楊秀芹，萬(wàn)洪宇，王金奎，韓麗鑫，杜　欣，禚建樹(shù)（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030）

豬miR-101表達(dá)特性分析

楊秀芹，萬(wàn)洪宇，王金奎，韓麗鑫，杜欣，禚建樹(shù)
（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030）

miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)20~25 nt內(nèi)源性、單鏈、非編碼小分子RNA，通過(guò)調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)參與機(jī)體各項(xiàng)生命活動(dòng)。人類(lèi)miR-101是重要疾病相關(guān)miRNA，參與維持機(jī)體健康、抵御疾病。目前有關(guān)豬miR-101研究尚不多見(jiàn)，為確定其在豬抗病毒免疫反應(yīng)中作用，研究利用stem-loop RT-PCR方法構(gòu)建豬m iR-101組織表達(dá)譜和poly(I:C)誘導(dǎo)表達(dá)譜。結(jié)果表明，豬miR-101在肝臟組織中表達(dá)量最高，高濃度poly（I:C）能有效抑制豬miR-101轉(zhuǎn)錄表達(dá)。為深入闡明m iR-101在豬抗病毒免疫反應(yīng)中作用奠定基礎(chǔ)，為培育高抗病性豬品種（系）提供參考。

豬；miR-101；poly（I:C）；stem loop RT-PCR；表達(dá)

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間2016-6-17 15:21:59[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160617.1521.014.htm l

楊秀芹,萬(wàn)洪宇,王金奎,等.豬miR-101表達(dá)特性分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,47(6):74-80.

Yang Xiuqin,Wan Hongyu,Wang Jinkui,et al.Characterization of expression profile of miR-101 in pig[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(6):74-80.(in Chinese with English abstract)

miRNA（microRNA）是一類(lèi)內(nèi)源性、單鏈、非編碼小分子RNA，長(zhǎng)20~25 nt，3'端有1~2個(gè)堿基長(zhǎng)度變化。成熟miRNA在5'端有一個(gè)磷酸基團(tuán)，3'端為羥基，因此區(qū)別于大多數(shù)寡核苷酸和功能RNA降解片段。目前，植物、動(dòng)物和真菌中均發(fā)現(xiàn)成熟miRNA。細(xì)胞核內(nèi)miRNA基因首先在RNA聚合酶Ⅱ作用下，轉(zhuǎn)錄為帶帽子結(jié)構(gòu)和多聚腺苷酸尾巴初始轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA）；再經(jīng)含有Drosha酶微處理器（Microprocessor）加工，產(chǎn)生長(zhǎng)約70 nt、帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)前體miRNA（pre-miRNA）；pre-miR?NA與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5結(jié)合，運(yùn)送至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；細(xì)胞質(zhì)內(nèi)經(jīng)具有RNA內(nèi)切酶Ⅲ活性Dicer酶加工，形成復(fù)合結(jié)構(gòu)雙鏈miRNA；最終在解鏈酶作用下降解為成熟單鏈miRNA[1]。

成熟miRNA在RNA誘導(dǎo)復(fù)合物（RISC）作用下與靶基因3'UTR區(qū)互補(bǔ)配對(duì)，降解mRNA或者抑制其翻譯，負(fù)性調(diào)控靶基因表達(dá)。王寧等研究表明，miRNA作用方式取決于其與靶基因3'UTR區(qū)匹配程度，若近乎完全匹配則抑制靶基因轉(zhuǎn)錄，若匹配較差則在翻譯水平上抑制蛋白表達(dá)[1]。miRNAs只在特定組織和發(fā)育階段表達(dá)，參與調(diào)控各項(xiàng)生命活動(dòng)，在細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡、血細(xì)胞分化、胰島素分泌、大腦形態(tài)形成、心臟發(fā)生、胚胎后期發(fā)育等過(guò)程發(fā)揮重要作用。因此，miRNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控已成為真核生物基因表達(dá)調(diào)控重要組成[2-4]。此外，大量研究證實(shí)，miRNA與疾病發(fā)生、發(fā)展存在密切關(guān)系。

