谷偉，郭媛，戶國，孫鵬，白慶利，王炳謙

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱　150070）

美洲紅點鮭、白斑紅點鮭及雜交后代遺傳分析

谷偉，郭媛，戶國，孫鵬，白慶利，王炳謙*

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱150070）

以美洲紅點鮭和白斑紅點鮭雙列雜交F1及其自交形成的4個群體為試驗材料，利用7對微衛(wèi)星引物分析遺傳結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，7對引物均表現(xiàn)良好多態(tài)性，可作4個群體遺傳結(jié)構(gòu)分析；各組合PIC平均值0.5079～0.6467，屬高度多態(tài)性；有效等位基因數(shù)4.3688～5.5764；平均觀測雜合度0.6857～0.7143，平均期望觀測雜合度0.6290～0.8234，雜交組中雜合度高于雙親，均顯示子代高遺傳變異水平；4個群體中，美洲紅點鮭純繁群體（AA）和美白雜交群體（AB）間遺傳距離最大（0.757343），最小遺傳距離（0.366335）。UPGMA系統(tǒng)樹顯示，美白雜交群體（AB）和白美雜交群體（BA）親緣關(guān)系最近，與白斑紅點鮭純繁群體（BB）聚為一類，達到改良目的，為分子標記輔助選育奠定基礎(chǔ)。

美洲紅點鮭；白斑紅點鮭；微衛(wèi)星標記

網(wǎng)絡(luò)出版時間2016-7-21 14:08:58［URL］http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160721.1408.002.html

谷偉,郭媛,戶國,等.美洲紅點鮭、白斑紅點鮭及雜交后代遺傳分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2016,47(7):48-55.

Gu Wei,Guo Yuan,Hu Guo,et al.Genetic diversity ofSalvelinus fominalis,S.leucomaenisand their hybrid offsprings[J]. Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(7):48-55.(in Chinese with English abstract)

紅點鮭主要分布在加拿大、瑞士、美國、新西蘭、奧地利、芬蘭、挪威、日本等地，中國分布較少，主要是花羔紅點鮭、美國移入美洲紅點鮭（Salvelinus fominalis）和日本引進白斑紅點鮭（Salvelinus leucomaenis）［1-3］。美洲紅點鮭生長快、肉質(zhì)鮮美，但易患癤瘡病，繁殖期死亡率高，而白斑紅點鮭抗病力較強［4-5］。雜交已成為提高產(chǎn)量和品質(zhì)主要措施，王新成研究牙鲆和石鰈之間雜交，后代成活率和生長速度均顯著高于牙鲆和石鰈，雜種優(yōu)勢顯著［6］。區(qū)又君通過平鯛和黑鯛雜交成功育出幼苗［7］。徐革鋒對哲羅和細鱗鮭雜交，正交組苗種生長速度高于雙親［8］。為充分利用紅點鮭不同品種生長特點，獲得抗病強、生長快速養(yǎng)殖新品種，本研究前期開展兩品種間雜交工作，正交組苗種生長指標高［9-10］。

生長、抗逆等屬數(shù)量性狀，由微效多基因控制。尋找與生長性狀相關(guān)標記，了解群體間遺傳多態(tài)性遺傳改良。微衛(wèi)星DNA具有等位基因數(shù)目多、重復(fù)性好、共顯性等特點，已廣泛應(yīng)用于不同群體劃分、親緣關(guān)系鑒定、基因定位、種群遺傳多樣性分析等方面［11-13］。國外利用分子標記技術(shù)較早，相繼開展虹鱒［14］、白斑紅點鮭、美洲紅點鮭［15-17］遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)等研究；國內(nèi)黃權(quán)和馬波等［18-19］對花羔紅點鮭遺傳多樣性作RAPD和微衛(wèi)星分析，發(fā)現(xiàn)其遺傳多樣性水平較高，選育潛力良好。楊建寶等利用15個微衛(wèi)星標記對引進美洲紅點鮭遺傳作多樣性分析，認為美洲紅點鮭選育潛力較高，是理想育種材料，但尚未進行種間雜交相關(guān)研究。本研究利用雜交優(yōu)勢，針對不同品種間性狀特點，通過雜交篩選出抗逆性強、生長快速優(yōu)勢組合，為養(yǎng)殖生產(chǎn)提供優(yōu)良養(yǎng)殖品種，通過微衛(wèi)星標記技術(shù)分析美洲紅點鮭和白斑紅點鮭及其雜交子代遺傳多樣性，為開展雜交選育提供理論支持。

