使用疫苗可以防治水生動(dòng)物的病害，但易出現(xiàn)抗原特異性、價(jià)格問(wèn)題及免疫途徑等問(wèn)題。因此要尋找對(duì)環(huán)境無(wú)污染、無(wú)殘留的魚類病害防治的有效方法顯得非常必要。免疫增強(qiáng)劑可以有效提高魚類免疫力[1]。幾千年來(lái)，我國(guó)勞動(dòng)人民用中草藥來(lái)提高人們的免疫力。多糖是中草藥中的主要成分，是有效的免疫增強(qiáng)劑，據(jù)報(bào)道，黃芪多糖、香菇多糖等都能提高水產(chǎn)動(dòng)物的免疫力和對(duì)疾病的抵抗力[2-3]。枇杷是我國(guó)傳統(tǒng)的食藥兼用園藝植物，包含枇杷多糖等有效的成分，枇杷多糖是由同種單糖和異種單糖聚合而成的[4-6]，有關(guān)枇杷多糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物免疫功能的影響尚未見有報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)注射的方式免疫草金魚，在一定時(shí)間測(cè)定魚體超氧化物歧化酶、溶菌酶、酚氧化酶的活性和白細(xì)胞吞噬率等，研究枇杷多糖對(duì)金魚免疫功能的影響，以期為水產(chǎn)動(dòng)物病害的防治及充分利用枇杷資源提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

金魚品種為草金魚，枇杷多糖(從枇杷葉中提取)，提取方法參照參考文獻(xiàn)[4-6]，用蒸餾水溶解配成多糖溶液，主要試劑為分析純的試劑。

1.2試驗(yàn)方法

在注射的第7、14、21、28、35 h分別每重復(fù)隨機(jī)取5尾魚進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定，尾靜脈采血，血液分為兩部分，一部分血液離心得血清備用，測(cè)定SOD、溶菌酶、酚氧化酶。另一部分制備抗凝血用于測(cè)定白細(xì)胞吞噬率。

1.2.2SOD活性測(cè)定 SOD測(cè)定采用鄰苯三酚自氧化方法[7]。50 mmol·L-1的Tris-HCl(pH=8.2)緩沖液3 mL,預(yù)熱至25℃,加入10 mL 50 mmol·L-1的鄰苯三酚,充分搖勻,以緩沖液做空白對(duì)照,在波長(zhǎng)325 nm處每隔30 s測(cè)定吸光度1次。同樣條件,加入10 μL待測(cè)液,讀取其吸光度。測(cè)定3 min內(nèi)每分鐘吸光值的變化。酶活性計(jì)算公式：U/mg=(0.070-△A325) ×100%×V總/[0.070×50%·V0· VS]。其中：△A325：反應(yīng)吸光值變化值；V總：反應(yīng)總體積(mL)；VS：加入樣品液的體積；V0：活力單位定義體積(1 mL)。

1.2.3血清溶菌酶活性的測(cè)定 溶菌酶的測(cè)定采用比濁法[8]。以溶壁微球菌(本單位保存的菌種)為底物，用0.1 mol·L-1，pH6.4的磷酸鉀鹽緩沖液配成底物懸液(OD570nm=0.3～0.5)。取3 mL該懸液于試管內(nèi)加入50 μL待測(cè)血清、混勻,測(cè)吸光值A(chǔ)0。然后將試管移入37℃水浴中30 min，取出后立即置于冰浴中10 min終止反應(yīng)，測(cè)其570 nm處的吸光值A(chǔ)。按公式計(jì)算溶菌酶的活性:U=(A0-A)/A。

1.2.4酚氧化酶(PO)的測(cè)定參照文獻(xiàn)[9-10]，采用比色法進(jìn)行酚氧化酶活力測(cè)定。將0.1 mol·L-1磷酸鉀(3mL)與0.01 mol·L-1-DOPA(50 μL)及血清(50 μL)混合，在15 min內(nèi)每隔3 min在490 nm下測(cè)吸光度(OD490nm)，得光密度隨時(shí)間變化的增長(zhǎng)曲線，以 OD490 nm對(duì)反應(yīng)時(shí)間(min)作圖，以試驗(yàn)條件下每分鐘 OD490 nm增加0.001定義為1個(gè)酶活力單位。

