楊洪升，李富恒，王長(zhǎng)寶，戚曉利，羅志文，李修平，張衛(wèi)東（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030；.佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江佳木斯154007）

珍稀瀕危植物黃檗種群遺傳多樣性ISSR分析

楊洪升1,2，李富恒1*，王長(zhǎng)寶2，戚曉利2，羅志文2，李修平2，張衛(wèi)東2
（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030；2.佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江佳木斯154007）

利用ISSR分子標(biāo)記對(duì)黃檗17個(gè)自然種群作遺傳多樣性分析，8條引物共擴(kuò)增出81條帶，其中61條具有多態(tài)性。結(jié)果表明，在物種水平上多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPL）為75.31%，Shannon多樣性指數(shù)（I）為0.3045，Nei's基因多樣性指數(shù)（H）為0.2788。在種群水平上PPL為43.87%，I為0.2243，H為0.2628，種群間遺傳分化系數(shù)Gst為0.2065，基因流Nm為1.9213。AMOVA分析表明，種群間遺傳分化水平Fst為0.2235，黃檗遺傳變異主要存在于種群內(nèi)（77.65%）。Mantel檢驗(yàn)表明，黃檗種群間地理距離與遺傳距離間存在極顯著正相關(guān)關(guān)系（R=0.789，P<0.01）。UPGMA聚類(lèi)分析將17個(gè)黃檗種群分為兩大類(lèi)：華北種群組和東北種群組，地理較近種群有聚集趨勢(shì)。推測(cè)長(zhǎng)白山地區(qū)為黃檗現(xiàn)代遺傳多樣性分布中心。

黃檗；遺傳多樣性；遺傳分化；ISSR；保護(hù)策略

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間2016-6-17 15:21:46[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160617.1521.004.htm l

楊洪升,李富恒,王長(zhǎng)寶,等.珍稀瀕危植物黃檗種群遺傳多樣性ISSR分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,47(6):26-32.

Yang Hongsheng,Li Fuheng,Wang Changbao,et al.ISSR analysis on genetic diversity in natural populations of rare and endangered species Phellodendron amurense[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(6):26-32.(in Chinese with English abstract)

黃檗（Phellodendron amurense Rupr.）又稱(chēng)黃菠蘿、黃柏，是蕓香科（Rutaceae）黃檗屬（Phelloden?dron）第三紀(jì)古熱帶植物區(qū)系孑遺植物。國(guó)內(nèi)主要分布在東北小興安嶺、長(zhǎng)白山、張廣才嶺、完達(dá)山、老爺嶺及華北燕山等地，國(guó)外分布于俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)、朝鮮和日本[1]。

黃檗作為我國(guó)東北闊葉紅松林重要伴生喬木，三大硬闊樹(shù)種之一，既是珍貴用材樹(shù)種，也是我國(guó)傳統(tǒng)中藥黃柏藥源植物。由于長(zhǎng)期不合理藥材采收及過(guò)量林木采伐，野生黃檗資源急劇減少，已被列入國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物名錄[2]。目前對(duì)黃檗研究主要集中在種群結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分含量、藥理作用和更新繁殖等方面[3-6]。在黃檗遺傳多樣性研究方面，閆志峰等對(duì)10個(gè)野生黃檗種群作AFLP分析，認(rèn)為黃檗物種水平遺傳多樣性高于其種群水平遺傳變異[7]。李紹臣等利用ISSR分子標(biāo)記吉林省10個(gè)黃檗種群作遺傳多樣性分析，結(jié)果表明黃檗種群間存在明顯分化[8]，由于所用分子標(biāo)記及采樣策略局限，未能全面揭示黃檗物種水平上遺傳多樣性和分布格局。

簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間多態(tài)性（ISSR）是新型分子標(biāo)記技術(shù)，綜合其他分子標(biāo)記技術(shù)特點(diǎn)[9]，具有操作簡(jiǎn)單、所需DNA量少、多態(tài)性高、重復(fù)性好、不需預(yù)知研究對(duì)象的基因組序列等優(yōu)點(diǎn)，已被成功應(yīng)用于多種植物遺傳多樣性研究，并取得較好效果[10-13]。本研究采用ISSR分子標(biāo)記，在分布區(qū)代表性山脈采樣基礎(chǔ)上，從核基因角度揭示野生黃檗種群遺傳多樣性，為合理開(kāi)發(fā)利用黃檗資源及制定保護(hù)策略提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