1　材料與方法

1.1材料

美洲紅點鮭和白斑紅點鮭取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所渤海冷水性魚類實驗站。其中，美洲紅點鮭源自美國引進發(fā)眼卵，多年自群繁育形成養(yǎng)殖群體；為獲得可以產(chǎn)生屬間種間雜種優(yōu)勢優(yōu)良種質(zhì)資源，黑龍江水產(chǎn)研究所于1996年首次從日本引進白斑紅點鮭發(fā)眼卵，現(xiàn)已建成擁有親魚、后備親魚2萬余尾苗種供應(yīng)擴繁基地，本試驗所用白斑紅點鮭源于該群體。隨機挑選健壯、發(fā)育良好36月齡魚為試驗對象。

1.2試驗設(shè)計

采用2×2完全雙列雜交法［21］，建立4個組合（見表1），每個組合10尾魚。所有試驗魚在同一池塘養(yǎng)殖，PIT標記每尾魚，試驗結(jié)束時用0.5 mL·L-1苯氧乙醇水溶液將魚麻醉，每個組合剪取30尾鰭條樣本儲存于75%酒精溶液中用于遺傳多樣性分析。

1.3基因組DNA提取

為開展雜交群體與親本群體遺傳多樣性分析，采用Invitrogen公司Genomic DNA Mini Kit，進行DNA抽提試驗。具體方法如下：加Genomic Digestion Buffer 180 μL，Proteinase K 20 μL，白斑紅點鮭、美洲紅點鮭自交及其雜交子代鰭條樣品分別取100 mg剪碎，為使白斑紅點鮭和美洲紅點鮭及其雜交子代細胞充分裂解，用滅菌剪刀將其剪碎，置于55℃恒溫水浴鍋中消化4 h至細胞完全裂解。在水浴過程中，每隔一段時間顛倒混勻一次，促進細胞裂解充分；12 000 r·min-1離心3 min（室溫），吸取上清液到新離心管中；加入20 μL RNase A，顛倒混勻，室溫放置2 min；加Genomic Lysis/Binding Buffer 200 μL，顛倒混勻；加入無水乙醇200 μL，顛倒混勻；將溶解產(chǎn)物（約600 μL）用移液槍將液體全部轉(zhuǎn)移到吸附柱中，10 000 r·min-1離心1 min，移除收集管，置于干凈離心管中；加500 μL Wash Buffer 1，10 000 r·min-1離心1 min（室溫），將吸附柱置于干凈1.5 mL離心管中，加入500 μL Wash Buffer 2，12 000 r·min-1離心3 min（室溫）；將吸附柱置于干凈1.5 mL離心管中，加入50 μL Elustion Buffer，12 000 r·min-1離心2 min，即得到樣品基因組DNA原液，貯存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4微衛(wèi)星引物及PCR擴增

微衛(wèi)星引物參照文獻［17］和［22］，選取長度在18～25 bp，擴增率大于80%引物，其中美洲紅點鮭8個，白斑紅點鮭5個，對美洲紅點鮭和白斑紅點鮭及其雜交子代基因組DNA引物篩選。挑選其中7個多態(tài)性較好微衛(wèi)星位點分別對白斑紅點鮭和美洲紅點鮭及其雜交子代120尾（每組30尾）基因組DNA擴增，引物退火溫度及序列見表2，由Invitrogen公司合成。