1.2.5白細(xì)胞吞噬率的測(cè)定參考葉繼丹[11]的方法進(jìn)行吞噬率的測(cè)定。取肝素抗凝血0.5 mL，大腸桿菌菌液0.1 mL，在1.5 mL離心管中混合均勻后，在30℃的水浴鍋內(nèi)孵育1 h，再離心10 min，吸取血漿與紅細(xì)胞交界面的白細(xì)胞做血涂片，每個(gè)血樣做2張涂片。自然晾干后，用甲醛固定，姬姆薩染色，置于油鏡下觀察。隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)白細(xì)胞,進(jìn)行吞噬率的測(cè)定。

1.3數(shù)據(jù)分析

用SPSS13.0軟件處理，用單因素方差分析(one-way ANOVA)和 Duncan檢驗(yàn)法，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1枇杷多糖對(duì)草金魚血清SOD活力的影響

比如在學(xué)習(xí)課文的過(guò)程中，在課堂上可以安排學(xué)生按小組討論課文的寫作背景、作者的感情色彩以及課文的中心思想。在討論的過(guò)程中，教師可以到臺(tái)下詢問(wèn)情況和指導(dǎo)，然后讓每個(gè)組就討論的成果派代表做出發(fā)言，教師再對(duì)小組討論的成果進(jìn)行具體分析和總結(jié)，并且給予應(yīng)有的鼓勵(lì)。通過(guò)這種方式，可以極大提高學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性，促使學(xué)生進(jìn)行課前預(yù)習(xí)，在討論的過(guò)程中學(xué)生的語(yǔ)言表達(dá)能力以及協(xié)作與思維能力也得到了提高?；顒?dòng)促進(jìn)了學(xué)生與學(xué)生之間、師生之間的交流溝通和及時(shí)反饋實(shí)際的問(wèn)題，這些對(duì)提高課堂效率有很大的幫助。

枇杷多糖對(duì)草金魚血清SOD活力的影響見圖1，由圖1可見，注射0.5、1.0、1.5、2.0 mg·mL-1枇杷多糖的草金魚血清SOD活力均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，各多糖組在0～21 h內(nèi)隨著枇杷多糖濃度的升高，血清SOD活性也升高，在1.0 mg·mL-1、免疫第21 h時(shí)，草金魚血清SOD活力達(dá)到最大、為37.8 U，顯著高于其他組(P<0.05)。

2.2枇杷多糖對(duì)草金魚血清溶菌酶活力的影響

注射枇杷多糖對(duì)草金魚血清溶菌酶活力的影響見圖2，由圖2可看出，分別注射0.5、1.0、1.5、2.0 mg·mL-1的枇杷多糖，在第14～35 h內(nèi)各多糖組金魚血清溶菌酶活力均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，在枇杷多糖1.0 mg·mL-1、免疫21 h后血清溶菌酶的活性最大，達(dá)到128 U、顯著高于其他多糖組(P<0.05)。在 35～42 h血清溶菌酶的活性呈下降趨勢(shì)。

2.3枇杷多糖對(duì)草金魚血清酚氧化酶活力的影響

注射枇杷多糖對(duì)草金魚血清酚氧化酶活力的影響見圖3，由圖3可看出，在一定時(shí)間內(nèi)分別注射0.5、1.0、1.5、2.0 mg·mL-1的枇杷多糖，隨著時(shí)間的推移，草金魚血清酚氧化的活性也隨著升高，在枇杷多糖1.5 mg·mL-1、免疫28 h后血清酚氧化酶的活性最大，達(dá)到4.1 U。對(duì)注射劑量1.0和1.5 mg·mL-1草金魚血清酚氧化酶活力在0～28 h內(nèi)呈上升趨勢(shì)，28 h后血清酚氧化酶的活性呈下降趨勢(shì)。