選取小興安嶺、長(zhǎng)白山、張廣才嶺、完達(dá)山、老爺嶺以及燕山等山脈17個(gè)野生種群，每個(gè)種群采集20~24個(gè)植株，為避免重復(fù)取樣，植株間至少相隔50m，對(duì)每株樣樹(shù)胸徑、樹(shù)高、生境記錄、拍照，并做好標(biāo)記，每個(gè)植株采摘其健康幼嫩葉片8~10片，置于裝有硅膠塑料自封袋迅速干燥，帶回實(shí)驗(yàn)室于-20℃冰箱保存，用于DNA提取。采樣地點(diǎn)種群編號(hào)、經(jīng)緯度、海拔高度及每個(gè)種群所采集樣本數(shù)量，采樣種群地理位置分布見(jiàn)圖1。

圖1　黃檗樣品采集分布Fig.1 Sampled populations distribution of Phellodendron amurense

1.2DNA提取和PCR擴(kuò)增

采用改良CTAB法[14]，從硅膠干燥后黃檗葉片中提取總DNA。分光光度計(jì)測(cè)定OD260和OD280，確定基因組DNA濃度和純度后，稀釋至40 ng·μL-1于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。擴(kuò)增反應(yīng)在Eppendorf梯度PCR儀上進(jìn)行，通過(guò)優(yōu)化設(shè)計(jì)適合黃檗ISSRPCR最佳反應(yīng)體系，最終確定為20μL反應(yīng)體系，包括：ddH2O 13μL，10×Buffer 2μL，25mmol·L-1MgCl21.6μL，10 mmol·L-1dNTPs 0.4μL，10 μmol·L-1引物0.8μL，5 U·μL-1Taq DNA聚合酶0.2μL，40 ng·μL-1模板DNA 2μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min；35個(gè)循環(huán)：94℃變性30 s，退火45 s，72℃延伸2min；最后72℃延伸8min，4℃保存。PCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖膠（含有0.5μg·mL-1EB）中電泳，電泳緩沖液為0.5× TBE，以DL2000Marker（TaKaRa，寶生物工程大連有限公司）為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，5 V·cm-1穩(wěn)定電壓條件下電泳2 h，電泳后用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3引物篩選

本研究所用ISSR引物根據(jù)加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）公布第9套ISSR引物序列（100條）進(jìn)行特異性篩選，由上海生工生物工程股份有限公司合成。隨機(jī)從12個(gè)種群中各選取1個(gè)個(gè)體，20μL反應(yīng)體系擴(kuò)增篩選。最終篩選出8條重復(fù)性好、擴(kuò)增條帶清晰且具有多態(tài)位點(diǎn)引物用于個(gè)體擴(kuò)增。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

由于ISSR是顯性標(biāo)記，在相同電泳遷移位置條帶具有同源性。ISSR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖譜中，有帶記作“1”，無(wú)帶或者弱帶記作“0”，建立“0，1”二元數(shù)據(jù)矩陣，將二元數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)。采用軟件POPGENE 1.32在假定這些ISSR標(biāo)記處于Hardy-Weinberg平衡條件下作遺傳參數(shù)分析。分別計(jì)算：多態(tài)位點(diǎn)百分率PPL（Proportion of polymor?phic loci）、有效等位基因數(shù)Ne（Effective number of alleles）、Nei's基因多樣性指數(shù)H（Nei's gene diver?sity）、Shannon信息指數(shù)I（Shannon information in?dex）、群體總基因多樣度Ht（Total gene diversity）、群體內(nèi)基因多樣度HS（Geniediversity within popula?tion）以及Nei's遺傳距離D。群體間Nei's遺傳分化系數(shù)Gst（Coefficient of genetic differentiation）由公式1-HS/Ht算得，基因流Nm（Gene flow）由公式（1-Gst）/ 4Gst算得。AMOVA 1.55軟件作分子方差分析，計(jì)算種群內(nèi)、種群間變異方差分布。采用GenALEX 6.5進(jìn)行Mantel檢測(cè)，檢測(cè)種群間地理距離與遺傳距離相關(guān)關(guān)系。用MEGA 5.0軟件，采用Nei's（1972）計(jì)算遺傳距離，作種群間UPGMA（非加權(quán)配對(duì)算數(shù)平均法）聚類(lèi)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1遺傳多樣性

利用8個(gè)ISSR引物對(duì)17個(gè)黃檗自然種群共398份樣品作遺傳多樣性分析，每個(gè)引物均能擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定條帶，其中引物UBC 827對(duì)桓仁（HR）種群24個(gè)個(gè)體DNA樣品擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。8個(gè)引物共擴(kuò)增出81條