采用Fermentas Taq polymerase進行PCR試驗，本試驗PCR反應(yīng)體系為15 μL，包括10×buffer 1.5 μL，Mg2+（25 mmol·L-1）1.2 μL，dNTPs（2 mmol·L-1）1.5 μL，上下游引物（10 mmol·L-1）各0.5 μL，模板DNA 1 μL，Taq DNA聚合酶（5 U·μL-1）0.18 μL，ddH2O 8.62 μL。擴增反應(yīng)均在BIO-RAD公司梯度PCR儀上完成，PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，退火溫度55～64℃20 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃延伸5 min。將反應(yīng)后PCR產(chǎn)物用10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合銀染法顯色檢測，掃描成像，分析個體基因型。

表1　2×2完全雙列雜交產(chǎn)生F1組合Table 1F1combinations generated by 2×2 full diallel cross

表2　美洲紅點鮭和白斑紅點鮭微衛(wèi)星位點引物序列魚擴增信息Table 2Primer sequence and amplification information in the present experiment of Salvelinus fominalis and Salvelinus leucomaenis

1.5數(shù)據(jù)處理

利用PopGene（Version 3.2）軟件分別統(tǒng)計觀測等位基因數(shù)（Observed number of alleles，Na）、有效等位基因（Effective number of alleles，Ne）、觀測雜合度（Observed heterozygosity，Ho）、期望雜合度（Expected heterozygosity，He）等遺傳變異參數(shù)。利用Gervus 3.0計算多態(tài)信息含量（Polymorphism information content，PIC）。

2　結(jié)果與分析

2.1微衛(wèi)星PCR擴增結(jié)果

試驗選取13個微衛(wèi)星標記對白斑紅點鮭和美洲紅點鮭擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增結(jié)果顯示其中7個微衛(wèi)星標記條帶清晰。通過篩選得到7個微衛(wèi)星位點，擴增后結(jié)果顯示有不同程度多態(tài)性，且條帶清晰，圖1為位點SfoC28（A）、SfoD75（B）、Sle6（C）和SnaMSU01（D）部分電泳結(jié)果。

2.2遺傳多樣性分析

遺傳變異參數(shù)見表3，經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)4個試驗組中AB組平均等位基因數(shù)、平均有效等位基因數(shù)最高分別為8.2875和5.5764，BB組最低分別為6.1429和4.3688；AB組和BA組觀察雜合度平均值和期望雜合度平均值較高，其中觀察雜合度平均值分別為0.7143和0.7095，期望雜合度平均值分別為0.8234和0.7879；BA組多態(tài)信息含量最高，平均值為0.6467；其中AA組和AB組中度多態(tài)標記（0.25≤PIC≤0.5）2個，高度多態(tài)標記（PIC≥0.5）5個，BB組中有1個無多態(tài)標記，高度多態(tài)標記6個，BA組均為高度多態(tài)標記。等位基因分布情況如圖2所示，其分布屬于典型“L”形狀。7個微衛(wèi)星位點FIS值如表4，群體間固定系數(shù)為0.0266。結(jié)果表明，本研究4個試驗組基本為高度多態(tài)性水平。

圖1　位點SfoC28（A）、SfoD75（B）、Sle6（C）和SnaMSU01（D）部分擴增結(jié)果Fig.1Amplified result of SfoC28，SfoD75，Sle6 and SnaMSU01 loci

圖2　美洲紅點鮭和白斑紅點鮭及其雜交子代等位基因頻率分布Fig.2Allele frequency distribution of Salvelinus fominalis，Salvelinus leucomaenis，and their hybrid offsprings

2.3群體間遺傳距離

利用phylip 3.69軟件計算群體間遺傳距離（見表5），AA組與AB之間遺傳距離最大（0.757343），AB組與BA組之間遺傳距離最小（0.366335）。

