鄒德堂，姜思達(dá)，趙宏偉，郭麗穎，孫健，劉化龍，辛威

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱　150030）

廣譜抗性基因Pi9在黑龍江省水稻品種中的分布

鄒德堂，姜思達(dá)，趙宏偉，郭麗穎，孫健，劉化龍，辛威

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱150030）

2014年利用顯性標(biāo)記pB8對(duì)黑龍江省96份水稻主栽品種篩選Pi9基因，對(duì)供試材料作苗期和分蘗期抗病鑒定，明確Pi9基因在黑龍江省水稻品種中分布情況及應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果表明，供試材料中，有早熟青森、墾粳1等44個(gè)品種含有Pi9基因，苗期和分蘗期平均發(fā)病級(jí)別均為2.4級(jí)；青森5號(hào)、長(zhǎng)白9號(hào)等52個(gè)品種不含Pi9基因，苗期和分蘗期平均發(fā)病級(jí)別分別為5.1和5.4級(jí)。研究結(jié)果可為黑龍江省水稻品種改良以及抗病資源合理利用奠定基礎(chǔ)。

水稻；分子標(biāo)記；輔助選擇；稻瘟??；Pi9基因

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間2016-7-20 10:40:03［URL］http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160720.1040.004.html

鄒德堂,姜思達(dá),趙宏偉,等.廣譜抗性基因Pi9在黑龍江省水稻品種中的分布[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,47(7):1-8.

Zou Detang,Jiang Sida,Zhao Hongwei,et al.Distribution of broad-spectrum resistance gene-Pi9 in the rice cultivars of Heilongjiang Province[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(7):1-8.(in Chinese with English abstract)

水稻在世界糧食作物中有重要作用［1］。近年來，水稻育種成效顯著［2］。傳統(tǒng)水稻育種方式易受外界因素干擾，致使優(yōu)良基因流失且效率較低。隨著分子生物學(xué)發(fā)展，分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)日漸成熟［3］。分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)利用與目標(biāo)基因緊密連鎖的標(biāo)記在DNA水平上篩選，不受等位基因顯隱性干擾，大幅提高育種效率，在提高水稻抗性、品質(zhì)等方面均起重要作用［4］，為現(xiàn)代育種開辟新途徑。目前，水稻等多個(gè)作物測(cè)序工作已完成，相關(guān)數(shù)據(jù)庫建立，分子標(biāo)記數(shù)目和類型不斷增加，分子標(biāo)記輔助選擇育種廣泛應(yīng)用［5］。

稻瘟病對(duì)全球水稻構(gòu)成嚴(yán)重威脅［6］，造成水稻減產(chǎn)高達(dá)15%～30%，嚴(yán)重制約水稻高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)。稻瘟病生理小種繁多、變異速度快等特點(diǎn)增加稻瘟病防治困難。發(fā)掘抗病基因，培育抗病品種是防治稻瘟病經(jīng)濟(jì)有效方式。充分利用抗病基因，對(duì)栽培品種合理布局，發(fā)揮水稻自身優(yōu)勢(shì)解決病害問題起到重要作用［7］。

Pi9基因在小粒野生稻中發(fā)現(xiàn)并命名，被定位于水稻第6條染色體短臂上［8］，是已克隆的抗稻瘟病主效基因之一，該基因能抵御來自多個(gè)國家和地區(qū)多數(shù)稻瘟病生理小種侵染，不留過敏病斑。雷財(cái)林等研究認(rèn)為，Pi9基因在黑龍江省對(duì)稻瘟病菌株抗譜較廣［9］。本研究通過對(duì)黑龍江省主栽的96個(gè)水稻品種分子標(biāo)記輔助選擇，檢測(cè)Pi9基因在所選品種中分布情況。對(duì)所選品種在苗期和分蘗期作抗病性鑒定試驗(yàn)，將分子標(biāo)記輔助選擇結(jié)果與表型數(shù)據(jù)結(jié)合，明確Pi9基因在黑龍江省分布現(xiàn)狀及其在提高水稻抗病性方面價(jià)值，為黑龍江省水稻合理布局及抗稻瘟病品種選育提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為96份黑龍江省主栽粳稻品種，75-1-127單基因（Pi9）系作為陽性對(duì)照；麗江新團(tuán)黑谷為陰性對(duì)照。所有供試稻株均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所提供。

1.2PCR檢測(cè)

1.2.1DNA提取

采用CTAB法［10］提取供試材料DNA。

1.2.2供試引物

pB8引物序列見表1［11］。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.3PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)總體積為20 μL，其中DNA 3 μL（25 ng·μL-1），10×PCR緩沖液2 μL，25 mmol·L-1MgCl2溶液2 μL，10 mmol·L-1dNTP 0.2 μL，Taq酶0.3 μL，引物2 μL。加入ddH2O至20 μL。加入液體石蠟封蓋體系。