2.4枇杷多糖對(duì)草金魚血液白細(xì)胞吞噬率的影響

注射枇杷多糖對(duì)草金魚血液白細(xì)胞吞噬率的影響見圖4，由圖4可知注射1.0和1.5 mg·mL-1的枇杷多糖，隨著注射含量的升高，白細(xì)胞吞噬率也升高，在1.5 mg·mL-1免疫35 h后，草金魚血液白細(xì)胞吞噬率最大，達(dá)到55.68%。在7～35 h時(shí)白細(xì)胞吞噬率呈上升趨勢(shì)，35 h后白細(xì)胞吞噬率呈下降趨勢(shì)，對(duì)于0.5 mg·mL-1組只在第28 h時(shí)白細(xì)胞吞噬率達(dá)到較高水平，但28 h后白細(xì)胞吞噬率趨于穩(wěn)定，2.0 mg·mL-1組的白細(xì)胞吞噬率顯著低于1.5 mg·mL-1組(P<0.05)。

3　討論與結(jié)論

多糖在細(xì)菌、真菌、藻類和高等植物等許多生物普遍存在，由于具有增強(qiáng)免疫力、抗炎癥、抗菌、抗輻射、低毒等生物活性而受到人們的極大關(guān)注。多糖是重要的免疫增強(qiáng)劑，飼料中添加免疫增強(qiáng)劑能提高魚類和貝類的免疫力，提高水產(chǎn)養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益[1，3，12-13]。莆田市是我國(guó)枇杷栽培的主產(chǎn)區(qū)，栽培面積占全國(guó)的1/3左右，每年有大量的枇杷葉浪費(fèi)。枇杷葉是枇杷植物中包括枇杷多糖在內(nèi)許多活性成分的重要來(lái)源之一，因此充分利用枇杷葉資源非常必要。

超氧化物歧化酶(SOD)通過(guò)清除超氧陰離子而起抗氧化作用。SOD在動(dòng)物機(jī)體免疫中起重要作用，本研究中草金魚注射枇杷多糖能顯著提高草金魚血清SOD的活力，這與蟲草多糖、海藻多糖、滸苔多糖等能顯著增強(qiáng)魚、貝類動(dòng)物的SOD活性研究結(jié)果[14-15]相似。本研究中在枇杷多糖質(zhì)量濃度1.0 mg·mL-1、免疫第21 h時(shí)，草金魚血清SOD活力達(dá)到最大，隨著時(shí)間推移，SOD值就逐漸降低，可能的原因是免疫活性劑都有發(fā)揮作用的有效期，超過(guò)其作用的有效期免疫功能就逐漸降低，在本研究中，在溶菌酶、酚氧化酶和白細(xì)胞吞噬率指標(biāo)中都出現(xiàn)類似現(xiàn)象。

溶菌酶是魚類免疫系統(tǒng)的一個(gè)重要部分，它使細(xì)菌溶解，并激活補(bǔ)體系統(tǒng)[16]，溶菌酶使病原菌細(xì)胞壁肽聚糖的β-1，4糖苷鍵斷裂而溶菌、阻止病原菌繁殖蔓延，溶菌酶升高使魚類免于受到病原體的入侵[17]。已有研究表明，枸杞多糖、云芝多糖、酵母免疫多糖等能明顯提高水產(chǎn)動(dòng)物的血清溶菌酶活性[16，18-19]。本研究與已有的研究結(jié)果相似。