根據(jù)遺傳距離作UPGMA聚類分析（見圖3），由圖3可知，4個試驗組聚為2支，其中AB組與BA組先聚為一類，然后同BB組聚為一大類，AA組自成一類。

表3　美洲紅點鮭和白斑紅點鮭及其雜交子代7個微衛(wèi)星遺傳標記位點統(tǒng)計信息Table 3Statistical information of seven microsatellite loci of Salvelinus fominalis and Salvelinus leucomaenis and their hybrid offsprings

圖3　美洲紅點鮭和白斑紅點鮭及其雜交子代群體UPGMA聚類結(jié)果Fig.3Population UPGMA cluster of Salvelinus fominalis，Salvelinus leucomaenis，and their hybrid offsprings

表4　7個微衛(wèi)星遺傳標記位點固定系數(shù)Table 4FIS of seven microsatellite loci

表5　美洲紅點鮭和白斑紅點鮭及其雜交子代間遺傳距離Table 5Genetic distance of Salvelinus fominalis，Salvelinus leucomaenis，and their hybrid offsprings

3　討論

3.1美洲紅點鮭和白斑紅點鮭及其雜交子代遺傳多樣性分析

生物多樣性中遺傳多樣性是重要組成部分，每一個物種都具有獨特基因型和遺傳形式，基因遺傳多樣性代表物種多樣性［23］。王炳謙等用10對SSR引物分析5個虹鱒（Oncorhynchus mykiss）品系平均雜合度為0.8163，通過與配合力結(jié)合作雜交優(yōu)勢預(yù)測，獲得相似結(jié)果［24］；張玉勇等用13個微衛(wèi)星分子標記對虹鱒和山女鱒（Oncorhynchusmasou masou）雜交親本與雜交子代作分子遺傳機制研究，認為虹鱒和山女鱒雜交子代遺傳符合孟德爾遺傳規(guī)律，屬兩性融合生殖，是真正意義雜交種［25］。楊建寶等利用15個微衛(wèi)星標記進行美洲紅點鮭群體遺傳多樣性分析，結(jié)果表明平均期望雜合度為0.664，多態(tài)信息含量在0.360～0.719，平均多態(tài)信息含量為0.578，認為引進美洲紅點鮭遺傳多態(tài)性水平高，選育潛力巨大［20］。以上研究與本研究結(jié)果中AA組相近，但并未深入研究遺傳改良方法。

本研究選擇7個微衛(wèi)星位點用于美洲紅點鮭和白斑紅點鮭及其雜交子代遺傳多樣性分析，其中AB組平均等位基因數(shù)、平均有效等位基因數(shù)最高分別為8.2875和5.5764，AB組和BA組觀察雜合度和期望雜合度均高于AA組和BB組。雜交子代平均有效等位基因數(shù)（Na，Ne）和雜合度（Ho，He）均明顯高于親本，說明雜交群體基因雜合性增加明顯?；螂s合性對于機體抗逆性、繁殖性能和生長速度提升具有重要意義，美洲紅點鮭與白斑紅點鮭種間雜交子代雜種優(yōu)勢明顯。本試驗中有效等位基因數(shù)低于觀察等位基因數(shù)，表明等位基因在4組群體中分布不均勻。推測由于美洲紅點鮭和白斑紅點鮭長期處于小群體自繁導(dǎo)致，可增加檢測基因位點數(shù)［26］。群體內(nèi)FIS值說明基因分布平衡狀態(tài)，F(xiàn)IS=0時為平衡狀態(tài)，F(xiàn)IS＞0時則表明雜合子過少，F(xiàn)IS＜0時說明雜合子過剩［27］。本研究FIS平均值為0.0266，表明雜合子缺失，推測這種現(xiàn)象與交配父母本有一定親緣關(guān)系。

等位基因頻率分布可檢驗物種是否經(jīng)歷瓶頸效應(yīng)。經(jīng)歷瓶頸效應(yīng)會使物種等位基因流失、遺傳多樣性降低，導(dǎo)致物種衰退。在等位基因頻率分布圖中，成典型“L”形時，群體為非瓶頸效應(yīng)［28］。本研究中4個試驗組等位基因頻率分布在0.0～0.1之間比例大于0.1～0.2之間，屬于典型“L”圖形，證明美洲紅點鮭和白斑紅點鮭及其雜交子代未經(jīng)歷瓶頸效應(yīng)。