清晰可重復(fù)條帶，其中多態(tài)性條帶61條，每條引物擴(kuò)增出總帶數(shù)范圍從9（UBC827和UBC836）到12條（UBC818）不等，平均每個(gè)引物擴(kuò)增條帶數(shù)為10.1（見(jiàn)表1），所得片段大小分布在200~2 500 bp。

分析結(jié)果表明（見(jiàn)表2），在物種水平上，黃檗多態(tài)位點(diǎn)百分率為75.31%，顯示較高遺傳多樣性水平，平均每個(gè)位點(diǎn)有效等位基因數(shù)為1.7382，Nei's基因多樣性指數(shù)為0.2788，Shannon多樣性指數(shù)為0.3045。

圖2　UBC827引物對(duì)桓仁種群擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 ISSR bands amplified with primer UBC827 from Huanren population

表1　ISSR引物及其擴(kuò)增結(jié)果Table1 ISSR primers and their polymorphisms of amplified bands

表2　黃檗取樣種群信息及基于ISSR標(biāo)記遺傳多樣性指數(shù)Table 2 Sampling details of P.amurense and genetic diversity based on ISSR marker

由表2可知，黃檗種群內(nèi)多態(tài)性位點(diǎn)百分率23.23%~69.52%，平均43.87%，各種群多態(tài)性百分率差異較大，其中WQ種群多態(tài)位點(diǎn)百分率最高69.52%；BJ種群多態(tài)位點(diǎn)百分率最低23.23%。每個(gè)位點(diǎn)平均有效等位基因數(shù)（Ne）為1.3244，種群Nei's基因多樣性指數(shù)在0.1152~0.2792，平均值0.2243；Shannon多樣性指數(shù)0.1500~0.4178，平均值0.2628，且H和I較高值均出現(xiàn)在長(zhǎng)白山WQ、WC和JH種群，較低值出現(xiàn)在BJ、HN和QL種群，兩者大小與種群多態(tài)位點(diǎn)百分率趨勢(shì)基本一致。

2.2黃檗種群間遺傳變異

種群遺傳變異AMOVA分析顯示（見(jiàn)表3），黃檗種群間遺傳分化系數(shù)Fst為0.2235，即在總遺傳變異中有77.65%變異存在于種群內(nèi)，種群內(nèi)遺傳變異比種群間遺傳變異高，且種群內(nèi)和種群間差異均極顯著（P<0.001）。通過(guò)POPGENE分析，在物種水平上黃檗17個(gè)群體基因多樣度（Ht）為0.2788，種群內(nèi)基因多樣度（Hs）為0.2212，種群間基因多樣度Dst為0.0576，種群間遺傳分化系數(shù)Gst為0.2065，顯示總遺傳變異中有79.35%來(lái)自種群內(nèi)，20.65%來(lái)自種群間，遺傳變異主要存在于種群內(nèi)。由此可見(jiàn)，AMOVA和POPGENE分析結(jié)果基本一致，均表明種群內(nèi)遺傳分化大于種群間遺傳分化。種群間基因流（Nm）估測(cè)值為1.9213，表明種群間基因流處于較高水平，有利于種群間基因交流。

表3　17個(gè)黃檗種群分子方差分析Tab le3 AMOVA analyses of P.amurense from 17 populations

2.3種群間遺傳距離及其聚類(lèi)

POPGENE軟件計(jì)算黃檗17個(gè)種群間Nei's遺傳距離介于0.036與0.304之間。其中伊春（YC）種群與湯旺河（TWH）種群遺傳距離最小，為0.036；林口（LK）種群與北京（BJ）種群遺傳距離最大，為0.304。根據(jù)黃檗種群間遺傳距離，運(yùn)用MEGA軟件采用算術(shù)平均數(shù)非加權(quán)成組配對(duì)法（UPGMA），對(duì)17個(gè)種群聚類(lèi)分析，UPGMA聚類(lèi)分析結(jié)果表明（見(jiàn)圖3）。

17個(gè)黃檗種群主要分為兩大類(lèi)群：華北種群組和東北種群組。華北種群組包括北京（BJ）種群和青龍（QL）種群；東北種群組包括其余15個(gè)種群，其中長(zhǎng)白山6個(gè)種群與老爺嶺1個(gè)種群聚成1組，小興安嶺3個(gè)種群與張廣才嶺2個(gè)種群聚成1組，完達(dá)山2個(gè)種群?jiǎn)为?dú)聚成1組，3組聚成1個(gè)大類(lèi)群，與其地理分布格局大致吻合。Mantel檢驗(yàn)表明，黃檗各種群間遺傳距離與地理距離存在正相關(guān)關(guān)系，且相關(guān)性極顯著（R=0.789，P<0.01），表明地理距離越近種群，其遺傳距離也越近；反之越遠(yuǎn)。

