李丹，劉春雷，江連洲

（1.寧德師范學(xué)院，福建寧德352100；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱　150030）

不同大豆品種11S球蛋白結(jié)構(gòu)特性與表面疏水性關(guān)系研究

李丹1，劉春雷1，江連洲2*

（1.寧德師范學(xué)院，福建寧德352100；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱150030）

以6個(gè)代表性大豆品種制備11S球蛋白，研究大豆11S球蛋白結(jié)構(gòu)特性與表面疏水性關(guān)系。采用ANS熒光探針?lè)y(cè)定表面疏水性，Ellman試劑分析法測(cè)定巰基和二硫鍵含量，激光拉曼光譜和熒光光譜分析空間構(gòu)象。結(jié)論表明，大豆11S球蛋白表面疏水性與α-螺旋含量、β-折疊含量負(fù)相關(guān)，與β-轉(zhuǎn)角含量、無(wú)規(guī)則卷曲含量正相關(guān)；與拉曼光譜色氨酸費(fèi)米共振I1360/I1340值負(fù)相關(guān)，與拉曼光譜酪氨酸費(fèi)米共振I850/I830值正相關(guān)，與暴露酪氨酸殘基克分子數(shù)正相關(guān)，與N暴露∶N包埋值正相關(guān)；與暴露巰基含量、巰基暴露程度正相關(guān)，與游離巰基含量、二硫鍵含量、二硫鍵構(gòu)象相關(guān)性不顯著。

大豆11S球蛋白；拉曼光譜；熒光光譜；巰基和二硫鍵；表面疏水性

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間2016-7-20 11:10:55［URL］http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160720.1110.010.html

李丹,劉春雷,江連洲.不同大豆品種11S球蛋白結(jié)構(gòu)特性與表面疏水性關(guān)系研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,47(7):32-39.

Li Dan,Liu Chunlei,Jiang Lianzhou.Relationship between structure characteristics and surface hydrophobicity of 11S with different soybean varieties[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(7):32-39.(in Chinese with English abstract)

大豆11S球蛋白是大豆蛋白質(zhì)主要成分之一，對(duì)大豆蛋白質(zhì)功能性質(zhì)起決定性作用［1］。表面疏水性是重要蛋白質(zhì)表面性質(zhì)，是衡量蛋白質(zhì)功能性質(zhì)關(guān)鍵指標(biāo)之一，研究蛋白質(zhì)表面疏水性有助于更好地理解和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)功能性質(zhì)。近年來(lái)大量研究表明，蛋白質(zhì)表面疏水性與理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特性等密切相關(guān)，大豆蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特性和理化性質(zhì)隨大豆品種和產(chǎn)地不同有差異［2］，但研究大多以SPI為研究對(duì)象，無(wú)法排除大豆蛋白7S和11S組分協(xié)同作用。采用純品大豆11S和7S球蛋白研究品種差異對(duì)大豆蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特性及表面疏水性影響，探討大豆蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特性與表面疏水性構(gòu)效關(guān)系，在國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。

本研究選擇我國(guó)具有區(qū)域代表性6個(gè)大豆品種，制備純品大豆11S球蛋白，分析不同品種大豆11S球蛋白巰基基團(tuán)組成、空間構(gòu)象及表面疏水性，探討不同大豆品種11S球蛋白結(jié)構(gòu)特性與表面疏水性關(guān)系，為明確大豆蛋白質(zhì)組成、空間構(gòu)象與表面疏水性構(gòu)效關(guān)系奠定理論基礎(chǔ)，為開(kāi)發(fā)SPI特定功能性產(chǎn)品提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

材料：大豆，東農(nóng)42（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所提供）；黑農(nóng)46、合豐55（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆所提供）；冀豆12（河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所提供）；皖豆28（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供）；福豆234（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供）。大豆粉碎后過(guò)40目篩，正己烷脫脂，得脫脂大豆粉，以脫脂豆粉為原料制備大豆11S球蛋白，凱氏定氮和SDS-PAGE電泳綜合分析其純度均在95%以上［3］。

試劑：ANS（1-苯胺基-8-萘磺酸）、DTNB（5，5'-二硫雙-2-硝基苯甲酸）、Na2EDTA、Tris（三羥甲基氨基甲烷）、甘氨酸均為Sigma公司，β-巰基乙醇為優(yōu)級(jí)純，其余試劑為國(guó)內(nèi)分析純。