酚氧化酶能氧化機(jī)體的酚類物質(zhì)成醌，醌類可抑制微生物的感染而自我保護(hù)，酚氧化酶可以被一些包括β-1，3葡聚糖等多糖激活。已有研究認(rèn)為，在飼料中添加1 g·kg-1的云芝多糖和蟲草菌絲多糖，日本沼蝦酚氧化酶活性升高，高于對(duì)照組[20]；飼喂12周添加1、2和3%榴蓮多糖的對(duì)蝦血淋巴酚氧化酶活力顯著高于對(duì)照組(P<0.05)[21]，用添加0.5%羊棲菜多糖(SFPSE)的飼料飼喂對(duì)蝦，多糖組對(duì)蝦的血清酚氧化酶活力顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，然而1.0% SFPSE組的血清酚氧化酶活力顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，0.5%和1.0%組對(duì)蝦肌肉溶菌酶活力極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，但對(duì)照組和2.0% SFPSE組的肌肉溶菌酶活力差異不明顯(P>0.05)[22]。在本研究中溶菌酶和白細(xì)胞吞噬率指標(biāo)在高含量多糖組時(shí)比較低含量多糖組的指標(biāo)要低，其可能原因是免疫活性劑在適宜的含量下才能提高動(dòng)物免疫功能，但高含量時(shí)只起抑制作用，因此在使用時(shí)要采用適宜含量的多糖，否則會(huì)降低動(dòng)物的免疫力。

吞噬作用是所有動(dòng)物最常見的防御機(jī)制，魚類的免疫系統(tǒng)與哺乳動(dòng)物不同，它的非特異性免疫機(jī)制是疾病的防御不可或缺的一部分，白細(xì)胞吞噬功能具有反映機(jī)體非特異性免疫能力的作用,李光友等[23]研究表明脂多糖能顯著提高中國(guó)對(duì)蝦血細(xì)胞的吞噬作用，人們研究發(fā)現(xiàn)對(duì)蝦血細(xì)胞膜上存在有多糖的受體蛋白或結(jié)合蛋白，病原體表面的多糖與膜上相應(yīng)的蛋白作用，增強(qiáng)殺菌作用[24]，本研究也得出枇杷多糖也能顯著提高草金魚白細(xì)胞的吞噬作用。

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(責(zé)任編輯：翁志輝)

Effect of Loquat Polysaccharide on the Immunity ofCarassiusauratus

LIU Cheng-rong1,2

(1.CollegeofEnvironmentalandBiologicalEngineering，PutianUniversity,Putian,Fujian351100,China；2.FujianProvincialKeyLaboratoryofEcologyToxicologicalEffects&ControlforEmergingContaminantsPutian,Fujian351100,China)

The study on the effect of loquat polysaccharides on the immunity ofCarassiusauratuscould provide some evidences for controlling the disease of aquatic animal and making full use of resources of loquat. Therefore, taking theCarassiusauratusas testing material, theCarassiusauratuswas immune by being injected with loquat polysaccharides, in order to study the effect of loquat polysaccharides on superoxide dismutase, lysozyme, phenoloxidase and phagocytic rate. The results showed that: when theCarassiusauratuswas injected with1.0 mg·mL-1loquat polysaccharide for 21 hours, the blood SOD and lysozyme reached the highest, which were respectively 37.8 U and 128 U; when theCarassiusauratuswas injected with 5 mg·mL-1loquat polysaccharide for 28 hours, the blood phenoloxidase activity and phagocytic rates reached the peak value, which were respectively 4.1 U and 55.68%, showing that the loquat polysaccharides could enhance the immune function ofCarassiusauratus.

loquat；polysaccharide;Carassiusauratus; immunity

2016-02-15初稿；2016-05-14修改稿

劉成榮(1964-)，男，教授，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物病害防治方面研究(E-mail：ptulcr@126.com)

福建省屬高?？蒲袑ｍ?xiàng)(JK2013046)

Q 329.2

A

1008-0384(2016)07-694-05

劉成榮.枇杷多糖對(duì)草金魚免疫特性的影響[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，31(7)：694-698.

LIU C-R.Effect of Loquat Polysaccharide on the Immunity ofCarassiusauratus[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(7)：694-698.