PIC能夠反映遺傳多樣性水平，根據(jù)Bostein等提出，當(dāng)PIC≥0.5時為高度多態(tài)，0.25≤PIC≤0.5時為中度多態(tài)［29］。本研究中高度多態(tài)達到5個，中度多態(tài)為2個，其中BA組多態(tài)信息含量最高，平均值為0.6467。說明在4個組合中利用7對微衛(wèi)星引物獲得多態(tài)信息含量比較豐富，美洲紅點鮭和白斑紅點鮭及其雜交子代遺傳多樣性分析有效性和可靠性較高。

通過遺傳多樣性分析4個試驗組多態(tài)信息含量較豐富，說明美洲紅點鮭和白斑紅點鮭及其雜交子代具有較為豐富遺傳多樣性，可利用分子標記輔助育種方法得到優(yōu)質(zhì)品系，為今后生產(chǎn)和選育工作提供理論依據(jù)。

3.2美洲紅點鮭和白斑紅點鮭雜交子代遺傳偏向性分析

雜交在魚類育種工作中對增強子代生存力，豐富遺傳結(jié)構(gòu)，獲得雜種優(yōu)勢有重要作用［30］。雜交子代由于兼具雙親優(yōu)點，因此在表現(xiàn)型方面，子代在抗病能力、生長速度、體表及存活率等方面均表現(xiàn)雜種優(yōu)勢［23］。前期研究結(jié)果表明，BA組合受精率達84.1%，比父本AA組合66.1%高18%，雜種優(yōu)勢較明顯，對于改善美洲紅點鮭受精率低、繁殖死亡率高效果顯著［9］；而生長速度正交子代AB組體長和體質(zhì)量平均值均高于親本，成活率比反交子代BA組高，與本試驗結(jié)果一致。本試驗屬于種間層次遠緣雜交，后代在遺傳上表現(xiàn)為較明顯變異和重組，根據(jù)群體間遺傳距離可知AA組與其他3組關(guān)系較遠，AB組、BA組與BB組同屬一支，其中AA組與AB組遺傳距離最大。顯示雜交后代更偏向于白斑紅點鮭，白斑紅點鮭對雜交子代遺傳貢獻更大。

目前魚類雜交試驗中雜交后代與親本遺傳距離不對等現(xiàn)象較多，張玉勇通過對虹鱒和山女鱒雜交子代研究顯示，在遺傳上更偏向父本山女鱒［25］；李傳陽采用篩選12個種間特異性微衛(wèi)星標記分析斑鱖、鱖魚以及斑鱖（Siniperca scherzeri）♀×鱖魚（S. chuatsi）♂雜交一代、雜交二代群體遺傳特征，得出雜交一代遺傳表現(xiàn)上偏向鱖魚，與本試驗結(jié)果相似［32］。劉穎等對大黃魚（Pseudosiaena crocea）♀×黃姑魚（Nibea albiflora）♂雜交子代AFLP分析發(fā)現(xiàn)其遺傳表現(xiàn)與母本大黃魚較接近［33］；王金龍等研究遠緣雜交雙親與子代遺傳結(jié)構(gòu)關(guān)系，應(yīng)用RAPD方法進行奧利亞羅非魚（Oreochromis aurea）（♀）與鱖（Siniperca chuatsi）（♂）雜交子代組合與父母本遺傳關(guān)系研究，認為其雜交子代中導(dǎo)入父本遺傳物質(zhì)，增加子代組合多態(tài)性，并且與母本回交及自交，雜交子代遺傳結(jié)構(gòu)向母本靠近［34］。蔡磊等認為親本遺傳物質(zhì)對后代貢獻率不一致因兩親本基因純合度不同，基因純度高親本基因型在后代中被檢測幾率增加［35］，但王金龍認為雜交遺傳過程中重組和發(fā)育染色體選擇性丟失導(dǎo)致雙親遺傳給子代比例失衡［34］。