圖3　17個(gè)黃檗種群間基于Nei's遺傳距離UPGMA聚類(lèi)結(jié)果Fig.3 UPGMA result for 17 sampled populations of P.amurense based on Nei'sgenetic distance

3　討論與結(jié)論

3.1遺傳多樣性

遺傳多樣性是生物攜帶遺傳信息總和，是長(zhǎng)期進(jìn)化產(chǎn)物，也是其生存、發(fā)展和進(jìn)化基礎(chǔ)[15]。在評(píng)價(jià)種群遺傳多樣性參數(shù)中，多態(tài)位點(diǎn)百分率、Shannon信息指數(shù)和Nei's基因多樣性指數(shù)是衡量種群遺傳多樣性主要指標(biāo)。本研究所用ISSR反應(yīng)體系具有良好穩(wěn)定性和可重復(fù)性，應(yīng)用該分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)篩選出的8個(gè)引物PCR擴(kuò)增，得出平均多態(tài)位點(diǎn)數(shù)7.6個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)百分率75.31%，Shannon多樣性指數(shù)0.3045，Nei's基因多樣性指數(shù)0.2788。與其他采用ISSR分子標(biāo)記檢測(cè)的東北地區(qū)常見(jiàn)溫帶闊葉落葉樹(shù)種蒙古櫟[16]、胡桃楸[17]和紫椴[18]一致，表現(xiàn)出較高水平遺傳多樣性。本研究結(jié)果與閆志峰等采用AFLP分子標(biāo)記對(duì)10個(gè)黃檗代表種群遺傳多致性研究結(jié)果基本一致（PPL=92.77%；H= 0.2316；I=0.4275）[7]，但比李紹臣等采用ISSR分子標(biāo)記對(duì)局部區(qū)域黃檗遺傳多樣性要高[8]，原因是本研究從黃檗自然分布大范圍取樣，基本覆蓋黃檗在我國(guó)的自然分布區(qū)域。

黃檗具有較高遺傳多樣性可能與其繁育系統(tǒng)和生活史有關(guān)。黃檗屬多年生落葉喬木，雌雄異株、蟲(chóng)媒傳粉，這種異交繁育系統(tǒng)被認(rèn)為是物種維持較高遺傳多樣性水平重要因素[19]。此外，黃檗具有較大分布范圍、長(zhǎng)命生活史及良好生態(tài)適應(yīng)性[20]，也有利于維持一定遺傳多樣性水平。不同黃檗種群遺傳多樣性差異顯著（見(jiàn)表1），長(zhǎng)白山地區(qū)野生資源分布集中，遺傳多樣性水平相對(duì)較高，由此推測(cè)長(zhǎng)白山地區(qū)是黃檗遺傳多樣性分布中心。

3.2遺傳分化

黃檗種群間Nei's基因分化系數(shù)Gst=0.2065，表明其遺傳變異主要存在于種群內(nèi)，即種群間遺傳分化較小。AMOVA分析也顯示，黃檗遺傳變異中22.35%發(fā)生在種群間，77.65%發(fā)生在種群內(nèi)。如前所述，黃檗生殖方式是有性生殖，主要傳粉方式是蟲(chóng)媒，主要靠食果鳥(niǎo)類(lèi)進(jìn)行較遠(yuǎn)距離種子傳播[6]，這種傳粉方式及種子傳播方式有利于種群間基因流發(fā)生，可防止種群間遺傳分化。根據(jù)Gst值，推算黃檗種群間基因流Nm=1.9213，表明黃檗種群間存在較強(qiáng)基因流，當(dāng)Nm>1時(shí)，一定程度上可抵消種群間因遺傳漂變而引起的遺傳分化[21]，這也是黃檗種群間遺傳分化小，遺傳變異主要存在于種群內(nèi)原因之一。經(jīng)Mantel檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)遺傳和地理距離呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明地理隔離對(duì)黃檗種群遺傳分化影響顯著。根據(jù)UPGMA聚類(lèi)結(jié)果表明，地理距離較近種群有聚集趨勢(shì)，17個(gè)黃檗種群可分為兩大類(lèi)群即華北種群與東北種群，可能是由于兩大類(lèi)群地理距離較遠(yuǎn)，影響兩者基因交流，長(zhǎng)期自然選擇進(jìn)而導(dǎo)致遺傳分化。