miR-101是一類(lèi)重要疾病相關(guān)miRNA。Thu等研究表明，在肝癌、膽管癌、前列腺癌、大腸癌、腎癌等多種惡性腫瘤組織中miR-101表達(dá)量均下降[5]。人類(lèi)miR-101可通過(guò)抑制靶基因表達(dá)、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡等方式發(fā)揮抑癌作用[6-8]。此外，miR-101與病毒入侵及疾病發(fā)生密切相關(guān)，在乙型肝炎病毒相關(guān)的肝硬化和肝細(xì)胞癌中，其表達(dá)量發(fā)生顯著變化；人類(lèi)miR-101-2基因多態(tài)性對(duì)機(jī)體清除乙肝病毒有重要影響[9-10]。

鑒于miR-101在人疾病中的重要作用，推測(cè)其在豬抗病育種中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。因此，本研究以豬miR-101作抗病候選miRNA，利用stemloop RT-PCR方法構(gòu)建其組織表達(dá)譜和poly（I:C）誘導(dǎo)表達(dá)譜，為深入闡明miR-101在豬抗病毒免疫反應(yīng)中作用奠定基礎(chǔ)，為培育高抗病性豬品種（系）提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物

3頭1月齡民豬，采自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所科研基地。屠宰后立即取心、肝、脾、肺、腎、胃、舌、膀胱、小腸、大腸、脂肪、背肌、腿肌、胰臟和皮膚組織，于液氮中速凍后，-80℃冰箱保存。

1.1.2試驗(yàn)試劑

PrimerScriptTMRT reagent Kit、SYBR Premix Ex Taq、r Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker DL 2000、pMD18-TVector、限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自寶生物（大連）有限公司；Trizol、poly（I:C）、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Invitrogen生命技術(shù)有限公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京博邁德基因技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖、蛋白胨、酵母提取物等購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶、溴化乙錠、氨芐青霉素購(gòu)自德國(guó)SIGMA公司；細(xì)胞培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液等購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；其他常規(guī)試劑由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物遺傳實(shí)驗(yàn)室保存；引物序列合成及相關(guān)測(cè)序服務(wù)均由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.1.3試驗(yàn)儀器

TP600型梯度PCR儀，購(gòu)自日本TAKARA寶生物工程有限公司（大連）；常規(guī)PCR擴(kuò)增儀9700型，購(gòu)自美國(guó)ABI應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；ABIPRISM 7500 Fast Real Time PCR儀，購(gòu)自美國(guó)AB SCIEX公司；瓊脂糖水平電泳儀、電泳槽和凝膠儀，購(gòu)自北京市六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自美國(guó)UVP思博明科學(xué)器材公司；細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿等一次性耗材，購(gòu)自比利時(shí)Orange公司；其他試驗(yàn)所需常規(guī)儀器由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物遺傳實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2引物設(shè)計(jì)與合成

miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中（http://www.mirbase.org/）下載豬miR-101成熟序列，根據(jù)stem-loop PCR引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)1條反轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物（RT）和1對(duì)PCR擴(kuò)增引物（F/R），用于豬miR-101定量表達(dá)研究。

以U6基因?yàn)镽eal time PCR反應(yīng)內(nèi)參，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)提供U6 snRNA序列（GenBank No. 100513409）設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物。各引物均利用Primer Premier5.0軟件自行設(shè)計(jì)，由北京華大基因科技股份有限公司合成。

引物序列見(jiàn)表1。

表1　引物序列Tab le 1 Primer sequenes

1.3細(xì)胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)

1.3.1細(xì)胞復(fù)蘇

取出液氮中保存PK15細(xì)胞，于37℃水浴中迅速融化。將細(xì)胞懸液加入37℃預(yù)熱完全培養(yǎng)基中，緩慢搖勻。1 000 r·min-1離心5min，棄上清，加入適量完全培養(yǎng)基，充分混勻后，將細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2傳代培養(yǎng)