主要儀器：PerkinElmer Raman Station 400拉曼光譜儀（美國(guó)PE公司），F(xiàn)-4500熒光分光光度計(jì)（日本HITACHI公司），Allegra64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)貝克曼公司），722型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1表面疏水性測(cè)定

采用ANS熒光探針?lè)ǎ?］。

1.2.2巰基和二硫鍵含量測(cè)定

采用Ellman試劑分析方法，即DNTB比色法［5］，做適當(dāng)調(diào)整。

暴露巰基含量測(cè)定：稱取約15 mg樣品溶于5 mL Tris-Gly緩沖液中，漩渦振蕩，加入50 μL Ellman試劑，混勻后于（25±1）℃恒溫水浴中保溫1 h，10 000×g離心15 min，上清液測(cè)定412 nm處吸光值，以試劑空白調(diào)零，測(cè)定樣品空白，計(jì)算暴露巰基含量。

游離巰基含量測(cè)定：游離巰基包括暴露巰基和包藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部巰基。稱取約15 mg樣品溶于5 mL Tris-Gly-8 M Urea溶液中，漩渦振蕩，加入100 μL Ellman試劑，混勻后于（25±1）℃恒溫水浴中保溫1 h，10 000×g離心15 min，上清液測(cè)定412 nm處吸光值，以試劑空白調(diào)零，同時(shí)測(cè)定樣品空白，計(jì)算游離巰基含量。

二硫鍵含量測(cè)定：總巰基基團(tuán)由游離巰基和二硫鍵兩部分組成?？値€基基團(tuán)測(cè)定方法如下：稱取約15 mg樣品，溶于10 mL尿素-鹽酸胍混合液和100 μL β-巰基乙醇，將此混合物在（25±1）℃恒溫水浴中保溫1 h，取出加入20 mL 12%TCA溶液，（25±1）℃恒溫水浴中再次保溫1 h，5 000×g離心10 min。沉淀分散在20 mL 12%TCA溶液中，然后離心除去β-巰基乙醇，重復(fù)2次后將沉淀溶解于10 mL Tris-Gly-8 M Urea溶液，漩渦振蕩至完全溶解。取稀釋到適宜濃度樣品溶液5 mL，加Ellman試劑100 μL，漩渦混勻后于（25±1）℃恒溫水浴中保溫1 h，10 000×g離心15 min，上清液測(cè)定412 nm處吸光值，以試劑空白調(diào)零，同時(shí)測(cè)定樣品空白，計(jì)算總巰基基團(tuán)含量。總巰基基團(tuán)含量減去游離巰基含量，差值再除以2，即為二硫鍵含量。

巰基含量計(jì)算公式如下：

式中，A412-除去樣品空白和試劑空白后吸光值；D-稀釋倍數(shù)；C-樣品中蛋白質(zhì)含量（g·L-1）；13 600-Ellman試劑摩爾吸光系數(shù)，（L·（mol·cm）-1>。

1.2.3激光拉曼光譜（Raman）測(cè)定

參考張萍方法［6］。將樣品粉末直接平鋪在載玻片上測(cè)定，激發(fā)光波長(zhǎng)為785 nm，激光功率為300 mW，掃描范圍400～2 000 cm-1，每次掃描時(shí)間60 s，積分10次，四次掃描進(jìn)行累加。譜圖基線校正、譜峰歸屬查找采用ACD Labs V12軟件。以苯丙氨酸譜峰（1 003±1）cm-1強(qiáng)度作為歸一化因子，得到不同品種大豆11S球蛋白拉曼光譜，采用Origin 8.0軟件繪制。

1.2.4熒光光譜測(cè)定

［7］方法。采用F-4500熒光分光光度計(jì)測(cè)定不同品種大豆11S球蛋白內(nèi)源性熒光光譜（色氨酸熒光光譜）。將樣品分別分散于pH 7.6磷酸鹽緩沖液中，配成濃度為0.4 mg·mL-1蛋白溶液。熒光發(fā)射光譜分析以蛋白質(zhì)分子內(nèi)部色氨酸熒光基團(tuán)為探針，為降低酪氨酸貢獻(xiàn)，熒光光譜激發(fā)波長(zhǎng)為290 nm，發(fā)射光譜掃描范圍為300～400 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬均為5 nm。