表1　引物序列與相關(guān)信息Table 1Primer sequences and related information

PCR擴(kuò)增經(jīng)94℃預(yù)變性6 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，共包含35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min［12］，擴(kuò)增產(chǎn)物于4℃條件下保存。所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，利用溴化乙錠染色后紫外燈下觀察［13］。

1.3瘟病抗性接種鑒定

1.3.1供試菌株

供試菌株為ZA5，ZA5對(duì)黑龍江省主栽品種具有較強(qiáng)致病率（63.89%）［14］，供試菌株由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所保存、提供。

1.3.2接種鑒定

苗期接菌鑒定于2014年在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室內(nèi)完成，采用秧盤種植，選取飽滿健康種子，每穴播種10粒，長(zhǎng)至3葉1心時(shí)利用ZA5菌株孢子懸浮液噴霧，使液滴均勻分布于葉片及莖稈。噴霧接菌后，塑料薄膜覆蓋保濕，遮光處理24 h后置于溫室中培養(yǎng)，控制溫度與濕度。于處理后7～10 d，發(fā)病情況穩(wěn)定后調(diào)查發(fā)病級(jí)別。根據(jù)病斑形狀、大小和數(shù)量，以國際水稻所葉瘟分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（見表2）［15］作為參照，調(diào)查水稻葉瘟發(fā)病級(jí)別，計(jì)算平均值。

分蘗期接菌鑒定于同年在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)基地試驗(yàn)田進(jìn)行，4月16日播種，5月20日移栽，田間隨機(jī)區(qū)組排列，每份材料種植1行，每行20株，株行距13.3 cm×30 cm，每穴1株，田間管理按常規(guī)進(jìn)行。分蘗盛期從每行中選取3株，每株3個(gè)分蘗，采用注射接菌方式，離頸基部20 cm處人工注射ZA5生理小種，接菌量以心葉有水滴溢出為止，每稻桿約0.5 mL。對(duì)已注射過稻桿作標(biāo)記。接種7～10 d后，按照國際水稻所葉瘟發(fā)病級(jí)別調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查，統(tǒng)計(jì)發(fā)病級(jí)別并計(jì)算平均值。

1.3.3稻瘟病抗病級(jí)別及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算

將所選群體按照是否攜帶Pi9基因標(biāo)準(zhǔn)分為兩部分，選取苗期和分蘗期兩個(gè)時(shí)期，分別計(jì)算兩部分平均發(fā)病級(jí)別，并統(tǒng)計(jì)發(fā)病區(qū)間。按照表2評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)兩部分品種各時(shí)期發(fā)病情況，得出兩部分品種從高抗到高感各級(jí)別品種數(shù)量。同時(shí)計(jì)算兩部分品種苗期和分蘗期抗病率。通過以上計(jì)算結(jié)果鑒定Pi9基因在黑龍江省主栽品種中的抗病性價(jià)值。

表2　國際水稻所葉瘟發(fā)病級(jí)別調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)Table 2Evaluation criterion of rice leaf blast from the International Rice Research Institute

2　結(jié)果與分析

2.1廣譜抗病基因Pi-9在黑龍江省主栽品種中分布情況

將選取的96份寒地粳稻品種以pB8為標(biāo)記PCR擴(kuò)增，以75-1-127為陽性對(duì)照，麗江新團(tuán)黑谷為陰性對(duì)照，攜帶Pi9基因的品種500 bp處擴(kuò)增出條帶，結(jié)果見表3。從表中可知，所選96個(gè)品種中有44個(gè)品種擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，如早熟青森、墾粳1等，說明這44個(gè)品種攜帶Pi9基因；其余52個(gè)品種未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，Pi9基因在所選品種中占有率達(dá)45.8%。圖1為所選試驗(yàn)材料擴(kuò)增結(jié)果。

2.2稻瘟病抗性鑒定

利用強(qiáng)致病力稻瘟病生理小種ZA5接種供試材料，結(jié)果見表3。由表3中結(jié)果經(jīng)計(jì)算可得，75-1-127苗期和分蘗期病害級(jí)別分別為1.7和2.5級(jí)，表現(xiàn)為抗病；感病對(duì)照麗江新團(tuán)黑谷苗期和分蘗期平均發(fā)病級(jí)別分別為8.1和9.0，均達(dá)到高感。