待細(xì)胞長(zhǎng)至80%~90%匯合時(shí)，倒掉培養(yǎng)基，無(wú)菌PBS沖洗細(xì)胞3次。加入適量0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA，37℃消化細(xì)胞1~2min，顯微鏡下觀察，待大部分細(xì)胞變圓變亮后，加入適量含有胎牛血清完全培養(yǎng)基終止消化，并輕柔吹打成單個(gè)懸浮細(xì)胞。將懸液移入新離心管，轉(zhuǎn)速1 000 r· min-1，離心5min。棄上清，加入適量37℃預(yù)熱完全培養(yǎng)基充分混勻細(xì)胞。按下一步試驗(yàn)需要分裝到培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3誘導(dǎo)

將細(xì)胞傳代2~3次，達(dá)適宜刺激條件后，作poly（I:C）誘導(dǎo)。poly（I:C）添加濃度分別為0、1、5和10μg·mL-1，誘導(dǎo)時(shí)間12 h，以未刺激組作空白對(duì)照，進(jìn)行3次生物學(xué)平行試驗(yàn)。

1.4RNA提取

按照Invitrogen公司Trizol說(shuō)明書(shū)提取各組織總RNA與不同誘導(dǎo)濃度細(xì)胞總RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度、純度，符合要求總RNA稀釋至1μg·μL-1，-80℃保存。

1.5反轉(zhuǎn)錄

利用Takara公司Prime Script RT reagent Kit說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系為20μL，含有5×Prime?Script Buffer 4μL，Prime Script RT Enzyme Mix I 1μL，總RNA 1μL，反轉(zhuǎn)錄引物（U6基因R引物或miR-101的RT引物）10 pmol·L-1，加RNase Free ddH2O至20μL。反應(yīng)條件為37℃，15min；85℃，5 s。

1.6引物特異性檢測(cè)

引物合成后，首先利用常規(guī)PCR檢測(cè)引物特異性，具體方法如下：20μL反應(yīng)體系內(nèi)含10×Buffer 2μL，dNTPs 0.8μL，上下游引物各0.4μL（10 μmol·L-1），cDNA 1μL，r Taq DNA聚合酶5 U，雙蒸水適量。反應(yīng)條件為95℃5 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃20 s，30個(gè)循環(huán)；72℃7min。反應(yīng)結(jié)束后2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物特異性。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，克隆、測(cè)序，驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物特異性。

1.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR

利用SYBR Premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行Real time PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系如下：SYBRGreen PCRMas?terMix 5μL，cDNA 1μL；上、下游引物各0.2μL（10μmol·L-1），DyeⅡ（50X）0.2μL，加雙蒸水至10μL。反應(yīng)條件為：95℃30 s；95℃5 s，60℃34 s，40個(gè)循環(huán)；95℃15 s，60℃1 min。ABI PRISM 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)。以U6基因作內(nèi)參，利用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-101各組織中相對(duì)表達(dá)量及poly（I:C）誘導(dǎo)表達(dá)量。Real time PCR反應(yīng)結(jié)束后，收集各EP管內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)物，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物有無(wú)雜帶。

2　結(jié)果與分析

2.1總RNA質(zhì)量和濃度檢測(cè)

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)各組織和細(xì)胞總RNA質(zhì)量。結(jié)果顯示18S與28S條帶清晰、明亮，且28S條帶亮度是18S條帶兩倍以上（見(jiàn)圖1和2），說(shuō)明總RNA質(zhì)量較好，無(wú)降解。

圖1　組織總RNA電泳Fig.1 Electrophoresis pattern of total RNA extracted from tissues

圖2　細(xì)胞總RNA電泳Fig.2 Electrophoresis pattern of total RNA extracted from cell

將各組織和細(xì)胞總RNA適當(dāng)稀釋后，紫外分光光度計(jì)測(cè)定260和280 nm吸光值，定量總RNA濃度及純度，發(fā)現(xiàn)OD260/OD280比值在1.8~2.0，且濃度>1μg·μL-1。表明總RNA濃度及純度較好。因此，提取的總RNA可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2引物特異性分析