1.2.5統(tǒng)計(jì)與分析

單項(xiàng)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS V18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和相關(guān)性分析，如方差分析差異性顯著（P＜0.05），則使用Duncan作多重比較。采用Origin 8.0軟件進(jìn)行圖譜分析和圖表制作。

2　結(jié)果與分析

2.1表面疏水性分析

如圖1所示，6個(gè)品種大豆11S球蛋白表面疏水性指數(shù)在1 432.73～1 623.00之間（P＜0.01），東農(nóng)42-11S（1 623.00）＞合豐55-11S（1 588.43）＞黑農(nóng)46-11S（1 561.13）＞冀豆12-11S（1 486.93）＞皖豆28-11S（1 463.93）＞福豆234-11S（1 432.73）。可見(jiàn)，品種差異對(duì)大豆11S球蛋白表面疏水性影響極顯著，這可能與不同品種大豆11S球蛋白結(jié)構(gòu)特性差異有關(guān)。

圖1　不同品種大豆11S球蛋白表面疏水性Fig.1Surface hydrophobicity of 11S with different soybean varieties

2.2主鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)與表面疏水性關(guān)系

蛋白質(zhì)主鏈構(gòu)象主要由拉曼光譜酰胺Ⅰ帶（1 630～1 690 cm-1）和酰胺Ⅲ帶（1 225～1 310 cm-1）特征峰確定，不同品種大豆11S球蛋白拉曼光譜見(jiàn)圖2。酰胺Ⅰ帶結(jié)構(gòu)歸屬普遍認(rèn)為：α-螺旋結(jié)構(gòu)在1 645～1 658 cm-1；β-折疊結(jié)構(gòu)在1 665～1 680 cm-1；β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)在1 640～1 644和1 681～1 690 cm-1；無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)在1 659～1 664 cm-1［8］。而酰胺Ⅲ帶結(jié)構(gòu)歸屬尚存在矛盾［9-11］。理論上酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅲ帶給出主鏈構(gòu)象定量信息應(yīng)一致，考慮酰胺Ⅲ帶譜峰結(jié)構(gòu)歸屬矛盾性，本研究?jī)H對(duì)不同品種大豆11S球蛋白拉曼光譜酰胺Ⅰ帶定量分析，采用Raman Spectral Analysis Package Version 2.1軟件完成，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，品種差異對(duì)大豆11S球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)四種類型α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲含量影響極顯著。相關(guān)性分析表明，大豆11S球蛋白表面疏水性與α-螺旋含量呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.899，P=0.015），與β-折疊含量呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.906，P=0.013），與β-轉(zhuǎn)角含量呈顯著正相關(guān)（r=0.848，P=0.033），與無(wú)規(guī)則卷曲含量呈顯著正相關(guān)（r=0.882，P=0.020）。

圖2　不同品種大豆11S球蛋白拉曼光譜Fig.2Raman spectrum of 11S with different soybean varieties

表1　不同品種大豆11S球蛋白拉曼光譜酰胺I帶擬合結(jié)果Table 1Raman spectrum amide I bands results of 11S with different soybean varieties（%）

2.3側(cè)鏈芳香氨基酸殘基微環(huán)境與表面疏水性關(guān)系

2.3.1熒光光譜分析

由于酪氨酸殘基熒光熄滅和色氨酸殘基熒光增加，大豆蛋白質(zhì)熒光發(fā)射光譜實(shí)際上是色氨酸殘基熒光光譜。如圖3所示，東農(nóng)42、黑農(nóng)46和合豐5511S球蛋白λmax為335.60 nm，冀豆12、皖豆28和福豆23411S球蛋白λmax為334.60 nm，說(shuō)明6個(gè)品種大豆11S球蛋白色氨酸殘基全部暴露于分子表面［12］。由于樣品濃度相同，在λmax相同情況下，色氨酸殘基熒光峰熒光強(qiáng)度越大，表示暴露在蛋白質(zhì)表面色氨酸殘基數(shù)量越多。分析結(jié)果顯示，6個(gè)品種大豆11S球蛋白色氨酸殘基暴露程度為東農(nóng)42＞合豐55＞黑農(nóng)46＞冀豆12＞皖豆28＞福豆234，將此結(jié)果與表面疏水性作對(duì)比分析，色氨酸殘基暴露程度越大，暴露數(shù)量越多，大豆11S球蛋白表面疏水性越高。