3.3美洲紅點鮭和白斑紅點鮭雜交親和性分析

關(guān)于硬骨魚類遠緣雜交報道中，大部分雜交親和性表現(xiàn)較低，具有應(yīng)用價值雜交組合不足1%成功率［36］。Turelli等認為雜交親和性低是生殖隔離導(dǎo)致，當(dāng)兩個品種基因相互融合出現(xiàn)相互抑制，會阻礙其雜交親和性［37］。魚類遠緣雜交雜種胚胎多發(fā)育不正常，孵化率極低［30］。徐冬冬等對8種鲆鰈魚雜交也發(fā)現(xiàn)多對通過人工雜交獲得胚胎能受精并發(fā)育，但發(fā)育到一定階段后胚胎或孵出仔魚死亡［38］。本試驗表明AA組與AB之間遺傳距離最大（0.757343），AB組與BA組之間遺傳距離最小（0.366335）。說明雜交組遺傳白斑紅點鮭生長速度快、體型大、抗逆性強優(yōu)勢性狀，而從體表形態(tài)上遺傳美洲紅點鮭艷麗體色特征彌補白斑紅點鮭不足。

本研究中正交和反交，其子代均能正常發(fā)育，父母本雜交具有較高親和力、雜交第一代攝餌良好、生長率高、抗病力強、成活率高。分析結(jié)果與生長曲線擬合結(jié)果一致：AB組具有明顯生長優(yōu)勢［10］。后續(xù)研究將通過回交，強化其生長性能和抗逆性能，克服性狀分離，增強雜交優(yōu)勢。

4　結(jié)論

本試驗雜交后代多樣性明顯高于親本，繼承雙親優(yōu)良性狀。在生產(chǎn)中，紅點鮭種間雜交育種可獲得具有較強雜種優(yōu)勢雜交組合。

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Genetic diversity ofSalvelinus fominalis，S.leucomaenisand their hybrid offsprings

GU Wei,GUO Yuan,HU Guo,SUN Peng,BAI Qingli,WANG Bingqian
(Institute of Heilongjiang River Fisheries Research,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China)

We established diallel crosses betweenSalvelinus fominalis(AA)andS.leucomaenis (BB),along with the self-breeding offsprings,and studied the genetic diversity of four populations.In this study,the genetic structure and diversity of these populations were studied with seven polymorphic microsatellite loci.The average number of effective alleles was from 4.3688 to 5.5764.The polymorphic informationcontent(PIC)ofJapanesestrainrangedfrom0.5079to0.6467.Theobserved heterozygosity varied from 0.6857 to 0.7143,and the expected heterozygosity was 0.6290-0.8234.The results indicated that the heterozygosity of hybrid offsrpings were higher than parents,showed a high level of genetic variability in the offspring of the crosses betweenSalvelinus fominalisandS. leucomaenis.The maximum Nei's genetic distance were between AA and AB among the four populations was 0.757343.At the same time,the minimum Nei's genetic distance between AA and AB was 0.366335.Results of UPGMA(unweighted pair-group method with arithmetic means)showed that AB and BA strains had the closest relationship,meanwhile,clustered together with BB.This study could provide the theory basis for the artificial hybrid breeding and protection of sustainable germplasmresources forSalvelinusaquaculture.

Salvelinus fominalis;S.leucomaenis;microsatellite

S917

A

1005-9369（2016）07-0048-08

2015-12-10

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（HSY201404）

谷偉（1978-），男，助理研究員，碩士，研究方向為鮭鱒魚育種。E-mail:guweineau@126.com

王炳謙，研究員，研究方向為鮭鱒魚類養(yǎng)殖及育種。E-mail:wbqfish@yahoo.com.cn