常規(guī)PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，在預(yù)期位置處得到特異性條帶且無(wú)雜帶和引物二聚體（見(jiàn)圖3）。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，與pMD 18-T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒雙酶切鑒定后（見(jiàn)圖4）測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示成功獲得豬miR-101成熟序列，與miRBase提供序列一致（見(jiàn)圖5）。證明引物特異性好，可進(jìn)行后續(xù)Real time PCR反應(yīng)。

2.3擴(kuò)增曲線和溶解曲線分析

Real time PCR結(jié)果表明，目的基因和內(nèi)參基因溶解曲線良好，峰值清晰且單一（見(jiàn)圖6），每個(gè)組織樣中擴(kuò)增曲線基本一致（見(jiàn)圖7）。說(shuō)明擴(kuò)增過(guò)程無(wú)非特異性產(chǎn)物，結(jié)果可定量分析。

2.4組織表達(dá)譜

豬miR-101肝臟組織中表達(dá)量最高，肺臟、背肌、腿肌、胰臟組織中表達(dá)量次之，膀胱、脂肪、皮膚組織中表達(dá)量較低，其他組織幾乎不表達(dá)（見(jiàn)圖8）。

圖3　豬miR-101PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification result of porcine miR-101

圖4　豬miR-101克隆載體酶切鑒定Fig.4 Enzyme identification of porcine miR-101 cloning vector by double digestion

圖5　豬miR-101測(cè)序比對(duì)結(jié)果Fig.5 Sequence alignment result of porcine miR-101

圖6　內(nèi)參基因U6與豬miR-101溶解曲線Fig.6 Melt curve of U6 gene and porcine miR-101

圖7　內(nèi)參基因U6與豬miR-101擴(kuò)增曲線Fig.7 Amplification plot of U6 gene and porcine miR-101

圖8　豬miR-101組織表達(dá)譜Fig.8 Tissues expression profile of porcine miR-101

2.5誘導(dǎo)表達(dá)譜

添加濃度為10μg·mL-1poly（I:C）可明顯抑制豬miR-101表達(dá)，當(dāng)poly（I:C）添加濃度為1和5μg· mL-1時(shí)，豬miR-101表達(dá)幾乎不受影響（見(jiàn)圖9）。

圖9　豬miR-101的poly(I:C)誘導(dǎo)表達(dá)譜Fig.9 Inducible-expression of porcine miR-101 with poly(I:C)

3　討論與結(jié)論

傳統(tǒng)防治方法（免疫、藥物治療和撲殺等）無(wú)法杜絕傳染性疾病發(fā)生和流行。畜禽產(chǎn)品藥物殘留問(wèn)題受到廣泛關(guān)注。闡明傳染性疾病發(fā)生分子機(jī)理，通過(guò)分子育種手段培育抗病品種（品系）、從本質(zhì)上提高豬疾病抵抗力，是解決問(wèn)題根本途徑。

分子抗病育種關(guān)鍵是確定候選基因、調(diào)控因子。miRNA是生命科學(xué)研究熱點(diǎn)。哺乳動(dòng)物中，miRNA與靶mRNA不完全互補(bǔ)可在翻譯水平上抑制靶基因表達(dá)，調(diào)控生命活動(dòng)，包括微生物入侵和疾病發(fā)生[11-12]。已有研究表明，miR-101與疾病抗性/易感性相關(guān)，在人類(lèi)腫瘤發(fā)生和病毒入侵中發(fā)揮重要作用[5-10,13]。本研究以miR-101作豬抗病候選miRNA，分析其在抗病毒免疫反應(yīng)中潛在作用。