2.3.2拉曼光譜色氨酸殘基微環(huán)境分析

蛋白質(zhì)拉曼光譜1 340和1 360 cm-1附近色氨酸雙線是環(huán)境疏水性標(biāo)志：吲哚環(huán)親脂反應(yīng)會(huì)使1 360 cm-1附近譜峰增強(qiáng)，1 340 cm-1附近譜峰減弱，可用I1360/I1340反映色氨酸殘基微環(huán)境情況［13］，不同品種大豆11S球蛋白拉曼光譜見(jiàn)圖2。

如圖4所示，6個(gè)品種大豆11S球蛋白I1360/I1340值差異較大，說(shuō)明品種差異對(duì)大豆11S球蛋白色氨酸殘基微環(huán)境影響較大。相關(guān)性分析表明，大豆11S球蛋白表面疏水性與拉曼光譜I1360/I1340值呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.910，P=0.012）。說(shuō)明大豆11S球蛋白表面疏水性與色氨酸殘基暴露情況密切相關(guān)。I1360/ I1340越小，色氨酸吲哚環(huán)與環(huán)境中脂肪類基團(tuán)之間親脂反應(yīng)越弱，色氨酸所處微環(huán)境極性越強(qiáng)，即色氨酸殘基暴露程度越大，暴露數(shù)量越多，表面疏水性越高。

圖3　不同品種大豆11S球蛋白熒光光譜Fig.3Fluorescence spectrum of 11S with different soybean varieties

圖4　不同品種大豆11S球蛋白拉曼光譜色氨酸費(fèi)米共振I1360/I1340Fig.4Raman spectrum tryptophan fermi resonance I1360/I1340of 11S with different soybean varieties

2.3.3拉曼光譜酪氨酸殘基微環(huán)境分析

蛋白質(zhì)拉曼光譜850和830 cm-1譜峰是酪氨酸殘基對(duì)位取代苯有關(guān)振動(dòng)。兩峰強(qiáng)度比I850/I830可表征酪氨酸殘基暴露與包埋情況，當(dāng)0.5＜I850/I830＜1.25時(shí)，可由方程式（0.5N包埋+1.25N暴露=I850/I830，N包埋+ N暴露=1）計(jì)算暴露在分子表面和包埋在分子內(nèi)部酪氨酸殘基克分子數(shù)N［14］，不同品種大豆11S球蛋白拉曼光譜見(jiàn)圖2。

由表2可知，6個(gè)品種大豆11S球蛋白酪氨酸殘基均較多暴露于分子表面，且暴露程度差異較大?？梢?jiàn)，品種差異對(duì)大豆11S球蛋白酪氨酸殘基暴露程度影響顯著。相關(guān)性分析表明，大豆11S球蛋白表面疏水性與拉曼光譜I850/I830值呈顯著正相關(guān)（r=0.893，P=0.017），與暴露酪氨酸殘基克分子數(shù)呈顯著正相關(guān)（r=0.893，P=0.016），與N暴露：N包埋值呈顯著正相關(guān)（r=0.894，P=0.016）。說(shuō)明大豆11S球蛋白表面疏水性與酪氨酸殘基暴露程度密切相關(guān)，酪氨酸殘基暴露于分子表面數(shù)量越多，表面疏水性越高。

2.4巰基基團(tuán)組成與表面疏水性關(guān)系

2.4.1巰基基團(tuán)含量與表面疏水性關(guān)系

如圖5所示，6個(gè)品種大豆11S球蛋白巰基基團(tuán)主要以二硫鍵形式存在，且暴露巰基含量、游離巰基含量和二硫鍵含量均存在極顯著差異（P＜0.01），說(shuō)明品種差異對(duì)大豆11S球蛋白巰基基團(tuán)含量影響極顯著。相關(guān)性分析表明，大豆11S球蛋白表面疏水性與游離巰基含量、二硫鍵含量相關(guān)性均不顯著，與暴露巰基含量呈顯著正相關(guān)（r=0.853，P=0.031），與巰基暴露程度（暴露巰基含量/游離巰基含量）呈顯著正相關(guān)（r=0.822，P=0.045）。