3.3保護(hù)策略

了解物種遺傳多樣性及其遺傳分化可為制定珍稀瀕危物種保護(hù)策略及栽培利用措施提供重要信息[19]。本研究發(fā)現(xiàn)黃檗物種水平上具有較高遺傳多樣性，遺傳多樣性主要存在于種群內(nèi)。因此，黃檗野生種群仍具有較高適應(yīng)能力和進(jìn)化潛力。但若不能有效阻止生境惡化及人為破壞，將加速黃檗種群片斷化，種群規(guī)模進(jìn)一步減小，引起種群遺傳漂變發(fā)生，導(dǎo)致當(dāng)前豐富遺傳多樣性大量喪失，影響該物種生存及可利用優(yōu)質(zhì)資源喪失。因此，基于黃檗遺傳多樣性及種群生存現(xiàn)狀，建議采取以下保護(hù)措施：

①應(yīng)盡快建立黃檗專(zhuān)門(mén)保護(hù)區(qū)，同時(shí)重視黃檗棲息地以及周?chē)h(huán)境保護(hù)，加強(qiáng)宣傳力度，禁止亂砍亂伐，保護(hù)盡可能多的遺傳變異。

②在加強(qiáng)對(duì)現(xiàn)有種群保護(hù)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步加強(qiáng)黃檗繁殖生物學(xué)研究，由于黃檗果實(shí)粘度大，果皮腐爛速度慢，種子具有胚生理后熟特點(diǎn)，在自然環(huán)境下種子發(fā)芽率較低，因此有必要建立人工繁育基地以提高種子繁育率和幼苗成活率，擴(kuò)大黃檗種群規(guī)模。

③華北種群和東北種群作為兩個(gè)獨(dú)立單元保護(hù)，尤其注意優(yōu)先保護(hù)遺傳多樣性較高種群（WQ、WC、HD、JH）和遺傳多樣性較低種群（BJ、QL、HN）。

④考慮黃檗遺傳變異主要來(lái)自于種群內(nèi)，因此遷地保護(hù)時(shí)，需盡可能在所有種群內(nèi)采樣，保存遺傳資源。

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ISSR analysis on genetic diversity in natural populations of rare and endangered species Phellodendron amurense/YANG Hongsheng1,2,LI Fuheng1,

WANG Changbao2,QI Xiaoli2,LUO Zhiwen2,LI Xiuping2,ZHANG Weidong2
(1.School of Life Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.School of Life Science, Jiamusi University,Jiamusi Heilongjiang 154007,China)

Genetic diversity of 17 natural populations of Phellodendron amurense was assessed by the Inter-Simple Sequence Repeat(ISSR)technique,using eight specific and stable primers,a total of 81 loci were identified,61 of which were polymorphic.The results showed that at the species level,total percentage of polymorphic loci(PPL)was 75.31%,and Shannon's information index(I)and Nei's gene diversity(H) were 0.3045 and 0.2788,respectively.At the population level,the mean value of P,I and H were 43.87%, 0.2243 and 0.2628,respectively.The genetic differentiation coefficient(Gst)among populations was 0.2065, and the value of gene flow(Nm)inferred from Gst was 1.9213.Analysis of molecular variance(AMOVA)demonstrated that most variance occurred within populations,while the variance among populations accounted for 22.35%(Fst=0.2235).Mantel test results showed a significant positive correlation between genetic distance and geographic distance among all populations(R=0.789,P<0.01).Total 17 populations were clustered into two groups by the UPGMA analysis including the North China group and the Northeast China group.Moreover,results of UPGMA clustering analysis showed that the populations tend to cluster together were nearer in geographical distance.The Changbai Mountain may be modern center of genetic diversity for P.amurense.

Phellodendron amurense；genetic diversity；genetic differentiation；ISSR；protection strategy圖1黃檗樣品采集分布

S792.31

A

1005-9369（2016）06-0026-07

2016-03-17

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81441132）；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（12541808）；佳木斯大學(xué)青年基金項(xiàng)目（Sq2013-026）

楊洪升（1979-），男，講師，博士研究生，研究方向?yàn)橹参镔Y源學(xué)與分子生態(tài)學(xué)。E-mail:yhongsheng@126.com

李富恒，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参锷砩-mail:lifuheng1963@126.com