所選96份主栽品種中，對(duì)攜帶Pi9基因的供試材料抗病性結(jié)果分析可得，其苗期和分蘗期兩時(shí)期發(fā)病較低，葉瘟整體發(fā)病級(jí)別在0～5.3級(jí)和0～4.2級(jí)，平均發(fā)病級(jí)別均為2.4級(jí)，表現(xiàn)為抗病。相同時(shí)期不含Pi9基因供試材料葉瘟發(fā)病級(jí)別在0～8.6級(jí)和0～9.0級(jí)，平均發(fā)病級(jí)別分別為5.1和5.4級(jí)，表現(xiàn)為中感。對(duì)44個(gè)品種分別在苗期和分蘗期進(jìn)行抗病性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)鑒定，結(jié)果表明，苗期有高抗品種8個(gè)，抗病品種24個(gè)，中抗品種10個(gè)，中感品種2個(gè)；分蘗期有高抗品種3個(gè)，抗病品種34個(gè)，中抗品種7個(gè)。

對(duì)不含Pi9基因供試材料分析可得，其苗期和分蘗期兩個(gè)時(shí)期葉瘟發(fā)病級(jí)別在0～8.6級(jí)和0～9.0級(jí)，平均發(fā)病級(jí)別分別為5.1和5.4級(jí)，表現(xiàn)為中感。對(duì)這52個(gè)品種分別在苗期和分蘗期進(jìn)行抗病性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)鑒定，結(jié)果表明，苗期有高抗品種1個(gè)，中抗品種5個(gè)，抗病品種11個(gè)，中感品種11個(gè)，感病品種17個(gè)，高感品種7個(gè)；分蘗期有高抗品種3個(gè)，抗病品種9個(gè)，中抗品種4個(gè)，中感品種6個(gè)，感病品種20個(gè)，高感品種10個(gè)。

計(jì)算所選材料2014年抗病率［16］，攜帶Pi9基因的44個(gè)品種苗期抗病率（%）=42/44×100%= 95.45%，分蘗期抗病率（%）=52/52×100%=100%；不含Pi9基因的52個(gè)品種苗期抗病率（%）=6/52× 100%=11.54%，分蘗期抗病率（%）=16/52×100%= 30.77%，攜帶Pi9基因的品種抗病率明顯高于不含Pi9基因品種。

圖1　所有品種以pB8為引物擴(kuò)增結(jié)果Fig.1PCR amplifications of pB8 specific markers for all the cultivars

表3　黑龍江省主栽品種Pi9基因分布及抗病性表現(xiàn)Table 3Distribution of Pi9 gene and disease resistance of major cultivars from Heilongjiang Province

續(xù)表

注：√代表含有Pi9；×代表不含有Pi9；75-1-127為陽性對(duì)照；麗江新團(tuán)黑谷為陰性對(duì)照。Note:√indicates that the cultivars contain the gene of Pi9；×indicates that the cultivars do not contain the gene of Pi9；75-1-127 is control of positive；Lijiangxintuanheigu is control of negative.

3　討論

分子標(biāo)記輔助選擇在育種方面應(yīng)用廣泛［17］，劉華招等篩選2009年黑龍江省種植面積較廣的36份品種，最終篩選出4個(gè)含有Pib抗性基因和6個(gè)含有Pi-ta抗性基因品種［18］。李洪亮等將水稻品種BL6中攜帶的抗病基因Pi1和Pi2聚合到空育131中，利用已建立的顯性分子標(biāo)記RM144和AP22分別對(duì)Pi1和Pi2基因進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，大幅拓寬空育131品種抗譜［19］。

本研究分析Pi9基因在黑龍江省種質(zhì)資源分布情況，篩選出44份攜帶Pi9基因的種質(zhì)資源。為今后育種工作中優(yōu)良品種選育提供依據(jù)，親本選擇時(shí)，合理選擇攜帶Pi9基因品種，可提高配置的雜交后代抗病性。對(duì)不含Pi9基因，但具有較強(qiáng)抗病性的品種，如東農(nóng)426、松粳8號(hào)等深入研究，加大力度發(fā)掘、定位抗病基因，探索抗病機(jī)理。在所選材料中存在苗期和分蘗期抗病性均優(yōu)于陽性對(duì)照75-1-127的品種，比如龍聯(lián)1號(hào)，北稻5號(hào)等。此類品種可能攜帶除Pi9之外的抗稻瘟病基因，因此加強(qiáng)對(duì)此類品種抗病基因發(fā)掘與研究，對(duì)黑龍江省水稻抗病資源拓展有重要意義。

本研究可知，Pi9基因在黑龍江省水稻抗病育種中具有很高應(yīng)用價(jià)值，在黑龍江省乃至全國范圍內(nèi)加強(qiáng)對(duì)Pi9基因推廣和應(yīng)用意義重大。但有些不含Pi9基因的供試材料如東農(nóng)426、松粳8號(hào)等表現(xiàn)較強(qiáng)稻瘟病抗性，說明這些品種中可能含有其他抗性基因，有待進(jìn)一步發(fā)掘和利用。同時(shí)，試驗(yàn)材料中存在苗期和分蘗期抗病性均較強(qiáng)的品種，如龍慶稻1號(hào)、龍粳14號(hào)、東農(nóng)426等。加大以上品種開發(fā)力度，發(fā)掘其中抗病基因?qū)?huì)為黑龍江省水稻抗病育種帶來突破性進(jìn)展。