2.4.2二硫鍵構(gòu)象與表面疏水性關(guān)系

蛋白質(zhì)拉曼光譜500～550 cm-1是二硫鍵伸縮振動(dòng)特征頻率。兩個(gè)半胱氨酸形成二硫橋，其C-C-SS-C-C結(jié)構(gòu)單元有三種構(gòu)型，可由拉曼光譜二硫鍵特征振動(dòng)頻率判斷，不同品種大豆11S球蛋白拉曼光譜見(jiàn)圖2。通常將510 cm-1附近譜峰歸屬為gauche-gauche-gauche（g-g-g）構(gòu)型，525 cm-1附近譜峰歸屬為gauche-gauche-trans（g-g-t）構(gòu)型，540 cm-1附近譜峰歸屬為trans-gauche-trans（t-g-t）構(gòu)型［13］。由表3可知，不同品種大豆11S球蛋白二硫鍵構(gòu)型模式差異較大，說(shuō)明品種差異對(duì)大豆11S球蛋白二硫鍵構(gòu)象影響較大。相關(guān)性分析表明，大豆11S球蛋白表面疏水性與二硫鍵g-g-g構(gòu)型含量、g-g-t構(gòu)型含量、t-g-t構(gòu)型含量相關(guān)性均不顯著，說(shuō)明大豆11S球蛋白表面疏水性與二硫鍵構(gòu)象相關(guān)性不顯著。

表2　不同品種大豆11S球蛋白I850/I830及酪氨酸殘基分析結(jié)果Table 2I850/I830and tyrosine residues analysis results of 11S with different soybean varieties

圖5　不同品種大豆11S球蛋白巰基基團(tuán)含量Fig.5Sulphydryl groups content of 11S with different soybean varieties

表3　不同品種大豆11S球蛋白二硫鍵構(gòu)象分析結(jié)果Table 3Disulfide bond conformation analysis results of 11S with different soybean varieties

3　討論

3.1主鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)與表面疏水性關(guān)系

蛋白質(zhì)分子空間構(gòu)象與其二級(jí)結(jié)構(gòu)類型密切相關(guān)，影響蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和功能特性。本研究應(yīng)用激光拉曼光譜分析不同品種大豆11S球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果與應(yīng)用圓二色光譜和傅里葉紅外光譜等手段研究結(jié)果一致［3-4］，即不同品種大豆11S球蛋白表面疏水性與α-螺旋含量和β-折疊含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與β-轉(zhuǎn)角含量和無(wú)規(guī)則卷曲含量呈顯著正相關(guān)。這可能與α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲自身結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，及其對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)形成影響有關(guān)。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)分子在主鏈折疊盤曲形成構(gòu)象基礎(chǔ)上，分子中各個(gè)側(cè)鏈R基所形成構(gòu)象。側(cè)鏈構(gòu)象主要是形成微區(qū)。大豆蛋白質(zhì)等球狀蛋白質(zhì)通過(guò)疏水相互作用形成疏水區(qū)和親水區(qū)，親水區(qū)多在蛋白質(zhì)分子表面，由很多親水側(cè)鏈組成；疏水區(qū)多在分子內(nèi)部，由疏水側(cè)鏈集中構(gòu)成。α-螺旋結(jié)構(gòu)肽鏈中氨基酸側(cè)鏈R基分布在螺旋外側(cè)，β-折疊結(jié)構(gòu)氨基酸側(cè)鏈R基伸出在鋸齒上方或下方，這兩種二級(jí)結(jié)構(gòu)類型氨基酸側(cè)鏈R基均裸露在結(jié)構(gòu)表面，疏水側(cè)鏈容易通過(guò)疏水相互作用結(jié)合在一起形成緊密球形疏水區(qū)域，使疏水基團(tuán)埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水核心中，使蛋白質(zhì)具有較低表面疏水性。β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)較小，常見(jiàn)轉(zhuǎn)角只含有4個(gè)氨基酸殘基，無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)松散、不規(guī)則，使氨基酸疏水側(cè)鏈容易暴露于蛋白質(zhì)表面，蛋白質(zhì)具有較高表面疏水性。