民豬為研究對(duì)象，利用熒光定量PCR方法檢測(cè)miR-101在15個(gè)組織中相對(duì)表達(dá)情況，成功構(gòu)建豬miR-101組織表達(dá)譜。試驗(yàn)中利用內(nèi)參U6基因消除總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄效率造成差異，校正表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果，保證結(jié)果可靠性。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-101在豬肝臟組織中相對(duì)表達(dá)量最高，在其他組織中相對(duì)表達(dá)量較低甚至不表達(dá)。Zhang和Hou研究表明，miR-101在人類(lèi)肝臟組織中相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他組織[14-15]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。肝臟對(duì)來(lái)自體內(nèi)、外非營(yíng)養(yǎng)性物質(zhì)（如藥物、毒物等）和代謝產(chǎn)物具有生物轉(zhuǎn)化功能，是動(dòng)物體內(nèi)重要解毒器官，而miR-101在豬肝臟組織中高表達(dá)說(shuō)明其在機(jī)體免疫方面有重要作用。民豬是我國(guó)優(yōu)良地方豬種，抗逆性強(qiáng)，本研究揭示miR-101民豬表達(dá)情況，為揭示其在民豬高抗逆性中作用提供依據(jù)。

Zheng等研究表明miR-101在機(jī)體抗病毒免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，在HeLa細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-101能顯著抑制單純皰疹病毒1（Herpes simplex vi?rus1,HSV-1）復(fù)制，阻斷內(nèi)源性miR-101表達(dá)促進(jìn)病毒粒子增殖[13]。人類(lèi)miR-101還能通過(guò)靶向調(diào)控甲基化轉(zhuǎn)移酶3A，抑制人卵巢癌與乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移[16-17]。因此推測(cè)miR-101在豬抗病毒感染中具有一定作用。本研究利用病毒類(lèi)似物poly（I:C）模擬病毒，刺激體外培養(yǎng)PK15細(xì)胞。poly（I:C）是人工合成雙鏈RNA（Double-stranded RNA,dsRNA），大多數(shù)病毒（包括DNA病毒和單股正鏈RNA病毒）在體內(nèi)復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生dsRNA，并以其作為病原相關(guān)分子模式，將入侵信號(hào)向下游傳遞。Weber等研究表明，poly（I:C）能有效模擬病毒入侵產(chǎn)生生物信號(hào)，引起機(jī)體抗病毒免疫反應(yīng)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)poly（I:C）能抑制miR-101表達(dá)，說(shuō)明豬miR-101參與機(jī)體抗病毒免疫反應(yīng)。

綜上，本研究成功建立豬miR-101的stemloop RT-PCR檢測(cè)方法，并繪制組織表達(dá)譜與poly（I:C）誘導(dǎo)表達(dá)譜，確定豬miR-101在肝臟組織中表達(dá)量最高，10μg·mL-1poly（I:C）可明顯抑制其表達(dá)。研究為深入分析miR-101在豬抗病毒免疫中作用奠定基礎(chǔ)，為豬分子抗病育種提供具有潛在應(yīng)用價(jià)值的基因素材。

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Characterization of expression profile of miR-101 in pig/YANG Xiuqin,WAN

Hongyu,WANG Jinkui,HAN Lixin,DU Xin,ZHUO Jianshu
(School of Animal Science and Technology, Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

miRNA are a kind of endogenous,single-stranded,noncoding small molecule RNA with 20-25 nt long,and participate in multiple activities through regulating gene expression post-transcriptionally. Human miR-101 was an important disease-related miRNA involved in health maintaining and disease defense.So far,few researches were reported on porcine miR-101.To determine its function in porcine antiviral immune response,this study was designed to construct tissue and poly(I:C)-induced expression profile of porcine miR-101 using stem-loop RT-PCR method.The results showed that miR-101 expressed with the highest abundance in liver,and the transcription was inhibited effectively by high concentration of poly(I:C).The data provided foundation not only for further explanation of the role of miR-101 in porcine antiviral immune response,but also for breeding pigs with high resistance against diseases.

porcine;miR-101;poly(I:C);stem-loop RT-PCR;expression

S828

A

1005-9369（2016）06-0074-07

2016-01-18

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31072007）；黑龍江省留學(xué)歸國(guó)科學(xué)基金項(xiàng)目（LC201412）

楊秀芹（1971-），女，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樨i分子遺傳與育種。E-mail:xiuqin163@163.com