通過比較苗期和分蘗期稻瘟病抗性發(fā)現(xiàn)，供試材料中一部分苗期和分蘗期抗病水平不一致，如石狩白毛苗期發(fā)病為5.3級(jí)，表現(xiàn)為中感，而分蘗期表現(xiàn)高抗（0級(jí)）。梧農(nóng)71也有類似表現(xiàn)；東農(nóng)421苗期發(fā)病為0.9級(jí)，表現(xiàn)為高抗，而分蘗期表現(xiàn)高感（8.2級(jí)）。由此看出，水稻苗期和分蘗期稻瘟病抗性差異顯著，結(jié)果表明，相同抗病基因不同生育期表達(dá)差異顯著。從表3中可以看出，相同生育時(shí)期，含有Pi9基因的供試材料其稻瘟病抗性差異顯著，如苗期的龍盾106和龍粳香1號(hào)，平均抗病級(jí)別均相差2級(jí)，分別表現(xiàn)為高抗和抗性；分蘗期龍稻12號(hào)和墾粳1號(hào)，平均抗病級(jí)別均相差2.6級(jí)，分別表現(xiàn)為抗病和中感。結(jié)果表明，Pi9基因在不同遺傳背景中抗病效果不同。

所選材料中存在含有Pi9基因，是對(duì)稻瘟病抵抗能力較弱品種。說明雖然Pi9基因?qū)Φ疚敛【哂休^強(qiáng)抵抗能力，但外界環(huán)境等因素影響，稻瘟病生理小種繁多等特點(diǎn)會(huì)限制抗性基因作用［20］。Pi9基因抗譜廣，但不能對(duì)所有菌株產(chǎn)生抗病效果。楊婷婷等曾證明Pi9基因?qū)碜皂n國的ROR1和日本的KOH兩個(gè)菌株無抗性［21］。因此在水稻生產(chǎn)中，不能僅依賴單一抗病基因或優(yōu)勢(shì)，培養(yǎng)并選育具有綜合優(yōu)良性狀品種?？紤]多個(gè)基因綜合應(yīng)用，利用多個(gè)優(yōu)良基因互補(bǔ)作用拓寬抗譜，培育具有持久抗性品種。陳學(xué)偉等將Pid（t）1、Pi-b、Pi-ta2聚合到G46B品種中，使該品種抗病性得到有效改善［22］；陳圣等將X23、Pi9和Bt基因聚合到同一株系中，這三種基因分別對(duì)水稻白葉枯病、稻瘟病和水稻螟蟲具有很高抗性，聚合結(jié)果顯示，所得株系能同時(shí)抵抗這三種逆境［23］；陽海寧等將抗水稻白葉枯病基因Xa23和抗稻飛虱基因Bph3導(dǎo)入優(yōu)良雜交品種保持系中，獲得雙基因聚合品種明顯改善兩種病害抗性［24］。

水稻基因組研究迅速發(fā)展，在現(xiàn)有基礎(chǔ)上加強(qiáng)對(duì)新抗源發(fā)掘，有針對(duì)性將優(yōu)良基因?qū)?、聚合到各地區(qū)主栽品種中，可為水稻育種開辟新途徑。

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Distribution of broad-spectrum resistance gene-Pi9 in the rice cultivars of Heilongjiang Province

ZOU Detang,JIANG Sida,ZHAO Hongwei,GUO Liying,SUN Jian,LIU Hualong,XIN wei
(School of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030, China)

The dominant molecular pB8 was used to identify the presence ofPi9 gene in 96 rice leading cultivars of Heilongjiang Province.Meanwhile,assays for resistance identification were performed among rice seedling stage and tillering stage.In order to realize the distribution and application value ofPi9 gene in the rice cultivars of Heilongjiang Province.The results showed that the Pi9 gene was found in 44 rice cultivars among the materials in this study,such as Zaoshuqingsen, Kendao1,whose average disease degrees of rice blast at seedling stage and tillering stage were both 2.4;the other 55 rice cultivars such as Qingsen5,Changbai9,whose average disease degrees of rice blast at seedling stage and tillering stage were 5.1 and 5.4,did not contain thePi9 gene.These results lay a foundation for the improvement of rice cultivars and rational utilization of rice disease resistance resources in Heilongjiang Province.

rice;molecular markers;marker-assisted seletion;rice blast;Pi9 gene

S511

A

1005-9369（2016）07-0001-08

2016-01-04

黑龍江省重大科技招標(biāo)項(xiàng)目（GA14B102）；“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃課題（2013BAD20B04）；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校級(jí)創(chuàng)新課題（yjscx14049）

鄒德堂（1965-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樗具z傳育種。E-mail:zoudt@163.com