3.2側(cè)鏈芳香氨基酸殘基微環(huán)境與表面疏水性關(guān)系

本研究應(yīng)用熒光光譜和拉曼光譜分析不同品種大豆11S球蛋白側(cè)鏈芳香氨基酸殘基微環(huán)境。熒光光譜、拉曼光譜色氨酸費(fèi)米共振I1360/I1340和酪氨酸費(fèi)米共振I850/I830分析結(jié)果一致，表明大豆11S球蛋白表面疏水性與疏水性氨基酸殘基暴露密切相關(guān)，疏水性氨基酸殘基暴露程度越大，暴露數(shù)量越多，表面疏水性越大。反之，疏水性氨基酸殘基暴露程度越小，暴露數(shù)量越少，表面疏水性越小，與王中江等研究結(jié)果一致［7，10］。分析其原因?yàn)椋翰煌贩N大豆11S球蛋白氨基酸組成、亞基組成和空間結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致疏水基團(tuán)暴露程度差異，而大豆蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)暴露程度是決定其表面疏水性主要原因［15］。

3.3巰基基團(tuán)組成與表面疏水性關(guān)系

巰基（也稱游離巰基）和二硫鍵是大豆蛋白質(zhì)中重要功能基團(tuán)，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)方面發(fā)揮重要作用。本研究采用Ellman試劑法分析巰基和二硫鍵含量，采用拉曼光譜法分析二硫鍵構(gòu)象。結(jié)果顯示：不同品種大豆11S球蛋白表面疏水性與游離巰基含量、二硫鍵含量和二硫鍵構(gòu)象相關(guān)性均不顯著，而與暴露巰基含量呈顯著正相關(guān)，與巰基暴露程度呈顯著正相關(guān)。本研究分析巰基暴露程度與表面疏水性相關(guān)性時(shí)考慮不同品種大豆11S球蛋白游離巰基含量存在顯著差異，僅考查暴露巰基含量對(duì)表面疏水性影響可能不夠嚴(yán)謹(jǐn)，巰基暴露程度可能更說(shuō)明問(wèn)題。眾多研究指出，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變時(shí)，暴露巰基含量與表面疏水性指數(shù)變化趨勢(shì)一致，即暴露巰基含量越多，表面疏水性指數(shù)越大［16］。分析其原因可能是：大豆蛋白質(zhì)暴露巰基含量越多，結(jié)構(gòu)越伸展，疏水基團(tuán)暴露在蛋白質(zhì)表面幾率越大，表現(xiàn)為表面疏水性越高。

4　結(jié)論

a.大豆11S球蛋白主鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)表面疏水性影響顯著：大豆11S球蛋白表面疏水性與α-螺旋含量呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.899），與β-折疊含量呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.906），與β-轉(zhuǎn)角含量呈顯著正相關(guān)（r=0.848），與無(wú)規(guī)則卷曲含量呈顯著正相關(guān)（r= 0.882）。

b.大豆11S球蛋白表面疏水性與疏水性氨基酸殘基暴露密切相關(guān)：大豆11S球蛋白表面疏水性與拉曼光譜酪氨酸費(fèi)米共振I850/I830值呈顯著正相關(guān)（r=0.893），與暴露酪氨酸殘基克分子數(shù)呈顯著正相關(guān)（r=0.893），與N暴露：N包埋值呈顯著正相關(guān)（r= 0.894），即酪氨酸殘基暴露于分子表面數(shù)量越多，表面疏水性越高；與拉曼光譜色氨酸費(fèi)米共振I1360/ I1340值呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.910），即色氨酸殘基暴露程度越大，表面疏水性越高，與熒光光譜分析結(jié)果一致。

c.大豆11S球蛋白表面疏水性與暴露巰基含量呈顯著正相關(guān)（r=0.853），與巰基暴露程度呈顯著正相關(guān)（r=0.822），與游離巰基含量、二硫鍵含量、二硫鍵構(gòu)象相關(guān)性均不顯著。

[參考文獻(xiàn)]

［1］Wang W Y，Bringe N A，Berhow M A，et al．β-Conglycinins among sources of bioactives in hydrolysates of different soybean varieties that inhibit leukemia cells in vitro［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56（11）:4012-4020．

［2］Natarajan S，Xu Chen P，Bae H，et al．Proteomic and genetic analysis of glycinin subunits of sixteen soybean genotypes［J］．Plant Physiology and Biochemistry，2007，45（6/7）:436-444．

［3］李丹，劉春雷，江連洲．純品7S和11S蛋白結(jié)構(gòu)與表面疏水性相關(guān)性研究［J］．食品研究與開(kāi)發(fā)，2015，36（7）:5-9，22．

［4］劉春雷，孫立斌，李相昕，等．大豆7S和11S蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)與表面疏水性相關(guān)性研究［J］．食品科學(xué)，2015，36（17）:28-32．

［5］吳偉．蛋白質(zhì)氧化對(duì)大豆蛋白結(jié)構(gòu)和凝膠性質(zhì)影響［D］．無(wú)錫:江南大學(xué)，2010．

［6］張萍，鄭大威，劉晶，等．基于表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)豆芽6-BA殘留快速檢測(cè)方法［J］．光譜學(xué)與光譜分析，2012（5）:1266-1269．

［7］王中江，江連洲，魏冬旭，等．pH值對(duì)大豆分離蛋白構(gòu)象及表面疏水性影響［J］．食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2012，33（11）:47-51．

［8］張莉莉．高溫（100-120℃）處理對(duì)魚糜及其復(fù)合凝膠熱穩(wěn)定性影響［D］．青島:中國(guó)海洋大學(xué)，2013．

［9］楊芳．豆腐凝膠形成機(jī)理及水分狀態(tài)與品質(zhì)關(guān)系研究［D］．武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009．

［10］王中江，江連洲．大豆分離蛋白在不同pH下拉曼分析［J］．食品工業(yè)科技，2012，33（11）:63-66．

［11］孫為正．廣式臘腸加工過(guò)程中脂質(zhì)水解、蛋白質(zhì)降解及風(fēng)味成分變化研究［D］．廣州:華南理工大學(xué)，2011．

［12］Vivian J T，Callis P R．Mechanisms of tryptophan fluorescence shifts in proteins［J］．Biophysical Journal，2001，80（5）:2093-2109．

［13］趙偉．高壓脈沖電場(chǎng)在液態(tài)蛋殺菌中應(yīng)用及其對(duì)微生物和蛋白質(zhì)作用機(jī)制［D］．無(wú)錫:江南大學(xué)，2009．

［14］Li-chan E C Y．The applications of Raman spectroscopy in food science［J］．Trends in Food Science and Technology，1996，7（11）: 361-370．

［15］Matemu A O，Kayahara H，Murasawa H，et al．Improved emulsifying properties of soy proteins by acylation with saturated fatty acids［J］．Food Chemistry，2011，124:596-602．

［16］胥偉，王海濱，黃迪，等.糖基化反應(yīng)過(guò)程中卵白蛋白分子特性變化研究［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，46（12）:33-38.

Relationship between structure characteristics and surface hydrophobicity of 11S with different soybean varieties

LI Dan1,LIU Chunlei1,JIANG Lianzhou2
(1.Ningde Normal University,Ningde Fujian 352100,China;2.School of Food Science, Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

In this study,globulin(11S)was prepared with soybean from six representative regions as raw material,and the relationship between the structure characteristics and surface hydrophobicity of 11S was studied.The surface hydrophobicity of 11S was determined by ANS fluorescent probe method, the content of sulfhydryl and disulfide bond was determined by Ellman reagent analysis method,and conformation was analyzed by Raman spectroscopy and fluorescence spectroscopy.The main research results were as follows:correlation analysis showed that there was significantly negative correlation between surface hydrophobicity and the content ofα-helix,β-sheet and Fermi resonance Raman spectra of tryptophan I1360/I1340ratio.There was positive correlation between surface hydrophobicity andβturn,random coil,Fermi resonance Raman spectra of tryptophan I850/I830ratio,the number of exposed tyrosine residues,the value of Nexposure:Nembedding and the content of exposed sulfhydryl.There was not correlation between the surface hydrophobicity and the content of free sulfhydryl,the content of disulfide bond and disulfide bond conformation.

soybean globulin(11S);raman spectrum;fluorescence spectrum;sulfhydryl and disulfide bond;surface hydrophobicity

TS201.2

A

1005-9369（2016）07-0032-07

2016-04-01

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2014BAD22B01）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31071493）；寧德師范學(xué)院服務(wù)閩東項(xiàng)目（2012H314）；寧德師范學(xué)院6.18項(xiàng)目（2012H213）

李丹（1983-），女，講師，博士，研究方向?yàn)榧Z食、油脂及植物蛋白工程。E-mail:116127847@qq.com

江連洲，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榧Z食、油脂及植物蛋白工程。E-mail:501342131@qq.com